不同稀酸制備革蘭氏陽性增強(qiáng)基質(zhì)(GEM)顆粒的比較

李鵬成， 張曉燕, 2， 喬緒穩(wěn)， 鄭其升， 侯繼波

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所，國家獸用生物制品工程研究中心，江蘇 南京 210014； 2. 山西運(yùn)城農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 運(yùn)城 044000)

有研究基于革蘭氏陽性細(xì)菌乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)形成的非活性食品級外殼顆粒，研制了一種抗原展示系統(tǒng)[1]，即乳酸乳球菌外殼-蛋白錨定系統(tǒng)[2-3]。這種外殼顆粒被稱之為革蘭氏陽性增強(qiáng)基質(zhì)(GEM)顆粒，其實(shí)就是細(xì)菌去除蛋白、核酸等物質(zhì)后的一種球形肽聚糖基質(zhì)骨架。GEM抗原展示系統(tǒng)，由食品級遺傳元件組成，十分安全。此外，該系統(tǒng)不需要對抗原進(jìn)行純化，極大降低了制造成本，并可用于多種非蛋白源和蛋白源的抗原展示，是一種優(yōu)異的抗原載運(yùn)系統(tǒng)。目前，通過該系統(tǒng)研制的抗原在多個(gè)動物疾病模型中能夠有效地激發(fā)機(jī)體的免疫保護(hù)，成功展示的有：肺炎鏈球菌保護(hù)性抗原SlrA[2]、瘧原蟲的保護(hù)性抗原MSA2[4]和鼠疫耶爾森菌保護(hù)性抗原LcrV[5]等。

GEM顆粒作為GEM抗原展示系統(tǒng)的重要組成部分，其質(zhì)量直接影響抗原的展示效率。關(guān)于GEM的制備，國內(nèi)外未見深入報(bào)道。本研究擬通過比較不同稀酸處理制備GEM顆粒的效果，優(yōu)化GEM顆粒的制備條件，主要對不同濃度的同種稀酸以及不同稀酸處理制備GEM顆粒的得率(計(jì)數(shù))、蛋白去除率(SDS-PAGE)、與錨鉤蛋白(PA)的親和活性(SDS-PAGE)進(jìn)行比較。此外，本試驗(yàn)還擬對GEM顆粒4 ℃下的保存期和冷凍干燥后的保存期進(jìn)行研究，以期為完善乳酸乳球菌外殼-蛋白錨定系統(tǒng)，尤其是制備高質(zhì)量的GEM顆粒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 乳酸乳球菌MG1363由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 GM17液體培養(yǎng)基(葡萄糖5.00 g/L、植物蛋白胨5.00 g/L、聚蛋白胨5.00 g/L、牛肉膏2.50 g/L、酵母粉2.50 g/L、β-磷酸甘油二鈉19.00 g/L、抗壞血酸0.50 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L，加雙蒸水至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.1，115 ℃高壓滅菌備用)、鹽酸(HCl)、硫酸(H2SO4)、三氯乙酸(TCA)均購自國藥集團(tuán)，戊二醛、丙稀酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘氨酸、過硫酸銨均購自南京生興生物技術(shù)有限公司，蛋白分子量Marker購自Thermo Scientific公司，BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，YK-HELBER細(xì)菌計(jì)數(shù)板購自北京卓川電子科技有限公司，錨鉤蛋白(PA)由本實(shí)驗(yàn)室克隆表達(dá)獲得。

1.2 乳酸乳球菌MG1363培養(yǎng)

乳酸乳球菌MG1363劃線接種GM17平板，30 ℃培養(yǎng) 16～20 h，挑取單菌落接種新鮮GM17培養(yǎng)基，30 ℃靜止培養(yǎng) 16～20 h，備用。

1.3 不同稀酸處理制備GEM顆粒

新鮮擴(kuò)大培養(yǎng)的乳酸乳球菌MG1363，12 000 r/min離心10 min，室溫?zé)o菌離心，收集菌體，滅菌純水洗滌1遍，然后用1/5體積0.200 0 mol/L、0.100 0 mol/L、0.050 0 mol/L、0.025 0 mol/L的HCl(pH=1)，1.200 0 mol/L、0.600 0 mol/L、0.300 0 mol/L、0.015 0 mol/L的TCA(pH=1)，0.100 0 mol/L、0.050 0 mol/L、0.025 0 mol/L、0.012 5 mol/L的H2SO4重懸(pH=1)，煮沸30 min，離心去酸液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，最后一次用1/10體積的PBS重懸計(jì)數(shù)，2.5×109個(gè)顆粒為1 U。

1.4 GEM顆粒蛋白質(zhì)去除效率

將不同稀酸處理的GEM顆粒調(diào)整至同一基數(shù)，經(jīng)SDS-PAGE定性分析。同時(shí)定量分析比較不同稀酸處理得到的GEM顆粒蛋白質(zhì)去除效率，分別收集不同稀酸煮沸的上清液，12 000 r/min離心3 min，熱酸處理后上清液的pH調(diào)至7左右，用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定分析。

1.5 不同稀酸制備的GEM與PA錨定活性

為了對結(jié)合蛋白進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定量分析，首先，分別將1 U的GEM顆粒和過量的PA在室溫下孵育30 min，12 000 r/min離心5 min，收集沉淀，PBS洗滌2次，然后用10%的SDS高溫煮沸結(jié)合后的沉淀，使蛋白從顆粒上解離下來，離心收集上清液進(jìn)行定量分析。具體方法如下：取結(jié)合后的懸浮液200 μl，加750 μl PBS，50 μl 10% SDS，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，分離沉淀和上清液，取上清液用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)用1 ml PBS重懸沉淀，取重懸沉淀和解離上清液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.6 GEM透射電鏡觀察

對制備好的GEM顆粒進(jìn)行離心并收集，3 000 r/min離心5 min，棄上清液后加入含2.5%戊二醛的PBS(0.1 mol/L，pH=7.2)，4 ℃固定2 h，PBS漂洗3次，每次10 min，依次以30.0%、50.0%、75.0%、95.0%的乙醇脫水1次，1次10 min，然后以無水乙醇重復(fù)脫水2次，1次10 min，再用50.0%、70.0%、90.0%、100.0%的乙酸異戊酯逐級取代乙醇，每級置換2 min。二甲苯透明，將GEM顆粒完全浸沒于盛有二甲苯的帶蓋小瓶中，1∶1(體積比)浸透，環(huán)氧樹脂Epon812浸蠟，將浸好的透明GEM顆粒放入盛有環(huán)氧樹脂Epon812的容器中20 min，環(huán)氧樹脂Epon812包埋，將浸好蠟的GEM顆粒放于盛有環(huán)氧樹脂Epon812的包埋器中，注入包埋劑，將組織塊完全浸沒，再將包埋器置于37 ℃溫箱中24 h，超薄切片，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染，最后在Model S-3000N型透射顯微鏡下觀察，拍照。

1.7 GEM顆粒4 ℃保存期試驗(yàn)

分別對4 ℃下保存0個(gè)月、2個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月、15個(gè)月、18個(gè)月的GEM顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)，比較不同保存時(shí)間下GEM的顆粒數(shù)，同時(shí)比較不同樣品的錨定活性。

1.8 真空冷凍干燥對GEM顆粒錨定活性的影響

真空冷凍干燥GEM顆粒，觀察其外觀形態(tài)，拍照。同時(shí)，將凍干樣品直接加入到PA溶液中，室溫孵育30 min，通過SDS-PAGE分析檢驗(yàn)冷凍干燥對GEM顆粒錨定活性的影響。

此外，本試驗(yàn)將冷凍干燥后的GEM顆粒置于37 ℃下進(jìn)行耐老化試驗(yàn)，通過其蛋白錨定活性來監(jiān)測冷凍干燥后GEM顆粒的保存期。

1.9 數(shù)據(jù)分析

GEM顆粒得率=(GEM顆粒數(shù)/原細(xì)菌數(shù))×100%。數(shù)據(jù)采用SPSS(16.0)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，差異顯著性檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稀酸處理GEM顆粒沉降出現(xiàn)的時(shí)間

不同稀酸的作用方式不同，不同濃度的同一種稀酸其作用強(qiáng)度也不同，因此，GEM制備過程中不同稀酸及不同濃度的同種稀酸處理，在煮沸過程中GEM顆粒的沉降速度不同，制備后成品懸浮液的澄清度也不同。圖1顯示，清水對照在煮沸細(xì)菌的整個(gè)過程中均未出現(xiàn)沉降，一直處于混懸液狀態(tài)。當(dāng)用稀酸煮沸時(shí)，則出現(xiàn)不同程度的沉降，其中，TCA處理沉降出現(xiàn)的最快，5 min左右出現(xiàn)，HCl處理次之，15 min左右出現(xiàn)沉降，H2SO4處理出現(xiàn)沉降最遲，20 min后才出現(xiàn)。

0：H2O；1：0.05 mol/L硫酸(H2SO4)；2：0.10 mol/L鹽酸(HCl)；3：0.60 mol/L三氯乙酸(TCA)。圖1 不同稀酸制備GEM顆粒的觀察結(jié)果Fig.1 Observation of gram-positive enhancer matrix (GEM) particles prepared with different dilute acids

2.2 不同稀酸處理制備GEM顆粒的SDS-PAGE分析

圖2和圖3顯示，MG1363主要的菌體蛋白質(zhì)位于50 000左右，H2SO4和HCl處理制備的GEM顆粒隨酸濃度的增加，50 000左右的菌體蛋白質(zhì)逐漸減少，蛋白質(zhì)去除效果越來越好。不同濃度TCA處理的蛋白質(zhì)去除效果無明顯差異，而且其蛋白質(zhì)去除效果不及H2SO4處理和HCl處理。不同稀酸處理制備GEM顆粒去除蛋白質(zhì)定量分析結(jié)果與SDS-PAGE分析結(jié)果一致。

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：乳酸乳球菌MG1363；2：H2O處理(CK)；3：0.012 5 mol/L H2SO4處理；4：0.025 0 mol/L H2SO4處理；5：0.050 0 mol/L H2SO4處理；6：0.100 0 mol/L H2SO4處理。圖2 不同濃度H2SO4制備GEM顆粒SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE assay of GEM particles prepared with different concentrations of H2SO4

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：乳酸乳球菌MG1363；2：0.150 mol/L TCA處理；3：0.300 mol/L TCA處理；4：0.600 mol/L TCA處理；5：1.200 mol/L TCA處理；6：0.025 mol/L HCl處理；7：0.050 mol/L HCl處理；8：0.100 mol/L HCl處理；9：0.200 mol/L HCl處理。圖3 不同濃度TCA和HCl制備GEM顆粒SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE assay of GEM particles prepared with different concentrations of TCA and HCl

2.3 不同稀酸處理制備GEM顆粒得率

隨HCl濃度增加，GEM顆粒得率降低，而TCA濃度變化對GEM顆粒得率的影響不明顯。中濃度和低濃度HCl處理的GEM顆粒得率高于H2SO4處理和TCA處理，1 ml菌液最高可以制備約3 U GEM顆粒(表1)。

2.4 不同稀酸制備的GEM與PA錨定的活性

圖4顯示，低濃度H2SO4處理(3泳道)制備的GEM與PA錨定效果不如中濃度處理(4泳道)和高濃度處理(5泳道、6泳道)制備的，中濃度H2SO4處理的GEM與PA錨定效果與高濃度處理的無明顯差異。中濃度H2SO4處理(4泳道)和高濃度H2SO4處理(5泳道、6泳道)制備的GEM與PA錨定效果稍優(yōu)于中濃度HCl處理(7泳道、8泳道)制備的。

低濃度TCA處理(2泳道)制備的GEM與PA錨定效果稍遜于中濃度處理(3泳道)和高濃度處理(4泳道、5泳道)制備的，中濃度處理的GEM與PA錨定效果與高濃度處理的無明顯差異。HCl處理(6～9泳道)制備的GEM與PA錨定效果隨HCl濃度增加逐漸增強(qiáng)。中濃度和高濃度TCA處理制備的GEM與中濃度和高濃度HCl處理制備的GEM與PA錨定活性無明顯差異(圖5)。

表1 不同稀酸制備的GEM顆粒得率

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：錨鉤蛋白PA；2：H2O處理(CK)；3：0.012 5mol/L H2SO4處理；4：0.025 0 mol/L H2SO4處理；5：0.050 0 mol/L H2SO4處理；6：0.100 0 mol/L H2SO4處理；7：0.050 0 mol/L HCl處理；8：0.100 0 mol/L HCl處理。圖4 不同濃度H2SO4和HCl制備的GEM與PA錨定活性的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE assay of the anchoring activity between PA and GEM prepared with different concentrations of H2SO4 and HCl

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：錨鉤蛋白PA；2：0.150 mol/L TCA處理；3：0.300 mol/L TCA處理；4：0.600 mol/L TCA處理；5：1.200 mol/L TCA處理；6：0.025 mol/L HCl處理；7：0.050 mol/L HCl處理；8：0.100 mol/L HCl處理；9：0.200 mol/L HCl處理。圖5 不同濃度TCA和HCl制備的GEM與PA錨定活性的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE assay of the anchoring activity between PA and GEM prepared with different concentrations of TCA and HCl

不同稀酸處理制備的GEM顆粒結(jié)合PA，經(jīng)SDS解離后再經(jīng)BCA蛋白質(zhì)定量檢測，其結(jié)果與SDS-PAGE分析結(jié)果一致。不同濃度H2SO4制備的1 U GEM顆粒結(jié)合PA的蛋白質(zhì)質(zhì)量分別為(128.1±5.7) μg(0.012 5 mol/L H2SO4)、(155.4±6.6) μg(0.025 0 mol/L H2SO4)、(158.3±3.2) μg(0.050 0 mol/L H2SO4)、(157.8±6.4) μg(0.100 0 mol/L H2SO4)，低濃度H2SO4處理制備的GEM結(jié)合PA活性較差，其他濃度處理制備的GEM間無明顯差異。不同濃度TCA制備的1 U GEM顆粒結(jié)合PA的蛋白質(zhì)質(zhì)量分別為(116.4±4.5) μg(0.150 0 mol/L TCA)、(135.7±3.9) μg(0.300 0 mol/L TCA)、(138.3±3.6) μg(0.600 0 mol/L TCA)、(137.2±4.1) μg(1.200 0 mol/L TCA)，低濃度TCA處理制備的GEM結(jié)合PA活性較差，其他濃度處理制備的GEM間無明顯差異。不同濃度HCl制備的1 U GEM顆粒結(jié)合PA的蛋白質(zhì)質(zhì)量隨HCl濃度增加而增加，分別為(97.3±4.9) μg(0.025 0 mol/L HCl)、(125.7±7.2) μg(0.050 0 mol/L HCl)、(134.6±3.8) μg(0.100 0 mol/L HCl)、(137.9±5.3) μg (0.200 0 mol/L HCl)，中濃度和高濃度HCl處理制備的GEM與PA的結(jié)合活性顯著高于低濃度HCl處理制備的(P<0.05)。所有中濃度、高濃度H2SO4、HCl、TCA處理的效果相近，差異不顯著。

2.5 不同稀酸處理制備GEM顆粒電鏡觀察結(jié)果

GEM顆粒電鏡觀察結(jié)果(圖6)顯示，MG1363菌體本身，即細(xì)菌未經(jīng)熱酸煮沸之前，菌體內(nèi)部核區(qū)可見大量的核酸，而且菌體內(nèi)部各種蛋白質(zhì)均有不同程度的負(fù)染著色。MG1363經(jīng)熱酸煮沸后，菌體內(nèi)部著色均一，表明菌體內(nèi)部的核酸及蛋白質(zhì)均已被清除，HCl、H2SO4和TCA處理后的GEM顆粒電鏡形態(tài)無明顯差異。

A：MG1363菌體；B：0.10 mol/L HCl制備的GEM顆粒；C：0.05 mol/L H2SO4制備的GEM顆粒；D：0.60 mol/L TCA制備的GEM顆粒。圖6 GEM顆粒透射電鏡觀察結(jié)果Fig.6 Transmission electron microscope images for GEM particles

2.6 4 ℃下GEM顆粒的保存期

對4 ℃下保存時(shí)間不同的GEM顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)，均無明顯變化。4 ℃下保存不同時(shí)間的GEM顆粒蛋白錨定活性均保持良好，各時(shí)間段的錨定活性無明顯差異(圖7)。

SDS解離后定量分析結(jié)果顯示，保存不同時(shí)間的GEM顆粒結(jié)合PA，SDS解離后經(jīng)BCA蛋白定量檢測，發(fā)現(xiàn)保存0個(gè)月的1 U GEM顆粒結(jié)合(134.6±3.8) μg的PA，保存2個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月、15個(gè)月、18個(gè)月的1 U GEM顆粒結(jié)合PA蛋白質(zhì)質(zhì)量分別為(138.1±5.7) μg、(135.4±6.2) μg、(138.3±3.4) μg、(129.8±6.7) μg、(132.4±4.9) μg，各個(gè)時(shí)間段之間無顯著差異。說明GEM顆粒在4 ℃下至少可以保存18個(gè)月。

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：保存0個(gè)月；2：保存2個(gè)月；3：保存6個(gè)月；4：保存12個(gè)月；5：保存15個(gè)月；6：保存18個(gè)月。圖7 SDS-PAGE分析4 ℃下保存不同時(shí)間GEM顆粒的錨定活性Fig.7 SDS-PAGE assay of the GEM anchoring activity under different stored time

2.7 冷凍干燥對GEM顆粒錨定活性的影響

SDS-PAGE分析結(jié)果(圖8)顯示，冷凍干燥對GEM顆粒的錨定活性沒有影響(冷凍干燥過程中未添加任何保護(hù)劑)。

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：未冷凍干燥的GEM顆粒；2：冷凍干燥后的GEM顆粒。圖8 冷凍干燥對GEM顆粒錨定活性影響的SDS-PAGE分析Fig.8 SDS-PAGE assay of the GEM anchoring activity after freeze-drying

2.8 冷凍干燥GEM顆粒的耐老化

圖9顯示，37 ℃保存15 d的GEM顆粒冷凍干燥樣品的錨定活性與-70 ℃保存樣品無明顯差異。參照冷凍干燥活疫苗37 ℃10 d，可置換為4 ℃ 24個(gè)月的標(biāo)準(zhǔn)，GEM冷凍干燥樣品至少可以保存24個(gè)月。

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，4：PA表達(dá)產(chǎn)物；2：-70 ℃保存GEM+PA；3：-70 ℃保存GEM+PA的上清液；5：37 ℃保存15 d 的GEM+PA；6：37 ℃保存15 d 的GEM+PA上清液。圖9 冷凍干燥GEM顆粒耐老化后的活性鑒定Fig.9 Identification of aging resistance of GEM particles after freeze-drying

3 討 論

乳酸乳球菌GEM顆粒，其本質(zhì)是一種細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖骨架，是經(jīng)過熱酸處理，去除菌體內(nèi)核酸及絕大部分菌體蛋白質(zhì)制備成的無活性的菌體外殼。熱酸處理的主要作用是去除細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)、多糖、脂類和磷壁酸等成分[6]。磷壁酸按其在細(xì)胞表面固定的方式可以分為脂磷壁酸和壁磷壁酸2種。壁磷壁酸不深入質(zhì)膜，其末端以磷酸二酯鍵與肽聚糖的N-乙酰胞壁酸殘基連接。脂磷壁酸可跨越肽聚糖層，其末端以磷酸共價(jià)鍵方式連接于質(zhì)膜中糖脂的寡糖基部分[7-8]。低濃度的HCl和H2SO4水解細(xì)胞壁中的多糖[9-10]，將其煮沸可以水解細(xì)胞中的脂磷壁酸[11]。脂磷壁酸可穿透厚的肽聚糖層，跨越質(zhì)膜，去除磷壁酸相當(dāng)于在細(xì)胞壁上開孔，在保證菌體形態(tài)的同時(shí)，可以使內(nèi)容物流出，從而去除肽聚糖之外的其他雜質(zhì)。

TCA可作為磷壁酸提取劑和蛋白質(zhì)沉淀劑，常用于乳酸菌肽聚糖提純。TCA制備GEM顆粒的得率及錨定活性與其他2種稀酸差異不明顯，但其雜蛋白質(zhì)去除效率差，可能是因?yàn)門CA作為蛋白質(zhì)變性劑使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出更多的疏水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)聚集沉淀[12]。此外，隨著蛋白質(zhì)分子量的增大，TCA可能滲入分子內(nèi)部而使之較難被完全除去。有報(bào)道稱，酸的類型對制備GEM顆粒的影響不大，滅活細(xì)菌溶液的pH維持在1.0才是GEM制備成功與否的關(guān)鍵因素[13]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在pH=1.0時(shí)，HCl與H2SO4制備的GEM顆粒質(zhì)量優(yōu)于TCA。

近年來，GEM抗原載運(yùn)系統(tǒng)已成功用于多種抗原的表面展示，成為疫苗開發(fā)的新型候選系統(tǒng)[1-2, 14-15]。GEM顆粒結(jié)合錨鉤蛋白形成的復(fù)合物，-80 ℃、4 ℃和室溫保存12個(gè)月均不影響錨鉤蛋白活性。無需冷鏈保存是GEM顆粒疫苗的一大優(yōu)勢[13]。本試驗(yàn)對GEM顆粒保存期進(jìn)行研究，GEM顆粒作為一種無活性的菌體外殼，其本質(zhì)就是肽聚糖骨架，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

本研究結(jié)果表明，0.025 mol/L的H2SO4與0.100 mol/L的HCl可制備高質(zhì)量的GEM，二者效果無明顯差異，該結(jié)果為制備高質(zhì)量的GEM顆粒提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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