云南省彝族人群SRD5A2基因多態(tài)性與前列腺癌的相關(guān)性

羅鈺輝 李康健 官潤云 申吉泓 劉孝東 李顥

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（昆明 650032）

前列腺癌是全球范圍內(nèi)男性最常見的惡性腫瘤，2015年有160萬前列腺癌患者被確診，366 000人死于該?。?］。近年來，前列腺癌發(fā)病率在我國呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)［2］。但是目前前列腺癌的病因尚不明確，基因和環(huán)境是其危險(xiǎn)因素［3］。由于雄激素在前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展中起到了非常重要的作用［4］，而睪酮5-α還原酶Ⅱ（testosterone 5-alpha-reductaseⅡ，SRD5A2）基因編碼的睪酮5-α還原酶Ⅱ是雄激素合成過程中睪酮轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮的關(guān)鍵酶［5］，所以SRD5A2基因多態(tài)性與前列腺癌易感性的關(guān)系受到人們的廣泛關(guān)注。但是，SRD5A2基因多態(tài)性與前列腺癌的相關(guān)性研究大多集中于歐美人群，僅有少量中國漢族人群的研究報(bào)道，并且缺乏我國少數(shù)民族人種的相關(guān)研究。因此，我們通過Sanger測(cè)序法對(duì)122例云南彝族前列腺癌患者與135例云南彝族非前列腺癌健康男性的 SRD5A2基因 rs523349（V89L）、rs9282858（A49T）和TA重復(fù)序列多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，從而分析云南省彝族人群中SRD5A2基因多態(tài)性與前列腺癌的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年5月至2017年5月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的122例云南彝族前列腺癌患者為病例組，所有前列腺癌患者均經(jīng)前列腺穿刺病理證實(shí)，年齡51～83歲，平均（65.3±3.8）歲；同期選擇135例在我院體檢中心體檢的年齡匹配的云南彝族非前列腺癌健康男性作為對(duì)照組，年齡52～85歲，平均（66.7±3.2）歲。兩組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后開始研究，所有入選對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集及基因組DNA提取 分別收集符合條件受檢者外周靜脈血3 mL，EDTA抗凝，-80℃冰箱保存。根據(jù)DNA鹽析提取量化標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議，用酚/氯仿的混合液進(jìn)行抽提，稀釋至 10 μg/μL，置于-20℃冰箱備用。

1.2.2 相關(guān)引物 根據(jù)核苷酸序列應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

表1 SRD5A2基因多態(tài)性位點(diǎn)引物序列Tab.1 Primer sequence of SRD5A2 gene polymorphic loci

1.2.3 PCR反應(yīng) 30 μL PCR反應(yīng)體系的配制：10× Taq DNA 聚合酶（rTaq）緩沖液 3 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，rTaq 0.2 μL，50%二甲基亞砜（DMSO）1 μL，正、反向引物各1 μL，DNA模板2 μL，去離子水19.8 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度95℃ 3 min，變性溫度94℃ 30 s，退火溫度60℃45 s，延伸溫度72℃45 s，修復(fù)延伸溫度72℃5 min，循環(huán)數(shù)35次。

1.2.4 基因多態(tài)性檢測(cè) （1）準(zhǔn)備模板：質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物。（2）電泳檢查DNA濃度和質(zhì)量；檢測(cè)質(zhì)粒抽取的質(zhì)量。（3）測(cè)序PCR反應(yīng)：測(cè)序試劑體系配制按ABI Big Dye v3.1測(cè)序說明書進(jìn)行。測(cè)序PCR循環(huán)條件：96℃ 1 min；25個(gè)循環(huán)：96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 4 min；4℃保溫。（4）純化測(cè)序產(chǎn)物（上機(jī)前純化）。（5）ABI 3730XL測(cè)序儀上機(jī)電泳。（6）分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用IBM SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，SRD5A2基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因用計(jì)數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)以及對(duì)病例、對(duì)照兩組間多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因分布的比較均采用卡方檢驗(yàn)，并通過計(jì)算優(yōu)勢(shì)比（OR）及95%置信區(qū)間（95%CI）來判斷其與前列腺癌的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 分別對(duì)病例組及對(duì)照組中所檢測(cè)到的SRD5A2基因多態(tài)性位點(diǎn)（rs523349、rs9282858和TA重復(fù)序列）的基因型分布頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)（表2）。結(jié)果提示這3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)其基因型在病例組及對(duì)照組中分布均符合Hardy-weinberg平衡（P＞0.05），說明本研究對(duì)象具有群體代表性。

2.2 SRD5A2基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在病例組和對(duì)照組中的分布 在病例組和對(duì)照組中均未發(fā)現(xiàn)SRD5A2基因rs9282858位點(diǎn)的AA基因型。兩組間SRD5A2基因位點(diǎn)rs523349和rs9282858的基因型和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而兩組間TA重復(fù)序列位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在病例組中含有9次TA重復(fù)的基因型［（TA）0（TA）9+（TA）9（TA）9］較對(duì)照組多見（P=0.033）。與攜帶0次TA重復(fù)［（TA）0］等位基因者相比，攜帶9次TA重復(fù)［（TA）9］等位基因者患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高（OR=2.181，95%CI：1.111 ～ 4.281，P=0.021），見表3。

3 討論

前列腺癌是一種雄激素依賴性疾病，雄激素在前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展中具有非常重要的作用，所以參與雄激素合成和代謝的基因都可能是前列腺癌的危險(xiǎn)因素［4］。睪酮5-α還原酶能夠在雄激素合成過程中將睪酮轉(zhuǎn)換為更具有活力的雙氫睪酮（DHT）［5］。其有睪酮5-α還原酶Ⅰ（SRD5A1）和

睪酮5-α還原酶Ⅱ（SRD5A2）兩種亞型，分別由SRD5A1和 SRD5A2基因編碼［5］。在兩者中，SRD5A2在雄激素敏感組織（例如：前列腺、睪丸）中具有高表達(dá)，并且能夠明顯增強(qiáng)DHT的生物活性以及與雄激素受體的親和力，所以SRD5A2可能對(duì)前列腺癌的發(fā)生產(chǎn)生影響，SRD5A2基因被認(rèn)為是前列腺癌發(fā)病重要的候選基因［6］。近10多年來，SRD5A2基因多態(tài)性和前列腺癌易感性之間的關(guān)系受到人們的廣泛關(guān)注。但是，這些研究大多集中于歐美人群，僅有少量中國漢族人群的研究報(bào)道，而缺乏我國少數(shù)民族人種的相關(guān)研究。彝族作為云南人口最多的少數(shù)民族之一，亦具有一定的前列腺癌發(fā)病率，在彝族人群中研究前列腺癌的易感性對(duì)于我們理解和治療該疾病都具有很重要的意義。

表2 SRD5A2基因多態(tài)性位點(diǎn)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)Tab.2 Hardy-Weinberg Genetic balance test of SRD5A2 gene polymorphic loci

表3 SRD5A2基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在病例組和對(duì)照組中的分布Tab.3 Distribution of genotype and allele frequencies in the case group and the control group of the SRD5A2 gene polymorphic loci 例（%）

SRD5A2基因位于2號(hào)常染色體短臂（2p23），全長(zhǎng)超過40 kb，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成［7］。目前已發(fā)現(xiàn)SRD5A2基因中存在多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn) ，但是rs523349（V89L）、rs9282858（A49T）和TA重復(fù)序列多態(tài)性是最常見的，也是被研究最多的［8］。rs523349（V89L）多態(tài)性是發(fā)生在SRD5A2基因第89密碼子的一個(gè)錯(cuò)義替代，GUA堿基中G變?yōu)镃，纈氨酸（Val）由亮氨酸（Leu）替代；rs9282858（A49T）多態(tài)性是發(fā)生在SRD5A2基因第49密碼子的另一個(gè)錯(cuò)義替代，GCC堿基中變?yōu)锳，丙氨酸（Ala）由蘇氨酸（Thr）替代，因此它們能夠通過氨基酸的替代來影響SRD5A2的活性［8］。而TA重復(fù)序列多態(tài)性位于SRD5A2基因的3′非編碼區(qū)，是一個(gè)長(zhǎng)度多態(tài)性，它不能影響所形成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，但是它可以通過改變mRNA的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)SRD5A2的產(chǎn)生［8］。

NWOSU等［9］研究顯示rs523349位點(diǎn)的錯(cuò)義替代發(fā)生率在高加索人中為8.5%，在非裔美國人中為2.5%，在臺(tái)灣人中為28%。一些研究發(fā)現(xiàn)rs523349位點(diǎn)的基因型分布與高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)人群前列腺癌發(fā)病率的分布相一致，CC基因型的發(fā)生率在亞洲人群中為22%～25%，而在高加索人群和非裔美國人群中僅為4%；但是GG基因型的發(fā)生率在亞洲人群中為27%～29%，而在高加索人群和非裔美國人群中卻為58%［10-11］。并且MAKRIDAKIS等［12］通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：同GG基因型相比，CC基因型能夠降低5-α還原酶42%的活性。但是關(guān)于法國和瑞士人群的研究卻發(fā)現(xiàn)CC基因型和前列腺癌的易感性相關(guān)［13-14］。LI等［6］通過對(duì)31個(gè)關(guān)于rs523349位點(diǎn)基因型的研究進(jìn)行Meta分析發(fā)現(xiàn)：同G等位基因相比，C等位基因和前列腺癌的易感性無關(guān)。與Meta分析結(jié)果相似，在本研究中rs523349位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布在前列腺癌組和對(duì)照組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的遼寧省漢族人群的研究結(jié)果一致［15］。

目前研究發(fā)現(xiàn)rs9282858位點(diǎn)丙氨酸（Ala）和蘇氨酸（Thr）的錯(cuò)義替代和前列腺癌的病理特點(diǎn)有關(guān)，它能夠增加5-α還原酶5倍的活性［16］。AA基因型在高加索人群中最常見（3.5%），其次為非裔美國人，亞洲人群或者拉美人群［16］。MAKRIDAKIS等［10］報(bào)道rs9282858位點(diǎn)的錯(cuò)義替代和非裔美國人群及拉美人群的高前列腺癌發(fā)病率顯著相關(guān)，并且在進(jìn)展性和預(yù)后不良的前列腺癌患者中過度表達(dá)。但是也有一些研究發(fā)現(xiàn)在高加索人群和亞洲人群中rs9282858多態(tài)性和前列腺癌的易感性無關(guān)［17-19］。本研究未發(fā)現(xiàn)rs9282858位點(diǎn)的AA基因型，并且GA基因型在前列腺癌組（8.2%）和對(duì)照組（6.7%）中的頻率也很低，rs9282858多態(tài)性與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)性無關(guān)。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的國內(nèi)北方漢族人群研究結(jié)果相似［20］。

本研究所涉及的3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中，TA重復(fù)序列多態(tài)性是相對(duì)研究較少的，至今為止，已發(fā)現(xiàn)至少10個(gè)TA重復(fù)序列多態(tài)性的等位基因［（TA）0，（TA）8，（TA）9，（TA）10，（TA）17，（TA）18，（TA）19，（TA）20，（TA）21，（TA）22］，但是僅有（TA）0，（TA）9和（TA）18這3個(gè)等位基因比較常見，而（TA）0是所有人群中最常見的，（TA）18僅出現(xiàn)在非裔美國人群中［7］。由于具有（TA）18等位基因的非裔美國人群比亞裔美國人群和高加索人群具有更高的前列腺癌發(fā)病率，并且在30個(gè)前列腺癌患者中有56%的患者存在這個(gè)位點(diǎn)的體細(xì)胞突變，因此這個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性可能和前列腺癌的易感性相關(guān)。目前TA重復(fù)序列長(zhǎng)度對(duì)5-α還原酶的影響還沒有在體外實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)。近年來一些研究發(fā)現(xiàn)（TA）9等位基因和前列腺癌的易感性相關(guān)［8］，但是也有一些研究發(fā)現(xiàn)TA重復(fù)序列長(zhǎng)度和前列腺癌的發(fā)病沒有相關(guān)性［21-22］。NTAIS等［23］通過Meta分析發(fā)現(xiàn)TA重復(fù)序列多態(tài)性可能對(duì)前列腺癌易感性有一定影響。在本組研究中，（TA）0等位基因是最常見的（病例組為89.3%，對(duì)照組為94.8%），沒有發(fā)現(xiàn)（TA）18等位基因，攜帶（TA）9等位基因者較攜帶（TA）0等位基因者患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高（OR=2.181，95%CI：1.111 ～ 4.281，P=0.021）。

本研究與其他一些學(xué)者研究的結(jié)果存在一定差異，可能與遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素在不同種族中的作用不同有關(guān)，也可能與不同人群基因多態(tài)性分布不均有關(guān)。本研究局限性主要是樣本含量較小，僅研究了云南彝族前列腺癌與SRD5A2基因多態(tài)性的關(guān)系，而缺乏多民族之間的比較，并且研究位點(diǎn)沒有包括其他和雄激素合成代謝相關(guān)的基因位點(diǎn)。為解決上述問題，我們可以加大樣本含量，將研究對(duì)象范圍擴(kuò)大到云南漢族、白族和傣族，進(jìn)行民族間的比較，并且將研究位點(diǎn)擴(kuò)大到雄激素受體（AR）基因多態(tài)性位點(diǎn)和維生素D受體（VDR）基因多態(tài)性位點(diǎn)。

綜上所述，本研究是首次對(duì)云南少數(shù)民族彝族人群進(jìn)行SRD5A2基因多態(tài)性與前列腺癌相關(guān)性研究，結(jié)果表明SRD5A2基因TA重復(fù)序列多態(tài)性與前列腺癌發(fā)病危險(xiǎn)相關(guān)。這為云南彝族前列腺癌的基因危險(xiǎn)因素研究提供了基礎(chǔ)，并且為后期我們?cè)黾訕颖竞縼砑訌?qiáng)我們結(jié)論的可靠性提供了方向。

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