桃紅四物湯保護(hù)2型糖尿病模型大鼠血管損傷的實(shí)驗(yàn)研究

沈安魯，彭代銀，施 慧， 韓 嵐，戴 榮，王 星

(安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院，安徽 合肥 230012)

糖尿病是由于胰島素分泌和(或)作用缺陷引起的代謝性疾病，其臨床表現(xiàn)不僅以持續(xù)性高血糖為特點(diǎn)，并且還有高血糖所帶來的血管并發(fā)癥的損害。糖尿病血管并發(fā)癥一直備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，是糖尿病主要的慢性并發(fā)癥，更是影響糖尿病患者生存率的重要因素，已成為中國糖尿病致殘率和致死率最高、危害最大的慢性并發(fā)癥[1]。因此，深入研究糖尿病誘發(fā)血管病變的發(fā)病機(jī)制，積極探索有效防治糖尿病血管并發(fā)癥的途徑，對(duì)降低糖尿病的病死率有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)以2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)模型大鼠為研究對(duì)象，觀察桃紅四物湯對(duì)模型大鼠胸主動(dòng)脈損傷的保護(hù)效應(yīng)及對(duì)核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)等炎性因子的干預(yù)作用，探討桃紅四物湯防治糖尿病血管并發(fā)癥的效應(yīng)機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 桃紅四物湯提取液：按原方劑量配制桃紅四物湯(白芍、熟地黃各12 g，當(dāng)歸10 g，桃仁9 g，川芎8 g，紅花6 g)，采用75%乙醇回流提取2次，制成1.8 g/mL提取液，備用；鹽酸吡格列酮(批號(hào) 116001)：中美華東制藥有限公司；鏈脲佐菌素(批號(hào) 20150121544)：Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗鼠NF-κBp65抗體(GR113708-1)：美國Abcam公司；大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)ELISA試劑盒(20160311A)：上海谷研實(shí)業(yè)有限公司；山羊抗兔IgG/HRP：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Trizol：Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：Hermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，共120只，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2011-002]提供。

1.4 主要儀器 全自動(dòng)酶聯(lián)免疫工作站：意大利MAROCHE公司；FCM凝膠成像系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；熒光定量PCR儀：美國Thermo公司；LDZ4型微量離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；強(qiáng)生穩(wěn)步型血糖儀：美國強(qiáng)生公司。

2 方法

2.1 T2DM模型復(fù)制及大鼠分組 大鼠正常喂養(yǎng)1周后，除10只作為正常組外，其余各組大鼠予以高糖高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周，采用鏈脲佐菌素(30 mg/kg)腹腔注射以復(fù)制T2DM模型，正常組給予檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(10 mL/kg)腹腔注射。1周后采用血糖儀測定血糖值，選取隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L的大鼠作為T2DM模型[2]，將模型大鼠隨機(jī)分為5組：模型組，陽性對(duì)照組(按文獻(xiàn)[3]給予鹽酸吡格列酮5.3 mg/kg)，桃紅四物湯低劑量(4.5 g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量1倍)、中劑量(9 g/kg)、高劑量(18 g/kg)組，每組15只，各組按劑量給藥8周。末次給藥后，用3.5%水合氯醛麻醉大鼠，無菌條件下腹主動(dòng)脈取血，摘取胸主動(dòng)脈。

2.2 指標(biāo)檢測

2.2.1 T2DM模型大鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)檢測 4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，采用蘇木精-伊紅(hematoxin-eosin, HE)染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)特征。

2.2.2 Western blot法檢測T2DM模型大鼠胸主動(dòng)脈組織NF-κBp65蛋白表達(dá) 稱取組織50 mg，用PBS制備成組織勻漿液，提取總蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫下封閉，4 ℃孵育過夜，加二抗孵育，搖床振搖洗膜4次，采用Gelpro32軟件分析組織NF-κBp65蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2.2.3 RT-qPCR技術(shù)檢測T2DM模型大鼠胸主動(dòng)脈單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)和血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)mRNA表達(dá) 稱取組織50 mg，經(jīng)Trizol抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。大鼠actin引物：上游5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCGTA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCGTGCTTGCTG-3′；MCP-1引物：上游5′-GTCGGCTCGAGAACTCAAGA-3′，下游5′-TGAAGTCCTTAGCGTTGATGC-3′；VCAM-1引物：上游5′-GTCAACTGCACCGTCCCTAAT-3′，下游5′-TTGTGCCAGTTTCCTCCCTTA-3′。按照2-ΔΔCt法計(jì)算MCP-1和VCAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

2.2.4 ELISA法檢測T2DM模型大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量 采用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫工作站，按照試劑盒說明書，計(jì)算血清TNF-α、TGF-β1的含量。

3 結(jié)果

3.1 桃紅四物湯對(duì)T2DM模型大鼠胸主動(dòng)脈組織形態(tài)的影響 模型組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜不完整，平滑肌層結(jié)構(gòu)紊亂，有泡沫細(xì)胞，并伴有一定程度的平滑肌內(nèi)移，可見內(nèi)膜損傷，符合臨床T2DM模型大鼠血管的病理變化[3]，說明模型復(fù)制成功。而桃紅四物湯各劑量組藥物干預(yù)8周后，大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜和平滑肌層排列整齊，細(xì)胞膜及核膜較為清晰、完整，胞漿染色均勻，說明桃紅四物湯可顯著改善T2DM模型大鼠胸主動(dòng)脈病理改變。見圖1。

注：A.正常組；B.模型組；C.陽性對(duì)照組；D.桃紅四物湯低劑量組；E.桃紅四物湯中劑量組；F.桃紅四物湯高劑量組

圖1各組大鼠胸主動(dòng)脈病理形態(tài)變化(HE染色，10×20倍)

3.2 桃紅四物湯對(duì)T2DM模型大鼠胸主動(dòng)脈NF-κBp65蛋白表達(dá)的影響 T2DM模型大鼠胸主動(dòng)脈NF-κBp65蛋白表達(dá)水平較正常組顯著升高(P<0.05)；桃紅四物湯干預(yù)8周后，各劑量組NF-κBp65蛋白表達(dá)水平均較模型組顯著下降(P<0.05)；桃紅四物湯對(duì)NF-κBp65蛋白表達(dá)的抑制作用具有明顯的劑量依賴性。見圖2。

3.3 桃紅四物湯對(duì)T2DM模型大鼠胸主動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠胸主動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性對(duì)照組和桃紅四物湯高、中、低劑量組大鼠胸主動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)；桃紅四物湯對(duì)T2DM模型大鼠胸主動(dòng)脈MCP-1 mRNA表達(dá)的抑制作用具有一定的劑量依賴性。見圖3。

注：A.正常組；B.模型組；C.陽性對(duì)照組；D.桃紅四物湯低劑量組；E.桃紅四物湯中劑量組；F.桃紅四物湯高劑量組；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與陽性對(duì)照組比較，△P<0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，◇P<0.05；與桃紅四物湯中劑量組比較，□P<0.05

圖2桃紅四物湯對(duì)T2DM大鼠胸主動(dòng)脈NF-κBp65蛋白表達(dá)的影響(n=10)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與陽性對(duì)照組比較，△P<0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，◇P<0.05

圖3桃紅四物湯對(duì)T2DM模型大鼠胸主動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)的影響(n=10)

3.4 桃紅四物湯對(duì)T2DM模型大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性對(duì)照組和桃紅四物湯低、中、高劑量組大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量均顯著下降(P<0.05)；桃紅四物湯降低T2DM大鼠血清TNF-α、TGF-β1的作用具有明顯的劑量依賴性。見圖4。

4 討論

T2DM大血管病變是糖尿病主要并發(fā)癥之一，作為一種慢性病理改變，其基礎(chǔ)病理變化主要是內(nèi)膜粥樣化和纖維化，兼有動(dòng)脈中層變性和鈣化，早期表現(xiàn)是內(nèi)皮功能紊亂。糖尿病大血管病變的發(fā)生主要與長期慢性的高血糖、脂質(zhì)代謝紊亂、炎性反應(yīng)及血管內(nèi)皮功能受損等因素有關(guān)[4]。NF-κB信號(hào)通路主要參與機(jī)體炎性反應(yīng)的激活。研究表明，高血糖可刺激NF-κΒ信號(hào)途徑活化，繼而激活產(chǎn)生一些細(xì)胞因子和生長因子(如TNF-α、TGF-β1)，以及一些黏附分子(如VCAM-1、ICAM-1)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，增加血管通透性，引起巨噬細(xì)胞的遷移，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損[5]。

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與陽性對(duì)照組比較，△P<0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，◇P<0.05；與桃紅四物湯中劑量組比較，□P<0.05

圖4桃紅四物湯對(duì)T2DM模型大鼠血清TNF-α和TGF-β1含量的影響(n=10)

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病血管病變與中醫(yī)血瘀證有著共同的病理基礎(chǔ)，糖尿病大血管病變?yōu)橄手冏C，屬于“痰濁”“血瘀”的范疇。糖尿病早期陰虛熱結(jié)，日久傷陰耗氣，而致氣陰兩虛、腎氣不固、經(jīng)脈失養(yǎng)，由虛致瘀，遂致血脈不通、瘀血阻滯、心脈痹阻[6]。桃紅四物湯來源于清代吳謙等所著《醫(yī)宗金鑒》，由四物湯加桃仁、紅花組成，具有養(yǎng)血活血功效。臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，桃紅四物湯對(duì)心腦血管系統(tǒng)疾病、糖尿病及其并發(fā)癥均有積極的防治作用[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，桃紅四物湯干預(yù)8周后，T2DM模型大鼠胸主動(dòng)脈病理損傷顯著改善；且藥物組可顯著抑制模型大鼠胸主動(dòng)脈NF-κBp65蛋白及VCAM-1、MCP-1 mRNA表達(dá)，降低血清TNF-α、TGF-β1的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桃紅四物湯可有效干預(yù)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白和基因表達(dá)，干預(yù)T2DM模型大鼠胸主動(dòng)脈病理損傷，發(fā)揮保護(hù)糖尿病大血管的作用。

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(收稿日期：2018-03-29；編輯：姚實(shí)林)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the protective effect of Taohong Siwu Decoction on the thoracic aorta in rats with type 2 diabetes and related mechanism of action.MethodsHigh-sugar and high-fat feed combined with streptozotocin was used to establish a rat model of type 2 diabetes, and these rats were treated with Taohong Siwu Decoction for 8 consecutive weeks. The pathological changes of the thoracic aorta were evaluated. Western blot was used to measure the protein expression of nuclear factor-κB (NF-κB) in the thoracic aorta; RT-qPCR was used to measure the mRNA expression of monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1); ELISA was used to measure the serum levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1).ResultsAfter 8 weeks of intervention with Taohong Siwu Decoction, the model rats showed a significant improvement in the injury of the thoracic aorta, as well as significant reductions in the protein expression of NF-κBp65 and the mRNA expression of MCP-1 and VCAM-1 in the thoracic aorta and significant reductions in the serum levels of TNF-α and TGF-β1 (allP<0.05).ConclusionTaohong Siwu Decoction can effectively protect the thoracic aorta against pathological injury in rats with type 2 diabetes, possibly by intervention of the NF-κB signaling pathway and inhibition of the expression of MCP-1, VCAM-1, TNF-α, and TGF-β1.

[Keywords] Taohong Siwu Decoction; Type 2 diabetes; Vascular complication; Tumor necrosis factor; Transforming growth factor; Vascular cell adhesion molecule; Monocyte chemoattractant protein