卒中后抑郁模型大鼠血清兒茶酚胺類遞質變化的研究

2018-07-05 11:09:42蒙杰李雪斌王潔黃小睿

右江醫(yī)學 2018年2期

蒙杰李雪斌王潔黃小睿

【摘要】目的建立卒中后抑郁（Poststroke depression，PSD）大鼠模型，探討卒中后抑郁大鼠血清中去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、腎上腺素（epinephrine，E）和多巴胺（dopamine，DA）含量的變化情況。方法選取大鼠48只納入實驗，隨機分為4組，正常對照組12只，腦卒中組大鼠12只，孤養(yǎng)抑郁組大鼠12只，卒中后抑郁組12只。分別通過制備大腦中動脈栓塞模型，建立腦卒中組；給予慢性不可預測的溫和刺激聯(lián)合孤養(yǎng)法建立孤養(yǎng)抑郁模型。制備卒中后抑郁模型組時，首先建立大腦中動脈栓塞模型，成功制備卒中大鼠模型后，再通過慢性不可預測的溫和刺激聯(lián)合孤養(yǎng)法的綜合造模方法進行二次造模，最后得到卒中后抑郁大鼠模型。應用高效液相色譜熒光檢測法檢測各組大鼠血清中NE、E和DA的含量。結果4組大鼠組間NE、E、DA含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，正常對照組、孤養(yǎng)抑郁組、腦卒中組、卒中后抑郁組的NE、E、DA含量有逐漸遞減趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或0.01）。卒中后抑郁組大鼠血清中NE、E和DA含量變化均與大鼠體質量、糖水消耗量、水平運動得分呈正相關（P<0.001）；而卒中后抑郁大鼠血清中NE、E和DA含量與大鼠直立運動得分、中央格停留時間、修飾次數(shù)相互關系不顯著（P>0.05）。結論卒中后抑郁大鼠模型血清NE、E和DA含量明顯下降，很可能與卒中后抑郁的發(fā)病機制有關。兒茶酚胺類神經(jīng)遞質水平的降低程度，與大鼠行為學改變程度高度相關。

【關鍵詞】卒中后抑郁；大鼠；去甲腎上腺素；腎上腺素；多巴胺

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2018.02.003

Study on changes of serum catecholamines in rats with poststroke depression

MENG Jie1，LI Xuebin2，WANG Jie2，HUANG Xiaorui2

（1.Graduate School，Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

【Abstract】ObjectiveA rat model of poststroke depression（PSD） was established to investigate the changes of serum norepinephrine（NE），epinephrine（E） and dopamine（DA） in rats with PSD. Methods48 rats were selected and randomly divided into 4 groups：normal control group，stroke group，solitary depression group and PSD group，with 12 rats in each group.The model of middle cerebral artery embolization was made to establish the stroke group，and the model of solitary depression group was established by chronic unpredictable mild stimulation combined with solitary raising method.In the preparation of the model of the PSD group，the middle cerebral artery model was established at first.After successfully establishing the stroke rat model，and the model was established by chronic unpredictable mild stimulation combined with solitary raising method again.Finally，the rat model of the PSD group was obtained.And then，the contents of NE，E and DA in serum of rats in each group were detected by high performance liquid chromatographyfluorescence detection.ResultsDifference of the contents of NE，E and DA between the four groups was statistically significant（P<0.001）.Pairwise comparison showed that the contents of NE，E and DA in the normal control group，the stroke group，the solitary depression group and the PSD group decreased gradually，and the difference was statistically significant（P<0.05 or 0.01）.In the PSD group，the changes of NE，E and DA contents were positively correlated with body mass，sugar water consumption and horizontal motor score in rats（P<0.001），but the NE，E and DA contents were not significantly correlated with vertical movement scores，central lattice residence time and modification times （P>0.05）.ConclusionThe levels of serum NE，E and DA in the rats model of PSD significantly decrease，which may be related to the pathogenesis of PSD.The decrease in the level of catecholamine neurotransmitters is highly correlated with the degree of ethological changes in rats.

【Key words】PSD；rats；NE；E；DA

腦卒中后抑郁（Poststroke depression，PSD），是腦卒中后常見的并發(fā)癥，臨床上以心境低落、興趣下降等為主要表現(xiàn)。美國心臟協(xié)會及卒中協(xié)會在2017年發(fā)表最新共識，其中指出：約有1/3以上患者在腦卒中后會伴隨卒中后抑郁的發(fā)生[1]?？梢婎净甲渲泻笠钟舻娜藬?shù)之多、范圍之廣。腦卒中的發(fā)生，會導致患者神經(jīng)功能受損，累及言語功能、肢體功能等多個方面。而PSD作為腦卒中后的精神并發(fā)癥，會明顯加重患者的神經(jīng)功能受損情況，增加卒中患者、家庭的經(jīng)濟負擔及康復難度，卒中患者的病死率升高[2]，同時顯著影響卒中患者的生活質量[3～4]。PSD對于卒中患者的影響長久而持續(xù)，患者長期處于持續(xù)的興趣低落狀態(tài)中，嚴重影響肢體康復、認知功能、神經(jīng)功能恢復。同時，長時間的抑郁狀態(tài)，使患者的病死率、自殺率均升高。目前對PSD發(fā)病機制的研究主要有反應性學說和內(nèi)源性學說。內(nèi)源性學說側重于PSD的生物學機制。PSD神經(jīng)生物學發(fā)病機制復雜，其中與各種神經(jīng)遞質如去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、腎上腺素（epinephrine，N）、多巴胺（dopamine，DA）、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）、谷氨酸（glutamate，Glu）、5羥色胺（5Hydroxytrytamine，5HT）表達失衡有關[5～7]的研究目前得到較多支持。因此，本研究旨在建立PSD大鼠模型，探討模型大鼠血清中兒茶酚胺類神經(jīng)遞質的變化情況，為臨床上早期識別、診斷、治療PSD提供新的思路和方法。

1材料與方法1.1主要試劑與器材戴安U3000型高效液相色譜儀（美國戴安）、Discovery C18色譜柱（4.6 mm250 mm5 μm，美國Sigma公司）。去甲腎上腺素標準品、腎上腺素標準品、多巴胺標準品（美國Sigma公司，HPLC級，純度99%）；高氯酸、檸檬酸三鈉、甲醇、鹽酸（國產(chǎn)分析純，購自上海阿拉丁生化試劑公司）；實驗動物選擇2月齡以上清潔級成年雄性SD大鼠48只，體重選擇在200～300 g之間，置于溫度、濕度相對適宜的環(huán)境中預飼養(yǎng)1周。動物由右江民族醫(yī)學院實驗動物中心提供[許可證號：SCXK（桂）2012-0003]，實驗過程符合右江民族醫(yī)學院倫理學委員會標準。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組所有大鼠進行為期1周的適應性飼養(yǎng)，正常飲水、飲食。預飼養(yǎng)結束，隨機選取大鼠48只納入實驗。按隨機數(shù)字表將大鼠分為正常對照組、腦卒中組、孤養(yǎng)抑郁組、卒中后抑郁組4組，每組12只。各組大鼠體重分別為：正常對照組（272.83±22.83）g、孤養(yǎng)抑郁組（273.67±20.33）g、腦卒中組（272.08±19.83）g、卒中后抑郁組（272.08±25.61）g。正常對照組大鼠置于同一籠中飼養(yǎng)，正常喂水喂食；腦卒中組大鼠采用卒中造模方法成功建立模型后，置于同一籠中飼養(yǎng)，正常喂水喂食；孤養(yǎng)抑郁組大鼠采用慢性不可預測的溫和刺激造模成功后，每只大鼠獨立喂養(yǎng)；卒中后抑郁組大鼠建立卒中模型，造模成功后再通過慢性不可預測的溫和刺激聯(lián)合孤養(yǎng)法進行2次造模，飼養(yǎng)方法同抑郁組。在實驗過程中，若因不可預測的意外出現(xiàn)大鼠死亡，及時選擇大鼠進行補充，保證各組大鼠例數(shù)為12只。

1.2.2動物模型的建立方法（1）卒中模型的建立方法：采用Su[8]、ZeaLonga[9]等改良線栓法制備，術后進行大鼠神經(jīng)功能評分。（2）卒中模型的評價方法：大鼠卒中造模后，采用ZeaLonga 5分評分法評價造模是否成功，只有評分在1～3分的大鼠可以保留，常規(guī)條件下飼養(yǎng)后進行后一階段造模。（3）抑郁模型的建立：參考Willner P、Towell A等的改良方法[10]，給予實驗大鼠進行為期 21 天的慢性不可預測溫和刺激法處理，包括：冰水刺激、熱水刺激、夾尾刺激、潮濕墊料、明暗顛倒、傾斜飼養(yǎng)籠、擁擠飼養(yǎng)共 7種，每日隨機抽取 1 種刺激，每種刺激使用 1 次，持續(xù) 7 天，共 3 個周期。在使用刺激的過程中，聯(lián)合使用孤養(yǎng)法。（4）抑郁模型的評價方法：模型建立成功后，大鼠會出現(xiàn)明顯的抑郁狀態(tài)，表現(xiàn)為體重減輕、食欲減退、活動減少、毛發(fā)枯萎、缺乏快感、糖水消耗明顯下降等。

1.2.3實驗標本取材方法大鼠稱重后腹腔麻醉，斷頭后取血，所取得血樣品則置于冰上 2 小時，得到上層血清。樣本血清分組置于-80℃冰箱中冷凍備用。

1.2.4高效液相色譜熒光檢測法（1）色譜條件：色譜柱：Discovery C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相配置情況：甲醛與檸檬酸三鈉溶液按1∶99比例配置，甲醛為0.02 mmol/L，溶液pH酸堿度調整至5.0；流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μL；柱溫：35℃；熒光激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長315 nm。（2）標準液的配置：取NE、E、DA標準品，用流動相溶液將標準品配置成為儲備液，儲備液濃度為40 μg/ml，配置好的儲備液放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。標準品用已配置好的儲備液稀釋成以下幾個濃度梯度，即：NE：1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml；E：0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml；DA：2 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml的溶液，作為各組分的標準品對照液。（3）供試液：將樣本血清成功解凍后，取各組血清200 μL于EP管中，同時加入200 μL高氯酸鈉溶液（濃度為5%）充分混合均勻后靜置30 min。將沉淀好的血清樣本10000 r/min離心15 min后，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，置于2 ml進樣瓶中集體進樣。（4）標準色譜圖制備：取標準液按上述色譜條件，設定5個濃度系列，取20 μL入進樣品中進樣，以NE、E或 DA標準溶液的濃度為橫坐標（Y），以與之對應的峰面積為縱坐標（X）繪制標準曲線圖并進行線性分析。（5）樣品含量測定：取各組供試液直接進樣，按色譜條件測定其中NE、E、DA的含量，根據(jù)標準曲線圖計算各組含量。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，進行方差齊性檢驗，若符合正態(tài)分布，則多組間比較采用完全隨機設計資料單因素方差分析（OneWay ANOVA），組間兩兩比較采用q檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2結果2.1各組大鼠血清兒茶酚胺類遞質含量比較4組大鼠組間NE、E、DA含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，正常對照組、孤養(yǎng)抑郁組、腦卒中組、卒中后抑郁組的NE、E、DA含量有逐漸遞減趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或0.01）。見表1。

2.2PSD組大鼠行為學檢測結果與兒茶酚胺類遞質的相關性分析將卒中后抑郁組大鼠行為學檢測結果，包括：體重、曠場實驗（水平運動得分、直立運動得分、中央格停留時間、修飾次數(shù)）、糖水消耗實驗等與血清兒茶酚胺類遞質含量變化進行相關性分析，分析結果提示卒中后抑郁組大鼠血清中NE、E和DA含量變化均與大鼠體重、糖水消耗量、水平運動得分呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；而卒中后抑郁大鼠血清中NE、E和DA含量與大鼠直立運動得分、中央格停留時間、修飾次數(shù)相互關系不顯著，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

3討論據(jù)統(tǒng)計，我國每年因腦卒中死亡人數(shù)超過165萬，總病死率超過22.45%[11]。腦卒中已超過腫瘤躍居我國國民死亡病因的首位。卒中后抑郁作為腦卒中的常見并發(fā)癥，具有較高的發(fā)病率，國外及國內(nèi)有關卒中后抑郁發(fā)病率的報道分別為30%～60%[12]和40.54%[13]。腦卒中包括缺血性和出血性兩種，而缺血性卒中占腦卒中85%以上。1977年，F(xiàn)olstein首次提出腦卒中后抑郁的概念。在過去40年的時間中，隨著PSD被越來越多的人所認識，人們發(fā)現(xiàn)PSD的發(fā)病率較前明顯升高。因此，探索PSD的發(fā)病機理，及早發(fā)現(xiàn)、診斷、干預PSD的發(fā)生發(fā)展，對于卒中患者的功能恢復至關重要。

PSD的發(fā)病機制至今仍不明確，目前最具代表性的兩種理論包括：原發(fā)性內(nèi)源性機制和反應性機制[16]。前者是指腦卒中病灶引起單胺類神經(jīng)遞質水平或受體功能下降而出現(xiàn)抑郁癥狀，而后者是認為PSD導致腦損害引起下丘腦垂體腎上腺軸功能紊亂從而導致的調節(jié)障礙。在PSD發(fā)生的原發(fā)性內(nèi)源性機制中，“神經(jīng)遞質假說”尤為重要。NE、E、DA等兒茶酚胺類神經(jīng)遞質及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布。在原發(fā)性抑郁的生物學發(fā)生機理假說中已有研究顯示神經(jīng)遞質（NE、DA等）的缺乏與抑郁癥的發(fā)生有關。研究人員應用正電子發(fā)射斷層檢測記性PSD患者時發(fā)現(xiàn)，中樞NE、E和DA等遞質低下[14]，急性中風階段的抑郁與生物因素密切相關，與肢體殘疾關系較小[15]。因此，我們建立了卒中后抑郁大鼠模型，更好地模擬臨床急性腦卒中后PSD的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組、孤養(yǎng)抑郁組、腦卒中組相比較，卒中后抑郁組大鼠血清去甲腎上腺素、腎上腺素及多巴胺水平均下降，這與相關文獻[16]研究結果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比較，腦卒中組和孤養(yǎng)抑郁組大鼠血清中去甲腎上腺素、腎上腺素及多巴胺水平均下降；與腦卒中組相比較，孤養(yǎng)抑郁組大鼠血清中各遞質含量變化無差別，這提示兒茶酚胺類神經(jīng)遞質在卒中和抑郁的發(fā)生皆有可能同時產(chǎn)生作用。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，卒中后抑郁大鼠行為學變化與血清兒茶酚胺類遞質下降呈正相關。

腎上腺素脫去N甲基后形成去甲腎上腺素，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，腎上腺素能神經(jīng)末梢、交感節(jié)后神經(jīng)元胞體是分泌去甲腎上腺素的主要部位。目前的研究已經(jīng)確定，去甲腎上腺素在記憶、學習、情緒等高級神經(jīng)活動中有重要作用，缺乏去甲腎上腺素可導致神經(jīng)興奮性下降，從而引起抑郁相關病癥。NE和E能神經(jīng)元胞體大多數(shù)位于低位腦干及延髓中，擁有廣泛的上下行投射纖維可投射至大腦多處，其中，去甲腎上腺素能上行纖維能放射至大腦皮層、邊緣前腦和下丘腦，而腎上腺素能纖維除了分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，還在外周分布。有研究[5]認為，PSD的發(fā)生發(fā)展與腦卒中后腦細胞發(fā)生缺血、缺氧、水腫等病理變化導致腦實質損害，引起腦組織代謝紊亂、功能失調，損害了NE、E神經(jīng)元胞體細胞，減少了NE、E等神經(jīng)遞質的釋放，阻斷了紋狀體蒼白球丘腦皮質回路等有關，從而影響了該回路的去甲腎上腺素能和腎上腺素能神經(jīng)通路，使相關神經(jīng)遞質含量下降而導致抑郁。

目前有相關研究表明DA的失活將導致快感缺失，這正是淡漠型PSD的主要行為特征。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的神經(jīng)遞質，多巴胺既能調控錐體外系活動，也能調節(jié)精神活動，還能調控視覺信息的傳導[17]。在抑郁性相關精神障礙的患者中，可以檢測到多巴胺功能下降，補充酪氨酸等能提高多巴胺濃度的藥物可以改善上述疾病患者的癥狀，也從精神藥理學層面支持了多巴胺與抑郁相關癥狀發(fā)生發(fā)展的關系。已發(fā)現(xiàn)多巴胺腦內(nèi)通路共有5條，其中，中腦腹側被蓋邊緣前腦付隔核通路與獎賞行為和成癮行為有關。在已有的實驗報道中，采用深部刺激大鼠腦內(nèi)付隔核，可以減輕大鼠的抑郁相關癥狀，從側面支持了多巴胺與腦卒中后抑郁的發(fā)生有關。本研究結果與上述觀點一致。多巴胺作為重要的神經(jīng)遞質，僅由中樞神經(jīng)系統(tǒng)分泌及釋放，對于卒中后抑郁的研究有較好的特異性，該通路的研究可為卒中后抑郁治療尋找新的途徑[18～19]。

研究業(yè)已證實，在抑郁大鼠模型中，腦組織及血漿中單胺類遞質含量有下降趨勢。血清單胺類神經(jīng)遞質及其代謝產(chǎn)物可反映大腦單胺類神經(jīng)遞質的平衡狀態(tài)，其水平變化可作為抑郁癥診斷生物標志的一個客觀參考指標[20]。本實驗研究所采用的是大鼠血清檢測兒茶酚胺類遞質，同樣提示NE、DA的含量均明顯下降。并且發(fā)現(xiàn)卒中后抑郁大鼠行為學變化與血清兒茶酚胺類遞質下降呈正相關。提示早期監(jiān)測NE、E和DA含量對PSD的診治具有積極意義。

綜上所述，目前推測，腦卒中的發(fā)生導致了NE、E和DA含量下降，從而引發(fā)PSD的發(fā)生。因此可以早期測定其含量作為診斷PSD的指標之一，有助于PSD的早期診斷，在預防、診斷及治療PSD的過程中尋找可靠路徑，以幫助解決目前臨床實際困難，減輕PSD對家庭社會形成的負擔。參考文獻[1]Towfighi A，Ovbiagele B，EI Husseini N，et al.Poststroke depression：A scientific statement for healthcare professionals from the American heart association/American stroke association[J].Stroke，2017，48（2）：e30e43.

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