TNF撥梁蚇euritin在四肢骨折合并脊髓損傷患者血清中的表達變化及臨床意義

廖林波 藍常貢 彭維波 唐毓金 謝克恭 梁俊卿 吳昭元 李偉

【摘要】目的探討血清腫瘤壞死因子α（TNFα）和神經突起因子（Neuritin）水平在四肢骨折伴脊髓損傷中對骨折愈合的作用。方法選擇2016年5月～2017年4月收治的42例單純骨折患者（單純骨折組）、26例單純脊髓損傷患者（單純脊髓損傷組）、30例四肢骨折合并脊髓損傷患者（四肢骨折合并脊髓損傷組）；同期選取48例在體檢中心行健康體檢的正常人（正常組）。采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術檢測血清TNFα和Neuritin水平在各病例組術后第3、7、14天的變化情況，同時檢測其在正常組中的表達水平。結果術后不同時間段，單純骨折組、單純脊髓損傷組、四肢骨折合并脊髓損傷組血清TNFα、Neuritin含量呈動態(tài)表達現象，且均高于正常組，其中以四肢骨折合并脊髓損傷組變化最大，其TNFα、Neuritin變化幅度明顯高于其他三組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結論四肢骨折合并脊髓損傷患者外周血中TNFα與Neuritin含量變化情況明顯高于其余三組，表明與創(chuàng)傷骨折的修復存在密切關聯(lián)，這兩種因子可能在骨折愈合過程中共同發(fā)揮作用，故推斷其可能是脊髓損傷后加速骨折愈合的關鍵因子。

【關鍵詞】腫瘤壞死因子α；神經突起因子；脊髓損傷；骨折愈合

中圖分類號：R683.4；R651.2文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2018.02.004

Change of expression of TNFα and Neuritin in the serum of patients with

extremities fracture with spinal cord injury and its clinical significance

LIAO Linbo1，LAN Changgong2，PENG Weibo2，TANG Yujin2，

XIE Kegong2，LIANG Junqing1，WU Zhaoyuan1，LI Wei1

（1.Graduate School，2.Department of Spinal Osteopathy Surgery of Affiliated Hospital，3.Department of Traumatic

Orthopedics of Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of serum tumor necrosis factorα （TNFα） and neurite factor （Neuritin） in the healing of extremities fracture with spinal cord injury.MethodsFrom May 2016 to April 2017，42 patients with simple fractures（simple fracture group），26 patients with simple spinal cord injury （simple spinal cord injury group），and 30 patients with extremities fracture with spinal cord injury （extremities fracture with spinal cord injury group） were selected for this study.During the same period，48 normal persons who underwent physical examination in physical examination center were also selected（normal group）.The levels of serum TNFα and Neuritin were detected by immunoassay （ELISA） on the 3rd，7th and 14th day after operation in each case group，and their expression levels in the normal group were detected at the same time.ResultsAt different time after operation，the serum TNFα and Neuritin levels in the simple fracture group，the simple spinal cord injury group and the extremity fracture with spinal cord injury group showed dynamic expression，and were higher than those in the normal group.Among them，serum TNFα and Neuritin levels in the extremity fracture with spinal cord injury group had the largest change，and the changes were significantly higher than those of the other three groups，so difference was statistically significant（P<0.01）.ConclusionThe changes of serum TNFα and Neuritin in patients with extremity fracture with spinal cord injury are significantly higher than those in the other three groups，which are closely related to the healing of traumatic fractures.These two factors may play a joint role in the process of fracture healing，so it is inferred that they may be the key factors to accelerate fracture healing after spinal cord injury.

【Key words】TNFα；Neuritin；spinal cord injury；fracture healing

骨折愈合是一個甚為復雜且連續(xù)的過程，其受諸多因素（比如神經因素）影響。在實際臨床工作中骨外科醫(yī)生時常遇到一個奇怪的現象，即四肢骨折合并脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）病人異位骨化概率明顯增加，骨痂出現過度生長及骨折愈合速度明顯快于無脊髓損傷患者，這些在諸多文獻中均有一定的報道。有研究表明，脊髓損傷后早期血清中所釋放的各種細胞因子對骨折斷端修復作用不容忽略。因而本研究試圖通過雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測單純骨折患者、單純脊髓損傷患者、四肢骨折合并脊髓損傷患者及健康人血清中腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor alpha，TNFα）和神經突起因子（Neuritin）的含量，旨在初步探討脊髓損傷后加速骨折愈合作用的相關機理。

1資料與方法1.1臨床資料所有研究對象均來自2016年5月～2017年4月在右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院和百色市人民醫(yī)院住院治療的患者。其中單純骨折組男性29例，女性13例，年齡為18～67歲，平均（44.54±15.97）歲。單純脊髓損傷組男性15例，女性11例，年齡為21～62歲，平均（44.65±13.81）歲。四肢骨折合并脊髓損傷組男性19例，女性11例，年齡為19～61歲，平均（41.06±12.79）歲。同時選擇在右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院體檢中心進行健康體檢的人群48例，男性23例，女性25例，年齡為23～50歲，平均（3933±8.45）歲。所有患者均依據影像學檢查（如X線、CT或MRI）確診。

1.2病例標準（1）排除合并有心、腦血管疾?。ㄈ绺哐獕?、冠心?。?；（2）排除合并骨代謝性病變（如骨質疏松、腎性骨病及遺傳性骨病）；（3）排除合并影響機體免疫功能的疾?。ㄈ缣悄虿。?；（4）骨折部位均為四肢骨折；（5）排除合并有其他部位的創(chuàng)傷；（6）排除診斷不明確患者。該實驗研究報本院醫(yī)學倫理委員會審批，所選受檢者及家屬均了解本次研究的目的及意義，并簽署同意書。

1.3研究方法

1.3.1標本收集采集空腹肘靜脈血3～5 ml，靜置30 min之后，以2000 r/min速度離心1 min后，取血清置于-80℃保存待檢。

1.3.2血清TNFα與Neuritin含量的檢測TNFα和Neuritin的ELISA試劑盒由上海希美化學有限公司提供，實驗步驟均嚴格依說明書操作。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較用t檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2結果2.1術后患者外周血清中TNFα與Neuritin含量總體變化情況本研究結果表明，術后各病例組（單純骨折組、單純脊髓損傷組、四肢骨折合并脊髓損傷組）患者外周血清中TNFα與Neuritin含量明顯增加，均大于正常組，而四肢骨折合并脊髓損傷組變化尤為明顯。TNFα、Neuritin含量術后第3天開始升高，第7天達到峰值，第14天時開始回落。此兩個指標與創(chuàng)傷骨折修復存在密切相關性，故推斷其可能是SCI后加速創(chuàng)傷骨折修復的關鍵要素。

2.2術后各組患者外周血清中TNFα含量變化比較與正常組比較，各病例組術后第3天血清TNFα的含量明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0001）；而四肢骨折合并脊髓損傷組術后第3、7、14天血清TNFα含量均高于相同時間點的單純骨折組和單純脊髓損傷組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或0.01）。見表1。

2.3術后各組患者外周血清中Neuritin含量變化比較與正常組比較，各病例組術后第3天血清Neuritin的含量均高于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；而四肢骨折合并脊髓損傷組術后第3、7、14天血清Neuritin含量均高于相同時間點的單純骨折組、單純脊髓損傷組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<001）。見表2。

3討論脊髓損傷是骨科與創(chuàng)傷外科中較為常見的一種疾病，對人類的生命健康帶來極大危害。然而伴隨現代化建筑工業(yè)及交通工具的迅猛發(fā)展，其發(fā)生率呈逐年上升態(tài)勢，一旦發(fā)生容易導致?lián)p傷截面以下的機體出現不可恢復的功能紊亂與障礙[1]，且其早期治療與后續(xù)康復治療成本令人望而卻步，故不僅會對患者自身產生劇烈傷害，并會給家庭帶來沉重的負擔，甚至還給全社會帶來負面影響。因此，如何能更好地促進肢體殘存功能恢復和改善患者生存質量，這已成為當代醫(yī)學界的又一大難題。

盡管目前SCI后如何加速創(chuàng)傷骨折愈合的詳細機制尚不明了，但近年來有諸多文獻報道，在SCI后的外周血中以及通過局部刺激釋放出多種可促進骨折愈合的物質[2]，如：轉化生長因子β（Transforming growth factor beta，TGFβ）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、胰島素樣生長因子 （insulinlike growth factor，IGF）等。這些細胞因子能有效調節(jié)成骨細胞的成骨作用，促進骨折周圍大量原始骨痂的形成，急劇加速了骨折愈合。有研究證實TGFβ具有刺激骨吸收與破骨細胞形成的多重作用。學者楊森等人[3]對28例住院病人的血清進行ELISA檢測分析發(fā)現，與其他對照組相比，骨折合并脊髓損傷組TGFβ含量顯著增加，因而認為TGFβ水平改變與骨折愈合有一定的相關性。此外有研究報道，BMP能夠誘導動物及人體間充質干細胞（MSCs）分化為骨及軟骨等組織，從而加速骨折愈合。國外著名學者Yaoita等在文獻中指出，股骨骨折2天后骨折處BMP2/4mRNA表達增高。國內馬敏杰等通過動物實驗已證實，SCI后損傷脊髓組織中BMP2的表達的確有所增加。另外研究也發(fā)現，TGFβ在BMP2的調控下異常表達，并進一步加速局部血管的再生，以及促使成骨細胞的數量與活性顯著升高，從而加速了斷端骨折的愈合。這些結果初步提示BMP極有可能在脊髓損傷后對骨折愈合加速當中發(fā)揮著至關重要的作用。IGF也被稱作促生長因子，在脊髓損傷的修復作用已相繼得到證實，國外學者Lundin等[4]發(fā)現，在骨轉換過程中IGF作用顯得尤為重要。

TNFα亦稱惡病質素，自1975年被發(fā)現至今其在脊髓損傷后的表達研究甚多，諸多資料顯示TNFα在中樞系統(tǒng)損傷（例如脊髓損傷或顱腦創(chuàng)傷）后早期表達呈反常狀態(tài)[5～6]，這初步提示TNFα同創(chuàng)傷后的應激反應密切相關。學者劉銘等人[7]通過動物實驗發(fā)現，大鼠脊髓損傷8 h后脊髓組織細胞中的TNFα明顯升高，1天后達到高峰。Ross等發(fā)現顱腦創(chuàng)傷患者外周血及腦脊液中TNFα濃度也有一定程度增高。國內曾日祥等[8]對87例住院患者的外周血進行分析發(fā)現，脊髓損傷并發(fā)骨折組患者的TNFα含量明顯增加。學者Wang等[9]在脊髓損傷后對股骨骨折骨愈合的影響研究中發(fā)現，骨折組的骨痂組織體積明顯低于脊髓損傷并骨折組，且骨折修復的平均時間明顯慢于脊髓損傷并骨折組。本研究發(fā)現，三個病例組TNFα含量在術后第3天逐漸上升，在第7天時達到頂峰，第14天后漸漸回落，且均高于正常組。而四肢骨折合并脊髓損傷組患者的TNFα表達變化明顯高于其他對照組。這些均表明了TNFα可能在脊髓損傷后對骨折修復過程具有重要意義。

Neuritin已被認為是一種新型神經營養(yǎng)因子，自Nedivi等[10]發(fā)現至今，其在神經系統(tǒng)的發(fā)育及創(chuàng)傷后的再生修復等方面都發(fā)揮重要的作用。有研究發(fā)現[11]，Neuritin不僅能促進骨折斷端處的血管生長，同時能使局部的血管內皮細胞發(fā)生增殖，改善其遷徙能力和附著能力，而骨折處血管病理生理功能的變化在骨折愈合當中顯得尤為重要，這初步提示Neuritin可能與創(chuàng)傷骨折修復關系密不可分。學者Zhang等[12]通過動物實驗表明，在大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷早期（術后24 h）Neuritin表達開始增高，同時該研究結果顯示Neuritin能明顯改善神經細胞的凋亡，對神經的再生起到一定保護作用。此外魏勇等人[13]運用ELISA技術檢測了160例住院患者的外周血，分析發(fā)現在傷后不同時間里（3天、7天、10天）Neuritin的表達水平各組間比較結果為：四肢骨折伴腦外傷組變化最為顯著，其次為單純腦外傷組、單純骨折組，且均大于正常組。這一定程度上提示Neuritin極有可能對骨折的愈合具有促進作用。然而，迄今為止涉及Neuritin與四肢骨折合并脊髓損傷中的分子機制知之甚少。本實驗各病例組Neuritin在術后第7天達到高峰，后逐步回落，其在脊髓損傷伴四肢骨折組中升高最為顯著。提示臨床工作中可通過檢測血清中Neuritin變化情況，進而為骨折的愈合提供參考，具有較為合理的臨床應用價值。

總之，TNFα、Neuritin的表達水平在四肢骨折合并脊髓損傷患者血清中呈明顯升高態(tài)勢，這初步提示TNFα、Neuritin在伴有脊髓損傷的骨折愈合中可能扮演著重要的角色。然而，目前國內外關于TNFα與Neuritin在脊髓損傷后是如何加速骨折愈合的報道尚不夠充足，未來還需進一步研究與探討。相信隨著細胞分子技術的開展，我們對骨折愈合的機制將會有更深刻的理解，進而為設計出新型藥物干預加速骨折愈合奠定基礎。參考文獻[1]Schreier N，Moltchanova E，Forsén T，et al.Seasonality and ambient temperature at time of conception in termborn individualsinfluences on cardiovascular disease and obesity in adult life[J].Int J Circumpolar Health，2013，72：21466.

[2]Pountos I，Georgouli T，Henshaw K，et al.Release of growth factors and the effect of age，sex，and severity of injury after long bone fracture[J].A preliminary report[J].Acta Orthop，2013，84（1）：6570.

[3]楊森，王海龍，盛偉斌，等.骨折合并脊髓損傷患者血清中轉化生長因子β1變化：有利于促進骨折愈合[J].中國組織工程研究，2015，19（2）：165169.

[4]Lundin H，Sf M，Strender LE，et al.High serum insulinlike growth factorbinding protein 1（IGFBP1）is associated with high fracture risk independent of insulinlike growth factor 1（IGFI）[J].Calcif Tissue Int，2016，99（4）：333339.

[5]Amini Pishva A，Akbari M，Farahabadi A，et al.Effect of estrogen therapy on TNFα and inos gene expression in spinal cord injury model[J].Acta Med Iran，2016，54（5）：296301.

[6]Chang V，Ellingson BM，Salamon N，et al.The risk of acute spinal cord injury after minor trauma in patients with preexisting cervical stenosis[J].Neurosurgery，2015，77（4）：561565.

[7]劉銘，劉欣偉，劉憲民，等.TNFα、Caspase3在大鼠脊髓損傷后神經細胞凋亡中相關性研究[J].臨床軍醫(yī)雜志，2017，45（4）：366370.

[8]曾日祥，馬勇，賴玉靈.急性脊髓損傷患者外周血hsCRP、TNFα、IL6和IL10的動態(tài)表達及臨床意義[J].河北醫(yī)藥，2016，38（10）：15091511.

[9]Wang L，Liu L，Pan Z，et al.Serum leptin，bone mineral density and the healing of long bone fractures in men with spinal cord injury[J].Bosn J Basic Med Sci，2015，15（4）：6974.

[10]Le Jan S，Le Meur N，Cazes A，et al.Characterization of the expression of the hypoxiainduced genes neuritin，TXNIP and IGFBP3 in cancer[J].FEBS Lett，2006，580（14）：33953400.

[11]Nedivi E，Hevroni D，Naot D，et a1.Numerous candidate plasticityrelated genes revealed by differential cDNA cloning[J].Nature，1993，363（6431）：718722.

[12]Zhang H，He X，Wang Y，et al.Neuritin attenuates early brain injury in rats after experimental subarachnoid hemorrhage[J].Int J Neurosci，2017，1337013.[Epub ahead of print]

[13]魏勇，董金波，李長俊，等.NGF與Neuritin在腦外傷伴四肢骨折病人血清中的表達及意義[J].現代生物醫(yī)學進展，2011，11（19）：36833686.