耐冬山茶基因組DNA的提取及CDDP引物的篩選

雋逸豪 ，王紹霞 ，李春艷 ，馬 燕 ，臧德奎 *

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東 泰安 271018；2.棗莊市山亭區(qū)國有山亭林場，山東 棗莊 277200；3.棗莊市山亭區(qū)林業(yè)局，山東 棗莊 277200）

山茶（Camellia japonica）是我國十大名花之一，栽培歷史悠久，品種繁多，具有極高的觀賞價值與經(jīng)濟價值。其野生種群僅分布于江西、浙江、臺灣、四川、山東等省區(qū)，山東為其自然分布的北界，僅見于山東青島近海島嶼大管島、長門巖島，與大葉胡頹子（Elaeagnus macrophylla）等植物形成常綠闊葉矮林，這種特殊的生物地理現(xiàn)象對于研究植物區(qū)系分布和山茶屬的系統(tǒng)演化具有重要意義[1]。該地區(qū)的野生山茶又稱“耐冬”，是一種北方罕有的冬季觀花植物，也是山茶育種的珍貴種質(zhì)資源。由于生境的破壞及對現(xiàn)有資源的不合理開發(fā)利用，現(xiàn)存的野生山茶數(shù)量越來越少，亟待保護。

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，影響物種的長期存在與進化，已經(jīng)成為生物多樣性研究的熱點內(nèi)容之一[2]?，F(xiàn)代分子標記技術(shù)是植物遺傳育種研究的重要工具，基因組DNA的提取質(zhì)量是影響實驗成敗的關(guān)鍵因素[3]。山茶葉片中含有多種次生代謝物質(zhì)，如酚類、多糖等，這些物質(zhì)的存在很大程度上影響了其基因組DNA的提取和分離，因此，選擇適當?shù)奶崛》椒ㄒ詼p輕這些物質(zhì)對所得基因組DNA的影響是一項十分重要的工作。

CDDP標記是Collard和Mackill等于2009年開發(fā)的一種基于DNA保守序列的新型分子標記方法，是基于單引物擴增反應(yīng)的標記技術(shù)。在植物的基因或基因家族中的保守氨基酸序列是典型的保守結(jié)構(gòu)功能區(qū)域，其對應(yīng)的DNA序列在不同物種間也是相當保守的。根據(jù)這些保守序列設(shè)計引物，實現(xiàn)對樣本的PCR擴增。該技術(shù)具有操作簡單、應(yīng)用成本低、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好等優(yōu)點，其引物具有通用性，能產(chǎn)生豐富的遺傳信息[4]。在遺傳育種、親緣關(guān)系分析、品種分類鑒定工作中有重要作用。目前已應(yīng)用于水稻（Oryza sativa）[5]、歐白英（Solanum dulcamara）[6]、 牡丹 （Paeonia suffruticosa）[7-8]、 菊花（Chrysanthemum×morifolium）[9]等植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。目前國內(nèi)外對山茶的研究多采用ISSR[10]、AFLP[11]、等位酶技術(shù)[12]等技術(shù)手段 ，未見CDDP技術(shù)應(yīng)用于該領(lǐng)域的報道。

本實驗力圖找到適宜的耐冬山茶基因組DNA提取方法，篩選出高效的CDDP引物，為耐冬山茶的遺傳多樣性研究提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 耐冬山茶基因組DNA的提取

1.1.1 實驗材料

實驗材料為采自大管島、長門巖島的共110份山茶幼嫩葉片。采集后立即加入硅膠干燥，密封保存于-20℃冰箱待用。

1.1.2 實驗儀器

低溫高速離心機；電泳儀；水浴鍋；紫外分光光度計；凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.1.3 試劑

EDTA（pH 8.0）；Tris-HCl（pH 8.0）；2×CTAB 緩沖液（配方見表 1）；提取介質(zhì)（配方見表 2）；PVP；β-巰基乙醇；氯仿-異戊醇（v：v=24：1）；70%乙醇；無水乙醇；1×TE；雙蒸水（ddH2O）；NaAc。

表 1 2×CTAB緩沖液配方Table1 The formulation of 2×CTAB buffer solution

表2 提取介質(zhì)配方Table 2 The formulation of extraction medium

1.1.4 實驗方法

1.1.4.1 準備工作

①將離心管、移液器槍頭、提取介質(zhì)等進行高壓蒸汽滅菌；②將離心管（2 mL、1.5 mL）標好編號；③打開水浴鍋升溫至65℃，將2×CTAB緩沖液置于水浴鍋中預(yù)熱備用；④用液氮預(yù)冷研缽和藥匙。

1.1.4.2 DNA 的提取

①稱取樣品0.2 g倒入滅菌干燥的研缽中，加入約30 mL液氮，少量PVP進行研磨。重復(fù)加入液氮2-3次充分研碎使樣品呈均勻粉末狀，迅速轉(zhuǎn)移至裝有1 mL提取介質(zhì)的2 mL離心管中，冰盒內(nèi)靜置10 min。使用低溫高速離心機7000 r/min，4℃條件下離心10 min。②棄去上清液。向沉淀中再次加入1 mL提取介質(zhì)，震蕩至沉淀散開，放入冰盒，靜置 10 min。7000 r/min，4℃條件下離心 10 min。③棄去上清液，向沉淀中加入40 μL β-巰基乙醇，800 μL CTAB搖勻至沉淀散開，放入65℃水浴鍋中水浴加熱60 min，15 min左右顛倒混勻一次。④處理完畢后將離心管從水浴鍋中取出，冷卻至室溫，加入 400 μL TRIS 平衡酚，400 μL 氯仿異戊醇 （v：v=24：1），混勻，室溫下放置 10 min。 12000 r/min，4 ℃條件下離心10 min。⑤取上清液800 μL（每次取200 μL）加入新的2 mL離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇（v：v=24：1），輕輕轉(zhuǎn)搖試管使溶液充分混勻，10 min。12000 r/min，4 ℃條件下離心 10 min。⑥觀察離心管中液體，若中間蛋白層較多可重復(fù)步驟⑤。若蛋白質(zhì)去除已較完全，用剪去尖端的1 mL槍頭取上清液 400 μL（每次取 100 μL）轉(zhuǎn)移到 1.5 mL離心管中，先加入 1/10 體積（40 μL）的 NaAc，再加入 2 倍體積（800 μL）的無水乙醇（-20 ℃），-20 ℃放置20 min。取出離心管，12000 r/min，4℃條件下離心3 min。⑦棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2～3次，室溫下干燥，使乙醇揮發(fā)。每管加入50 μL 1×TE溶解沉淀，-20℃保存。

1.1.5 DNA樣品的檢測

使用瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度法檢測所得DNA樣品。檢測前在樣品中加入RNA酶1μL，37℃水浴1 h，除去RNA。

1.1.5.1 瓊脂糖凝膠電泳

圖1 部分DNA樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

取 5 μL DNA 樣品， 加入 2 μL 6 × Loading Buffer混勻，在0.8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓120 V，30 min。電泳結(jié)束后EB染色5min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察采集圖像。

1.1.5.2 紫外分光光度法

光吸收比是檢驗DNA純度的重要指標，純凈的DNA的A260/A280為1.80左右。使用紫外分光光度計檢測DNA樣品在260 mm、280 mm波長處的吸收值。

1.2 CDDP引物的篩選

實驗使用的CDDP引物由上海生工生物有限公司公司合成，編號見表3。

1.2.1 CDDP-PCR體系

選取大管島、長門巖島兩個地區(qū)的4份樣品，通過數(shù)次反應(yīng)體系試驗確定最佳PCR反應(yīng)體系為2×Es Taq MasterMix（含染料）酶 10 μL、10 pmol·μL-1引物 1.0 μL、30 ng·μL-1DNA 模板 2.0 μL 及 ddH2O7μL。

表3 21條CDDP引物信息Table 3 The imformation of 21 CDDP primers

反應(yīng)過程為94℃預(yù)變性3 min；94℃變性 1 min，50℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，35個循環(huán)；72℃后延伸5 min。

1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測

取6 μL擴增產(chǎn)物，以5 V/cm的電壓在2%瓊脂糖凝膠上電泳1～2 h，EB染色5 min，使用凝膠分析系統(tǒng)觀察采集圖像。

2 結(jié)果分析

2.1 基因組DNA的提取

對提取的DNA樣品的檢測結(jié)果表明，改良CTAB法得到的DNA電泳帶形好，主帶清晰，無彌散現(xiàn)象（圖1）。DNA樣品的A260/A280在1.71～1.84之間，純度高。

2.2 CDDP引物的篩選

據(jù)21條CDDP引物的擴增結(jié)果 （表4），引物Pr2、Pr11、Pr12、Pr18 未擴增出任何條帶， 引物 Pr21擴增條帶少，多態(tài)性不高；引物 Pr8、Pr13、Pr15、Pr17、Pr19雖得到數(shù)量較多的條帶，但其多態(tài)性比率不高。其余引物均得到清晰且多態(tài)性豐富的條帶。引物Pr3、Pr5、Pr9的多態(tài)性比率最高達100%。綜合引物的鑒別力及擴增效果，從21條引物種篩選 出 11 條 （Pr1、Pr3、Pr4、Pr5、Pr6、Pr7、Pr9、Pr10、Pr14、Pr16、Pr20）多態(tài)性好，條帶清晰的引物用于后續(xù)的CDDP分子標記。其中，多態(tài)性比率最的為Pr3、Pr5、Pr9， 態(tài)性比率達100%， 最低的 Pr4，為71.43%。

3 討論

高質(zhì)量的基因組DNA是開展植物分子生物學(xué)研究之基礎(chǔ)，由于植物細胞化學(xué)成分的差異，對其基因組DNA的提取需要采取不同策略[13]。本實驗根據(jù)山茶葉片次生代謝產(chǎn)物多，難以獲得高質(zhì)量的基因組DNA的特點，在在傳統(tǒng)的CTAB及多種改良CTAB法的基礎(chǔ)上進行改進[14]，如加入PVP、β-巰基乙醇等還原性物質(zhì)消除酚類氧化對DNA的影響；延長加入CTAB后的水浴時間使細胞膜充分裂解，釋放更多的 DNA；增加使用氯仿-異戊醇（v：v=24：1）的抽提次數(shù)，充分除去葉片中的蛋白質(zhì)；用乙醇洗滌沉淀前加入3 mol·μL-1的NaAc溶液，除去多糖。經(jīng)檢測，采用本法所得耐冬山茶基因組DNA的純度和得率均較高，能夠滿足分子實驗要求。

CDDP作為一種新型分子標記技術(shù)，具有操作簡便、穩(wěn)定性和重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、引物具有通用性等優(yōu)勢[5]，在物種親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析中有重要應(yīng)用價值。本實驗使用21條CDDP引物對隨機選取的大管島、長門巖島的山茶基因組DNA在 20 μL ，包含 2×Es Taq MasterMix（含染料）酶 10 μL、10 pmol·μL-1引物 1.0 μL、30 ng·μL-1DNA 模板2.0 μL及ddH2O 7 μL的反應(yīng)體系下進行擴增。共得到11條條帶清晰、多態(tài)性豐富、鑒別力強的引物，用于后續(xù)的CDDP分子標記。在11條引物中，多態(tài)性比率最高的為Pr3、Pr5、Pr9，其多態(tài)性比率達100%，多態(tài)性比率最低的為Pr4，其多態(tài)性比率為71.43%。

表4 21條引物對樣品的擴增結(jié)果Table 4 Amplification results of 21 primers

實驗表明，CDDP分子標記在耐冬山茶種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析方面具有應(yīng)用可行性，為CDDP-PCR技術(shù)對耐冬山茶種質(zhì)資源的親緣關(guān)系及其遺傳變異的研究奠定了基礎(chǔ)。

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