七氟醚對單肺通氣大鼠肺癌HIF-1α/EMT通路活性及侵襲力的影響

熊艷峰 賴曉紅 梁樺 張濤 周橋靈 楊承祥

佛山市第一人民醫(yī)院麻醉科（廣東佛山528000）

肺癌是全球發(fā)生率最高的呼吸道惡性腫瘤，外科切除是治療肺癌的主要方法之一。單肺通氣（OLV）常用于肺癌手術(shù)麻醉，OLV過程中非通氣側(cè)肺組織處于低氧狀態(tài)，并可上調(diào)正常大鼠肺組織HIF-1α表達(dá)［1］。研究證實，低氧環(huán)境上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）/上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）通路活性后，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［2-3］。目前，OLV對大鼠肺癌HIF-1α/EMT通路活性及侵襲力有何影響尚不明確。本研究擬探討OLV對大鼠肺癌HIF-1α/EMT信號通路活性及侵襲力的影響，并觀察七氟醚的干預(yù)效應(yīng)，為臨床麻醉提供參考。

1 材料與方法

1.1 大鼠肺癌模型建立 KM小鼠和SD大鼠由中山大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2011-0129。參照文獻(xiàn)［4］，Walker-256乳腺癌細(xì)胞（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院）置于含10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，制成1×107/mL細(xì)胞懸液，接種到KM小鼠腹腔（0.2 mL/只），1周內(nèi)出現(xiàn)腹水。SD雄性大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量220～250 g。無菌注射器抽取KM小鼠Walker-256細(xì)胞腹水，生理鹽水稀釋后細(xì)胞計數(shù)，制成0.5×105/mL濃度。經(jīng)SD大鼠尾靜脈注射腹水細(xì)胞懸液，0.2 mL/只。

1.2 動物分組與處理 尾靜脈注射癌細(xì)胞3周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將造模大鼠分為4組［n=6：對照組（C組）、雙肺通氣組（T組）、單肺通氣組（O組）和七氟醚復(fù)合單肺通氣組（SO組）］。參照文獻(xiàn)［5］，腹腔注射10%水合氯醛4 mL/kg麻醉，固定于仰臥位。氣管切開后行氣管內(nèi)插管，O組用插管過深法將氣管導(dǎo)管插入右側(cè)主支氣管，連接小動物呼吸機(jī)（型號：HX-l00E，成都泰盟科技有限公司）行右側(cè)OLV 2.0 h，將氣管導(dǎo)管退至主氣管，行雙肺通氣0.5 h。呼吸參數(shù)設(shè)置：吸呼比=1∶1，F(xiàn)iO2=100%，OLV時通氣頻率80次/min，潮氣量6 mL/kg；雙肺通氣時通氣頻率60次/min，潮氣量10 mL/kg。股動脈行穿刺置管，監(jiān)測HR、MAP。T組大鼠行雙肺通氣2.5 h。O組行右肺OLV 2.0 h、雙肺通氣0.5 h。SO組大鼠置于有進(jìn)氣口和出氣口的密閉容器，進(jìn)氣口接入純氧氣和七氟醚揮發(fā)罐，出氣口接麻醉氣體監(jiān)測儀（PM8060，Dr?ger，德國）。吸入2.6%濃度七氟醚（批號：S196L513，Baxter，美國）。通氣期間，大鼠SpO2均 ＞ 95%，PetCO2維持在35～45 mmHg。于雙肺通氣0.5 h時處死大鼠，所有大鼠肺表面均可見肺癌結(jié)節(jié)，證實肺癌造模成功，收集左肺。

1.3 Western blot檢測 取左肺組織，顯微鏡下仔細(xì)分離腫瘤，Western blot法分別檢測HIF-1α、Fibronectin、Vimentin的蛋白表達(dá)。

1.4 RT-PCR檢測 按照試劑盒（Invitrogen公司，美國）操作步驟，TRIzol法抽提肺腫瘤總RNA，應(yīng)用UV-2000分光光度計（UNIKO公司，美國）評估樣品RNA的純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。建立PCR反應(yīng)體系。MMP-2上游引物：5′-ACAAGTGGTCCGCGTAAAGT-3′，下游引物：5′-GTAAACAAGGCTTCATGGGGG-3′；MMP-9上游引物：5′-CATTCGCGTGGATAAGGAGT-3′，下游引物：5′-ACCTGGTTCACCTCATGGTC-3′；GAPDH 上游引物：5′-CCAATGTGTCCGTCGCGTGGATCT-3′，下游引物：5′-GTTGAAGTCGCAGGAGACAACC-3′。采用熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）測定Ct值，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 14.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組HIF-1α、Vimentin、Fibronectin比較與C組、T組比較，O組、SO組HIF-1α、Vimentin、Fibronectin蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與O組比較，SO組HIF-1α、Vimentin、Fibronectin蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；C組和T組的HIF-1α、Vimentin、Fibronectin蛋白表達(dá)水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1和圖1。

表1 4組HIF-1α、Vimentin、Fibronectin蛋白表達(dá)比較Tab.1 The comparison of protein levels of HIF-1α，Vimentin and Fibronectin（n=6） ± s，%

表1 4組HIF-1α、Vimentin、Fibronectin蛋白表達(dá)比較Tab.1 The comparison of protein levels of HIF-1α，Vimentin and Fibronectin（n=6） ± s，%

注：與C組比較，*P＜0.05；與O組比較，#P＜0.05

組別C組T組O組SO組HIF-1α 25.3±2.8 22.7±2.5 91.2±10.7*39.8±6.6*#Vimentin 8.9±1.4 10.2±1.6 87.3±10.8*23.7±3.5*#Fibronectin 13.4±2.8 12.7±3.1 98.1±12.9*43.5±6.9*#

圖1 4組大鼠肺癌組織HIF-1α、Vimentin、Fibronectin蛋白印跡圖Fig.1 The Western Blot of HIF-1α，Vimentin and Fibronectin in lung cancer of rats

2.2 4 組MMP-2和MMP-9表達(dá)的比較 與C組和T組比較，O組、SO組MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與O組比較，SO組MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；C組和T組的MMP-2和MMP-9表達(dá)水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

3 討論

HIF-1是由α、β亞基構(gòu)成一種低氧信號傳遞因子。低氧環(huán)境誘導(dǎo)HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)，與HIF-1β形成二聚體后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。EMT是指上皮細(xì)胞失去上皮特性獲得間質(zhì)細(xì)胞表型和主動轉(zhuǎn)移特性的一種生物學(xué)現(xiàn)象，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。腫瘤低氧微環(huán)境誘導(dǎo)產(chǎn)生HIF-1α，后者可直接調(diào)控與EMT過程有關(guān)的基因，促進(jìn)EMT轉(zhuǎn)化過程［2-3］。EMT過程中伴隨間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin、Fibronectin上調(diào)，檢測Vimentin、Fibronectin的表達(dá)水平可評價上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［6］。MMP-2和MMP-9屬于鋅依賴性蛋白水解酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，反映腫瘤的侵襲力［7-8］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OLV明顯上調(diào)肺癌組織HIF-1α、Vimentin、Fibronectin、MMP-2和MMP-9表達(dá)水平，提示OLV可上調(diào)肺癌HIF-1α/EMT通路活性，增加腫瘤侵襲力。

表2 四組MMP-2和MMP-9表達(dá)的比較Tab.2 The comparison of levels of MMP-2 and MMP-9（n=6） x±s

筆者之前研究證實，七氟醚抑制離體肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移能力，并可通過下調(diào)HIF-1α抑制低氧誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移［9-10］，因此本研究選擇七氟醚作為干預(yù)藥物。臨床上七氟醚常用濃度為1～2 MAC，因此本研究選擇1.5 MAC處理OLV大鼠。本研究發(fā)現(xiàn)，OLV大鼠接受七氟醚處理后，肺癌組織HIF-1α、Vimentin、Fibronectin、MMP-2和MMP-9表達(dá)水平下調(diào)，提示七氟醚可抑制OLV上調(diào)肺癌HIF-1α/EMT通路活性和侵襲力的作用。

腫瘤細(xì)胞在手術(shù)期間播散進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)成為循環(huán)腫瘤細(xì)胞是導(dǎo)致術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因［11-12］。EMT是產(chǎn)生循環(huán)腫瘤細(xì)胞的重要途徑［13-15］。本研究結(jié)果提示，OLV有可能增加腫瘤細(xì)胞在手術(shù)期間血循環(huán)播散的風(fēng)險。但本研究屬于基礎(chǔ)研究，無外科手術(shù)介入，未能充分模擬臨床。七氟醚和OLV對肺癌患者外科手術(shù)期間腫瘤細(xì)胞侵襲性的影響還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，OLV上調(diào)大鼠肺癌HIF-1α/EMT通路活性及侵襲力，七氟醚可抑制OLV上調(diào)大鼠肺癌HIF-1α/EMT號通路活性及侵襲力的作用。

［1］LIN F，PAN L H，RUAN L，et al.Differential expression of HIF-1α，AQP-1，and VEGF under acute hypoxic conditions in the non-ventilated lung of a one-lung ventilation rat model［J］.Life Sci，2015，124（124）：50-55.

［2］YANG S W，ZHANG Z G，HAO Y X，et al.HIF-1α induces the epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer stem cells through the Snail pathway［J］.Oncotarget，2017，8（6）：9535-9545.

［3］SHAIKH D，ZHOU Q，CHEN T，et al.cAMP-dependent protein kinase is essential for hypoxia-mediated epithelial-mesenchymal transition，migration，and invasion in lung cancer cells［J］.Cell Signal，2012，24（12）：2396-2406.

［4］黃文革，李婕，陳鳳英，等.大鼠Walker256移植性肺癌模型的建立［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（4）：64-67.

［5］LEITE C F，CALIXTO M C，TORO I F，et al.Characterization of pulmonary and systemic inflammatory responses produced by lung re-expansion after one-lung ventilation［J］.J Cardiothorac Vasc Anesth，2012，26（3）：427-432.

［6］RIBATTI D.Epithelial-mesenchymal transition in morphogenesis，cancer progression and angiogenesis［J］.Exp Cell Res，2017，353（1）：1-5.

［7］LEE W，NAM J H，CHO H J，et al.Epimedium koreanum Nakai inhibits PMA-induced cancer cell migration and invasion by modulating NF-κB/MMP-9 signaling in monomorphic malignant human glioma cells［J］.Oncol Rep，2017，38（6）：3619-3631.

［8］徐楓，黃瓊，張濤，等.異氟醚和七氟醚麻醉患者血清對人肺腺癌A549細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（20）：3432-3434.

［9］LIANG H，YANG C X，ZHANG B，et al.Sevoflurane suppresses hypoxia-induced growth and metastasis of lung cancer cells via inhibiting hypoxia-inducible factor-1α［J］.J Anesth，2015，29（6）：821-830.

［10］LIANG H，WANG H B，LIU H Z，et al.The effects of combined treatment with sevoflurane and cisplatin on growth and invasion of human adenocarcinoma cell line A549［J］.Biomed Pharmacother，2013，67（6）：503-509.

［11］PESTA M，F(xiàn)ICHTL J，KULDA V，et al.Monitoring of circulating tumor cells in patients undergoing surgery for hepatic metastases from colorectal cancer［J］.Anticancer Res，2013，33（5）：2239-2243.

［12］BAYARRI-LARA C，ORTEGA F G，CUETO LADRóN DE GUEVARA A，et al.Circulating tumor cells identify early recurrence in patients with Non-Small cell lung cancer undergoing radical resection［J］.PLoS One，2016，11（2）：e0148659.

［13］MICALIZZI D S，HABER D A，MAHESWARAN S.Cancer metastasis through the prism of epithelial-to-mesenchymal transition in circulating tumor cells［J］.Mol Oncol，2017，11（7）：770-780.

［14］JIE X X，ZHANG X Y，XU C J.Epithelial-to-mesenchymal transition，circulating tumor cells and cancer metastasis：Mechanisms and clinical applications［J］.Oncotarget，2017，8（46）：81558-81571.

［15］CHEN J，CAO S W，CAI Z，et al.Epithelial-mesenchymal transition phenotypes of circulating tumor cells correlate with the clinical stages and cancer metastasis in hepatocellular carcinoma patients［J］.Cancer Biomark，2017，20（4）：487-498.