急性白血病β-catenin與LEF1基因表達(dá)的相關(guān)性

王巍 劉文鑫 黃永彬 洪運(yùn)廣 楊志剛

1廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液病研究室（廣東湛江 524000）；2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院血液科實(shí)驗(yàn)室（上海 200437）

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一條在進(jìn)化中較為保守的通路，該通路活化后通過(guò)關(guān)鍵分子β-catenin與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF（T cell factor/Lymphoid enhancer factor）結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體、調(diào)控下游靶基因表達(dá)而發(fā)揮生物學(xué)作用，其異常激活與多種腫瘤包括急性白血?。╝cute leukemia，AL）發(fā)病相關(guān)［1-5］。脊椎動(dòng)物基因組一般都含有4種TCF/LEF，即LEF1、TCF1、TCF3和TCF4，其中LEF1與白血病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系較為密切［6-9］。為研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路是否通過(guò)β-catenin/LEF1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體在AL發(fā)病中發(fā)揮作用，本文檢測(cè)了AL患者β-catenin和LEF1的表達(dá)并分析了相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病例資料及細(xì)胞株 收集廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科2016年3月至2017年3月初診AL患者骨髓標(biāo)本85例，其中男56例、女29例，中位年齡39歲（10～79歲）。急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）62例，其中 M1 2例、M2 10例、M3 13例、M4 5例、M5 28例、M6 1例、AML未定型3例；急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）23例，其中 B-ALL 20例，T-ALL 3例，診斷符合張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》（第3版）。對(duì)照組20例為同期診治的非惡性血液病患者及造血干細(xì)胞移植供著（增生性貧血9例，原發(fā)免疫性血小板減少癥5例，感染性骨髓像3例，移植供著3例），其中男9例，女11例，中位年齡37.5歲（14～65歲）。人白血病細(xì)胞株K562、HL-60、Raji為廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液病研究室保存，THP-1細(xì)胞由廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科全娟花博士饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)置天津?yàn)笊锕荆籘RIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR@Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離及實(shí)時(shí)定量RT-PCR取抗凝骨髓液2～5 mL，淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，1×107細(xì)胞加1 mL TRIzol吹打混勻，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄cDNA。PCR引物用在線軟件primer 3設(shè)計(jì)好后由英濰捷基公司合成，β-catenin及內(nèi)參基因GAPDH引物序列同前［11］，LEF1上游引物：5′-AGGCCTCTACAACAAGGGAC-3′，下游引物：5′-TCCTGGAGAAAAGTGCTCGT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度208 bp。按TaKaRa公司SYBR@Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR 反應(yīng)，總體系 10 μL，其中 SYBR@Premix Ex TaqⅡ（2×）5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA 1 μL，滅菌超純水3.2 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)；之后進(jìn)行熔解曲線分析。計(jì)算2-ΔCT值作為各標(biāo)本mRNA相對(duì)表達(dá)量，ΔCT=目的基因CT值-內(nèi)參基因CT值。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) K562、HL-60、THP-1、Raji細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，取1×107細(xì)胞加1 mL TRIzol提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄，定量PCR檢測(cè)β-catenin及LEF1表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞株檢測(cè)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；病例標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果不符合正態(tài)分布，用中位數(shù)表示，組間比較用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量及方法可靠性分析 所提RNA經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)，A260nm/A280nm值均在1.8～2.0之間，純度好，可用于定量PCR檢測(cè)。熔解曲線分析顯示，各基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度均一，熔解峰為銳利的單一峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物均一，無(wú)非特異擴(kuò)增及引物二聚體（圖1）。

圖1 β-catenin、LEF1及GAPDH PCR反應(yīng)熔解曲線Fig.1 Resolving curves of β-catenin，LEF1 and GAPDH PCR products

2.2 AL患者β-catenin、LEF1 mRNA表達(dá)及相關(guān)性 β-catenin和LEF1在AML、ALL及對(duì)照組均可檢測(cè)到表達(dá)，β-catenin mRNA表達(dá)由高到低依次為ALL、AML和對(duì)照組，其中ALL與對(duì)照組、AML與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.008，P=0.003；Z=-2.333，P=0.020），ALL與AML之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.746，P=0.081）。LEF1 mRNA表達(dá)由高到低的依次為ALL、對(duì)照組和AML，ALL與對(duì)照組、AML與對(duì)照組、ALL與AML差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-5.430，P=0.000；Z=-3.191，P=0.001；Z=-6.781，P=0.000）（表1）。Spearman相關(guān)分析顯示，ALL、AML組β-catenin與LEF1 mRNA表達(dá)均呈正相關(guān)（r=0.526，P=0.010；r=0.420，P=0.001）。

2.3 AL細(xì)胞株β-catenin、LEF1 mRNA表達(dá) 三種AML細(xì)胞株，THP-1細(xì)胞β-catenin mRNA表達(dá)最高，LEF1表達(dá)最低；K562細(xì)胞β-catenin mRNA表達(dá)最低，LEF1表達(dá)最高；HL60細(xì)胞β-catenin、LEF1 mRNA表達(dá)介于前兩種細(xì)胞株之間。THP-1細(xì)胞β-catenin、LEF1 mRNA表達(dá)方向基本與AML患者一致，可作為研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路的AML細(xì)胞模型。Raji細(xì)胞與AML細(xì)胞株相比βcatenin mRNA表達(dá)最低，LEF1表達(dá)也最低，基本檢測(cè)不到。Raji細(xì)胞株β-catenin、LEF1 mRNA表達(dá)方向與ALL患者不同，不宜作為研究Wnt/βcatenin信號(hào)通路的ALL細(xì)胞模型（表1）。

3 討論

Wnt通路是一條在進(jìn)化中較為保守的信號(hào)通路，分為經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路、非經(jīng)典的Wnt/Ca2+和Wnt/PAP（planar cell polarity，平面細(xì)胞極性）通路，其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路研究較多。Wnt/β-catenin通路簡(jiǎn)單地說(shuō)由胞外因子（Wnt蛋白）、跨膜受體（frizzled蛋白和LRP5/6）、胞內(nèi)蛋白復(fù)合體（APC、Axin、GSK-3β、CK1、β-catenin等）、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（TCF/LEF）、下游靶基因等組成，其中β-catenin是關(guān)鍵分子、TCF/LEF是轉(zhuǎn)錄調(diào)控開(kāi)關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化后β-catenin降解減少，胞漿中增多的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體、調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮該通路的調(diào)控作用。

表1 β-catenin和LEF1 mRNA在AL、對(duì)照組和細(xì)胞株中的表達(dá)Tab.1 Expressions of β-catenin and LEF1 mRNA in AL groups，control group and cell lines

TCF/LEF家族中LEF1參與淋巴細(xì)胞分化［10-11］、粒系發(fā)育［12］，與白血病發(fā)生發(fā)展關(guān)系較密切，比如過(guò)表達(dá)LEF1基因的小鼠可發(fā)展成為B-ALL或免疫球蛋白重鏈D-J重排的AML［7］，成人B-ALL患者高表達(dá) LEF1預(yù)后不良［8］，正常核型AML患者LEF1高表達(dá)預(yù)后良好［9］等。急性白血病存在Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活［13-14］，該通路激活后β-catenin是否與LEF1結(jié)合發(fā)揮致白血病作用呢？為研究該問(wèn)題，本文檢測(cè)了AL患者β-catenin和LEF1的表達(dá)及相關(guān)性。結(jié)果顯示，ALL患者βcatenin、LEF1 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組，并且兩者表達(dá)呈正相關(guān)，提示β-catenin/LEF1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體可能在ALL發(fā)病中發(fā)揮作用。而AML則不然，與對(duì)照組相比，β-catenin mRNA表達(dá)增高，LEF1 mRNA表達(dá)降低，兩個(gè)基因表達(dá)方向雖不同，但相關(guān)分析顯示仍呈正相關(guān)。ALL患者LEF mRNA表達(dá)上調(diào)與JIA等［15］的研究結(jié)果一致。AML患者表達(dá)下調(diào)與GANDILLET等［16］的研究結(jié)果基本一致，該研究用qPCR方法檢測(cè)了7例β-catenin表達(dá)較豐富的AML患者84個(gè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因，與正常骨髓CD34+細(xì)胞相比，AML患者LEF1 mRNA表達(dá)下調(diào)。而FU等［17］的研究結(jié)果則相反，該研究比較了101例AML患者和20例健康對(duì)照LEF1 mRNA表達(dá)，顯示AML患者高于對(duì)照組。METZELER等［9］、ALBANO等［18］分別研究了LEF1 mRNA表達(dá)對(duì)正常核型AML、急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）患者預(yù)后的影響，但均未與對(duì)照組比較（未設(shè)對(duì)照）。目前LEF1在AL中表達(dá)研究還較少，而且本實(shí)驗(yàn)、GANDILLET 等［16］和FU等［17］所設(shè)置的對(duì)照不同，依次為非惡性血液病和移植供著、正常骨髓CD34+細(xì)胞、健康人，因此LEF1在AML中的表達(dá)是上調(diào)還是下調(diào)尚難下定論。LEF1至少有2種剪接體，一種為全長(zhǎng)型，具有轉(zhuǎn)錄激活作用；另一種為截短型（缺乏β-catenin結(jié)合位點(diǎn)），對(duì)轉(zhuǎn)錄具有抑制作用［7］。本實(shí)驗(yàn)PCR檢測(cè)的是總LEF mRNA，F(xiàn)U等［17］未標(biāo)明檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄本，METZELER 等［9］和 ALBANO 等［18］檢測(cè)的也是總LEF mRNA，因此LEF1在AML患者表達(dá)研究還需增加全長(zhǎng)型LEF檢測(cè)更準(zhǔn)確地進(jìn)行。另外，本研究結(jié)果還顯示THP-1細(xì)胞β-catenin、LEF1 mRNA表達(dá)方向基本與AML患者一致，可作為研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路的AML細(xì)胞模型。

綜上所述，AL患者有Wnt/β-catenin路通的異常激活，β-catenin/LEF1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體可能在ALL發(fā)病中發(fā)揮作用，LEF1在AML中的表達(dá)還需擴(kuò)大樣本量、增加全長(zhǎng)型LEF1檢測(cè)、規(guī)范對(duì)照設(shè)置進(jìn)一步研究。

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