PDGFR在裸鼠腎癌模型中表達(dá)的意義

王世鳳 黃欣欣 白淘

舒尼替尼作用在晚期腎癌的療效已非常顯著，目前在《診療指南》[1]中明確指出：臨床晚期一線用藥，A類推薦。同時(shí)有報(bào)道指出：有20%～30%的局限性腎癌術(shù)后出現(xiàn)進(jìn)展。隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展、人民群眾健康意識的提高，越來越多的腎癌患者被早期發(fā)現(xiàn)。山西地區(qū)的多中心研究[2]也證實(shí)了這一點(diǎn)。本研究通過動物實(shí)驗(yàn)，了解早期靶向藥物使用的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞，雄性BALB/C裸鼠42只，舒尼替尼，穿刺針，即用型免疫組化試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 腎癌786-O細(xì)胞接種、傳代培養(yǎng)。

1.2.2 動物模型的建立 將癌細(xì)胞懸浮于PBS中，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107個(gè)/ml，取0.1 ml注射入裸鼠背部皮下。

1.2.3 動物模型的檢驗(yàn) 用活檢穿刺針取腫瘤，病理證實(shí)。分別于第5、20、35天和/或死亡后穿刺活檢。

1.2.4 分組 按照不同給藥干預(yù)時(shí)間分三組，每組裸鼠10只，模擬早、中、晚期給藥，同時(shí)設(shè)立對照組裸鼠12只。

1.2.5 給藥方式 給藥組按7.5 mg/（kg·d）灌食，對照組給予等體積蒸餾水，分別于對應(yīng)天數(shù)測定瘤組織中相關(guān)蛋白表達(dá)與否、腫瘤大小、記錄生存時(shí)間，并于每次穿刺檢測后開始下一組給藥。

1.2.6 相關(guān)指標(biāo)的蛋白表達(dá)測定 HIF，VEGF，VEGFR，PDGFR。

1.2.7 HE染色、免疫組化染色實(shí)驗(yàn)步驟 步驟（Envision法）略。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 給藥前四組之間各檢測指標(biāo)陽性率及體積比較 [n（%）]（±s）

表1 給藥前四組之間各檢測指標(biāo)陽性率及體積比較 [n（%）]（±s）

早期給藥組 10 4（40.0） 7（70.0） 7（70.0） 9（90.0） 151.60±5.38中期給藥組 10 5（50.0） 7（70.0） 7（70.0） 8（80.0） 151.10±5.44晚期給藥組 10 6（60.0） 6（60.0） 6（60.0） 8（80.0） 150.60±4.84對照組 12 6（50.0） 8（66.7） 7（58.3） 8（66.7） 151.42±5.38 χ2/F值 - 0.800 0.472 0.683 1.776 0.070 P值 - 0.849 1.000 0.920 0.687 0.975

表2 給藥后第4次檢測四組之間各檢測指標(biāo)陽性率及體積比較 [n（%）]（±s）

表2 給藥后第4次檢測四組之間各檢測指標(biāo)陽性率及體積比較 [n（%）]（±s）

早期給藥組 10 5（50.0） 7（70.0） 4（40.0） 4（40.0） 146.20±4.46中期給藥組 10 6（60.0） 6（60.0） 4（40.0） 4（40.0） 147.20±4.69晚期給藥組 10 7（70.0） 9（90.0） 5（50.0） 6（60.0） 151.90±5.22對照組 12 7（58.3） 10（83.3） 9（75.0） 12（100.0） 158.58±3.58 χ2/F值 - 0.950 2.918 3.693 12.468 356.106 P值 - 0.906 0.443 0.284 0.004 ＜0.001

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多于兩組樣本均數(shù)的比較，采用方差分析（ANOVA）；計(jì)數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。不同指標(biāo)之間相關(guān)性采用Spearman秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥后各組之間相關(guān)因子表達(dá)情況及腫瘤大小比較

由表1可見，經(jīng)χ2、Fisher’s確切概率法檢驗(yàn)，各組之間在給藥前HIF、VEGF、VEGFR、PDGFR陽性表達(dá)率對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；經(jīng)ANOVE方差分析，各組之間腫瘤體積大小對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.070，P=0.975）。提示各組之間在給藥前各指標(biāo)均衡可比。

2.2 給藥后各組之間相關(guān)因子表達(dá)情況及腫瘤大小比較

對各組之間第4次穿刺結(jié)果進(jìn)行比較。由表2可見，各組之間PDGFR陽性表達(dá)率對比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.468，P=0.004），早期給藥組和中期給藥組陽性表達(dá)率最低。經(jīng)相關(guān)分析，PDGFR陽性表達(dá)率與給藥時(shí)間呈正相關(guān)（r=0.485，P=0.001）。

經(jīng)ANOVE方差分析，各組之間腫瘤體積大小對比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=356.106，P＜0.001）。經(jīng)兩兩比較，對照組腫瘤體積均大于各給藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；晚期給藥組腫瘤體積分別大于早期、中期給藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，給藥時(shí)間與終期腫瘤大小呈正相關(guān)（r=0.491，P=0.006）。

3 討論

腎癌的生長和侵襲是一個(gè)復(fù)雜的過程[3-4]。VHL-HIF-EPO通路中靶基因VEGF轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)增強(qiáng)，并上調(diào)了VEGFR的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)[5-6]。TKI在腎癌中因其雙向抑制作用，成為轉(zhuǎn)移性腎癌的一線用藥，特別是VEGFR3 rs307826野生純合子型（AA型），患者進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)降低72%，本團(tuán)隊(duì)在前期實(shí)驗(yàn)過程中，SNP檢測15例患者均為AA型。本團(tuán)隊(duì)與國內(nèi)前期檢測結(jié)果[7]相似，遠(yuǎn)高于歐美83.1%檢出率，眾多國內(nèi)外數(shù)據(jù)顯示[8-9]：在蘋果酸舒尼替尼基于基因水平的靶向治療腎細(xì)胞癌方面，國人較歐美人群可獲得更多收益。國內(nèi)單中心研究[10-12]數(shù)據(jù)：進(jìn)一步證實(shí)TKI在中國晚期腎癌中療效確切。由于缺乏用藥指標(biāo)，遺憾的是尚無可推薦的標(biāo)準(zhǔn)輔助治療方案使局部進(jìn)展期和局限性腎癌手術(shù)患者獲益，有20%～30% T1b～T2期患者腎癌手術(shù)后1～2年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，16%的腎癌會局部進(jìn)展，術(shù)后40%腎癌會復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。

本研究結(jié)果顯示，造模成功后第一次穿刺組織經(jīng)多種統(tǒng)計(jì)方法證實(shí)：各組之間在HIF、VEGF、VEGFR、PDGFR陽性表達(dá)率及腫瘤大小對比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示各組之間在給藥前各指標(biāo)均衡可比。對各組及各組之間4次穿刺結(jié)果進(jìn)行比較：早期、中期給藥組較其它組顯示，給藥時(shí)間越長，PDGFR陽性表達(dá)率越低，腫瘤體積越小。晚期給藥PDGFR、腫瘤體積變化不顯著，提示早期給藥較晚期給藥可以更好地抑制癌細(xì)胞的進(jìn)展。而HIF、VEGF及其受體的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與相關(guān)研究相悖，可能的原因與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)動物例數(shù)少有關(guān)；腫瘤體積在種植成功至第一次穿刺時(shí)變化較大，可能的原因是種植于鼠背皮下相對疏松的組織，在種植形成皮丘過程中加劇了周圍組織的水腫，使得癌細(xì)胞有了更適宜的生長空間，10～15天，種植造成的水腫環(huán)境被機(jī)體代償、吸收，所以當(dāng)腫瘤體積達(dá)到150 mm時(shí)各組都出現(xiàn)生長相對緩慢 。

綜上所述，早期靶向藥物干預(yù)較晚期干預(yù)，對于控制疾病進(jìn)展有明顯的作用。目前擺在面前的問題是：如何將未來會有疾病進(jìn)展的患者篩選出來。

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