不同端粒片段通過沉默信息調(diào)節(jié)因子1/抑癌基因P53促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞凋亡

呂娟，王紅

不同端粒片段通過沉默信息調(diào)節(jié)因子1/抑癌基因P53促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞凋亡

呂娟，王紅

目的：研究不同端粒寡核苷酸序列對大鼠胸大動脈平滑肌細(xì)胞（A7R5） 凋亡的影響，及沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）/抑癌基因P53（P53）信號通路是否參與調(diào)控端粒寡核苷酸序列誘導(dǎo)A7R5的凋亡。

方法：將三種端粒重復(fù)序列端粒寡核苷酸序列的二聚體、四聚體、六聚體[TE-12（TTAGGG）2、TE-24（TTAGGG）4、TE-36（TTAGGG）6]轉(zhuǎn)染至A7R5，分別作為TE-12組、TE-24組、TE-36組，另設(shè)A7R5空白為陰性對照組。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各端粒寡核苷酸序列轉(zhuǎn)染后A7R5的凋亡情況。采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶聯(lián)反應(yīng)（RT-PCR）及蛋白免疫印跡（Western-blot）檢測TE-12組、TE-24組、TE-36組及陰性對照組SIRT1、P53基因及蛋白水平。

結(jié)果：將TE-12、TE-24、TE-36成功轉(zhuǎn)染進(jìn)A7R5，各組轉(zhuǎn)染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。TE-12組A7R5凋亡率明顯高于TE-36組、TE-24組和陰性對照組，TE-24組細(xì)胞凋亡率最低，但亦明顯高于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。TE-12組A7R5SIRT1mRNA及蛋白水平明顯高于TE-36組、TE-24組和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。TE-24組A7R5P53mRNA及蛋白水平明顯低于TE-36組、TE-12組和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

結(jié)論：端粒寡核苷酸序列促進(jìn)A7R5的凋亡。不同結(jié)構(gòu)的端粒寡核苷酸序列引起A7R5凋亡程度不同，在選取的三種結(jié)構(gòu)中，端粒單鏈序列TE-12引起A7R5凋亡最明顯。端粒寡核苷酸序列對A7R5凋亡的作用可能與SIRT1/P53信號通路有關(guān)。

寡核苷酸類; 肌,平滑,血管; 凋亡

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:612.)

針對增齡而出現(xiàn)的血管老化問題已成為防治心血管疾病的新靶點[1]。血管老化作為一種退行性疾病，其病理改變主要涉及內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的凋亡[2-4]。端粒學(xué)說是目前被認(rèn)可的衰老機(jī)制之一，研究發(fā)現(xiàn)端粒長度縮短啟動了細(xì)胞凋亡過程，端?？赡芡ㄟ^細(xì)胞凋亡的形式與血管老化有密切聯(lián)系[5-6]。當(dāng)端粒因分裂而縮短至臨界長度時，細(xì)胞停止分裂走向凋亡，但具體機(jī)制尚不清楚[7-10]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）為哺乳動Sirtuins家族成員之一,是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （NAD+）的第 III 類組蛋白去乙酰化酶。SIRT1是重要的抗衰老蛋白，通過使多個蛋白質(zhì)去乙?；淖兤浠钚?，涉及細(xì)胞內(nèi)基因沉默、能量代謝、抗細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等多種生物功能[11-13]。抑癌基因P53（P53）的細(xì)胞內(nèi)活性作用主要體現(xiàn)在對細(xì)胞周期的阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)[14]。近期研究表明，SIRT1去乙?；概c細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，SIRT1還可通過將P53蛋白第382位賴氨酸殘基乙酰化，降低P53蛋白與DNA順式元件的結(jié)合能力，從而抑制細(xì)胞凋亡[15-19]。端粒是否通過SIRT1/P53通路調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的凋亡，目前尚少見報道。本實驗旨在探討不同端粒寡核苷酸序列對平滑肌細(xì)胞凋亡的影響，以及SIRT1/P53通路是否參與其中的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞與主要材料

大鼠胸大動脈平滑肌細(xì)胞（A7R5）購自上海生物科技有限公司，澳洲胎牛血清、Gene JET RNA Purification kit、Maxima SYBR Green/ROXqPCR Master Mi購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司，端粒寡核苷酸序列（帶修飾和熒光標(biāo)記）、Invitrgen-MA5-17142、DOTAP LIPosomalTranstreagen購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，P53、SIRT1一抗、二抗均為上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Annexin V-PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司。

1.2 不同端粒寡核苷酸序列細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

將三種端粒重復(fù)序列，端粒寡核苷酸序列的二聚體、四聚體、六聚體[TE-12（TTAGGG）2、TE-24（TTAGGG）4、TE-36（TTAGGG）6]轉(zhuǎn)染至A7R5[20-23]。轉(zhuǎn)染方法按寡核苷酸轉(zhuǎn)染試劑盒所述方法，具體步驟如下：（1）轉(zhuǎn)染前一天將A7R5種入六孔板，密度為80%，標(biāo)記為TE-12組、TE-24組、TE-36組，另設(shè)A7R5空白為陰性對照組（2）轉(zhuǎn)染當(dāng)天每個孔分為兩支離心管，第一支加入2.5 μg寡核苷酸片段后用無血清培養(yǎng)基補(bǔ)至25 μl，第二支加入25 μl無血清培養(yǎng)基和25 μl陽離子脂質(zhì)體二油酰磷脂酰膽堿（DOTAP lipo）轉(zhuǎn)染試劑。將第一管核酸溶液慢慢加入第二管，輕輕混勻，室溫孵育12 min；（3）將步驟2中所得混合液加入對應(yīng)孔中；（4）37℃,5% CO2培養(yǎng)24 h；（5）熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.3 轉(zhuǎn)染不同端粒寡核苷酸序列后檢測A7R5凋亡率

采用流式細(xì)胞儀技術(shù)，使用Annexin V/ propidium iodide（PI）凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡[24-25]。按照試劑說明書，收集1×106個細(xì)胞并重懸于200 μl緩沖液，分別加入5 μl染料Annexin V和5 μl PI，室溫避光孵育15 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，記錄1×104個細(xì)胞并用隨機(jī)軟件分析凋亡細(xì)胞比例。

1.4 實時定量多聚酶聯(lián)反應(yīng)（qRT-PCR） 分析SIRT1信使核糖核酸（mRNA）和P53 mRNA水平

提取細(xì)胞總RNA并精制，反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）。在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行引物設(shè)計，并交引物合成公司合成[26-27]。引物序列如下：

P53：F2-CAGCACAGGAACCTGGAACTGAGG，P53：R2-AGGTGGAAGCCATAGTTGCCTTGG，SIRT1：F2-CGGACAGTTCCAGCCATCTCTGTG，SIRT1：R2-TTGGATTCCTGCAACCTGCTCCAA，β-actin：F1-CCATCTATGAGGGTTACGCGCTCC，β-actin：R2-CACGATTTCCCTCTCAGCTGTGGT，通過設(shè)定的程序[恒溫段:50℃2 min；95℃10 min。循環(huán)段:95℃ 20 s；58℃20 s；72℃ 20 s（讀取熒光），循環(huán)段為40個循環(huán)。熔解段：95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s（讀取熒光）]擴(kuò)增相應(yīng)的基因，用隨機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算目的基因的循環(huán)數(shù)（Ct）值，以-ddCt作為目的基因表達(dá)水平[-ddCt=（Ct目的基因—Ct內(nèi)參基因）處理組—（Ct目的基因—Ct內(nèi)參基因）正常組]。所有反應(yīng)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 SIRT1、P53蛋白檢測

端粒寡核苷酸序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞后于24 h收集細(xì)胞。依據(jù)試劑盒說明提取收集細(xì)胞的蛋白，并進(jìn)行蛋白濃度的定量[28]。加入2倍的上樣緩沖液，沸水中煮5 min，使蛋白變性。每個上樣孔加等量蛋白，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（配制10%的分離膠和5%的濃縮膠）。將凝膠上的蛋白帶轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，4℃封閉過夜。分別加入特異性的一抗，稀釋度（抗體與封閉液的體積比）為1：800～1000，在搖床上室溫反應(yīng)2～3 h后再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:1500）孵育1～2 h，最后用電化學(xué)（ECL）發(fā)光試劑盒發(fā)光,在暗室中進(jìn)行壓片、洗片。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)性，計量資料以表示。符合方差齊性檢驗數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析。方差不齊數(shù)據(jù)，則采用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗（Mann-Whitney U）進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同端粒寡核苷酸序列細(xì)胞轉(zhuǎn)染的情況

TE-12、TE-24、TE-36成功轉(zhuǎn)染至A7R5細(xì)胞，三組的轉(zhuǎn)染率分別是（54.42±4.98）%、（56.34±3.76）%、（58.24±2.98）%，各組轉(zhuǎn)染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），不影響其凋亡率，可以進(jìn)行后續(xù)試驗。圖1

圖1 熒光顯微鏡下顯示大鼠胸大動脈平滑肌細(xì)胞對熒光標(biāo)記的寡核苷酸序列的攝取結(jié)果

2.2 轉(zhuǎn)染不同端粒寡核苷酸序列后檢測A7R5凋亡率

TE-12組、TE-24組、TE-36組及陰性對照組的凋亡率分別是（24.52±2.14）%、（11.22±2.98）%、（17.31±3.76）%、（5.26±2.27）%。TE-12組A7R5凋亡率明顯高于TE-36組、TE-24組和陰性對照組；TE-36組A7R5凋亡率明顯高于TE-24組和陰性對照組；TE-24組A7R5凋亡率明顯高于陰性對照組；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。圖2

2.3 各組A7R5SIRT1 mRNA及P53 mRNA水平檢測結(jié)果

各組A7R5SIRT1 mRNA水平比較：TE-12組、TE-24組、TE-36組及陰性對照組A7R5 SIRT1mRNA相對表達(dá)量分別為1.32±0.01、1.10±0.02、1.22±0.03、 0.92±0.01。TE-12組A7R5 SIRT1mRNA相對表達(dá)量明顯高于TE-36組、TE-24組和陰性對照組（P均＜0.05）；TE-36組明顯高于TE-24組和陰性對照組（P均＜0.05）；TE-24組明顯高于陰性對照組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

各組A7R5P53 mRNA水平比較：TE-12組、TE-24組、TE-36組及陰性對照組A7R5P53mRNA相對表達(dá)量分別為0.72±0.01、0.45±0.02、0.58±0.03、0.91±0.03。TE-24組A7R5 P53 mRNA相對表達(dá)量明顯低于TE-36組、TE-12組和陰性對照組（P均＜0.05）；TE-36組明顯低于TE-12組和陰性對照組（P＜0.05）；TE-12組明顯低于陰性對照組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 各組轉(zhuǎn)染后大鼠胸大動脈平滑肌細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

2.4 各組A7R5 SIRT1蛋白及P53蛋白水平檢測結(jié)果

各組A7R5 SIRT1 蛋白水平比較：TE-12組、TE-24組、TE-36組及陰性對照組A7R5 SIRT1蛋白相對表達(dá)量分別為1.92±0.01、1.51±0.02、1.61±0.01、0.50±0.01。TE-12組A7R5 SIRT1蛋白相對表達(dá)量明顯高于TE-36組、TE-24組和陰性對照組（P均＜0.05）；TE-36組明顯高于TE-24組和陰性對照組（P均＜0.05）；TE-24組明顯高于陰性對照組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。圖3

圖3 各組轉(zhuǎn)染后大鼠胸大動脈平滑肌細(xì)胞SIRT1蛋白水平的蛋白免疫印跡檢測結(jié)果

各組A7R5 P53蛋白水平檢測比較：TE-12組、TE-24組、TE-36組及陰性對照組A7R5 P53蛋白相對表達(dá)量分別為1.21±0.01、0.73±0.01、0.92±0.03、1.51±0.02。TE-24組A7R5 P53蛋白相對表達(dá)量明顯低于TE-36組、TE-12組和陰性對照組（P均＜0.05）；TE-36組明顯低于TE-12組和陰性對照組（P均＜0.05）；TE-12組明顯低于陰性對照組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。圖4

圖4 各組轉(zhuǎn)染后大鼠胸大動脈平滑肌細(xì)胞P53蛋白水平的蛋白免疫印跡檢測結(jié)果

3 討論

大量研究表明，端粒在觸發(fā)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡方面起作用。將合成的寡核苷酸序列導(dǎo)入細(xì)胞，可阻滯細(xì)胞周期導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[29]。端粒結(jié)構(gòu)的異常在多種細(xì)胞系中均能引起細(xì)胞凋亡，目前認(rèn)為真核細(xì)胞的分裂增殖潛力由細(xì)胞的端粒長度控制，隨著細(xì)胞的分裂 , 端粒DNA逐漸丟失[30]。

本實驗研究結(jié)果顯示不同端粒寡核苷酸序列引起A7R5細(xì)胞的凋亡率不同，具有端粒單鏈結(jié)構(gòu)的TE-12引起細(xì)胞凋亡最明顯，其次是具有一個G-四聚體和一個單鏈結(jié)構(gòu)的TE-36，而四個端粒重復(fù)序列的TE-24因為形成了一個G-四聚體結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)凋亡作用最弱。這種效應(yīng)的差別可能是由于端粒單鏈結(jié)構(gòu)能夠模擬端粒開環(huán)后3’懸突的暴露，更易被識別為DNA的損傷信號[29-30]。此外，TE-12組、TE-36組、TE-24組的SIRT1mRNA和蛋白水平依次降低，并高于陰性對照組。而TE-12組、TE-36組、TE-24組的P53 mRNA和蛋白表達(dá)水平依次降低的，卻低于陰性對照組，可見SIRT1參與了端粒寡核苷酸序列誘導(dǎo)的A7R5的凋亡，同時還下調(diào)了P53蛋白的表達(dá)水平。綜合以上結(jié)果，可以看到TE-12組、TE-24組、TE-36組三組轉(zhuǎn)染端粒寡核苷酸序列后，SIRT1、P53基因及蛋白水平與細(xì)胞凋亡的變化趨勢一致，即TE-12組SIRT1、P53表達(dá)最高，凋亡也最明顯。由此提示，端粒寡核苷酸序列可能通過SIRT1/P53途徑促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的凋亡，并且對不同序列的調(diào)控可能還存在差異。

本研究為端粒寡核苷酸序列對A7R5的作用及相關(guān)機(jī)制做了新的探討，對血管老化的基礎(chǔ)研究提供了新的思路，但具體調(diào)控機(jī)制較復(fù)雜，尚需進(jìn)一步深入研究。

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Different Telomere Fragments Promote Rat’s Vascular Smooth Muscle Cell Apoptosis by Silent Information Regulator 1/Cancer Suppressor Gene P53

LV Juan, WANG Hong.
Kunming Medical University, Kunming General Hospital of Chengdu Military Region, Kunming (650031), Yunnan, China

WANG Hong, Email: wangh43@126.com

Objective: To study the influence of different telomere oligonucleotide on rat’s thoracic aortic smooth muscle (A7R5 ) cell apoptosis and to clarify weather silent information regulator 1 (SIRT1)/cancer suppressor gene (P53) signaling pathway involved in oligonucleotide induced cell apoptosis.

Methods: 3 telomere repeat sequences of TE-12 (TTAGGG)2, TE-24 (TTAGGG)4and TE-36 (TTAGGG)6were respectively transfected into rat’s A7R5 cells as TE-12 group, TE-24 group and TE-36 group; in addition, blank A7R5 cells were used as Control group. Transfection induced A7R5 cell apoptosis was detected by flow cytometry, mRNA and protein expressions of SIRT1 and P53 in A7R5 cells were examined by RT-PCR and Western blot analysis in different groups.

Results: Successful ransfection rates were similar among 3 groups. Compared with Control group and TE-36, TE-24 groups, the highest apoptosis rate of A7R5 cells was found in TE-12 group and the lowest was found in TE-24 group which was still higher than that in Control group, all P＜0.05. mRNA and protein expressions of SIRT1 was obviously higher inTE-12 group than the other 3 groups, all P＜0.05; mRNA and protein expressions of P53 was obviously lower in TE-24 group than the other 3 groups, all P＜0.05.

Conclusion: Telomere oligonucleotide sequence may promote rat’s A7R5 cell apoptosis; different sequence had various influence and the strongest effect was observed in TE-12 sequence. The above impact might be related to SIRT1/P53 signaling pathway.

Oligonucleotides; Muscel, smooth, vessel; Apoptosis

2016-09-11）

（編輯：常文靜）

國家自然科學(xué)基金（81270224）

650031 云南省昆明市，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院 高干病房

呂娟 碩士研究生 主要從事冠心病的發(fā)病機(jī)制和預(yù)防研究工作 Email：1962991930@qq.com 通訊作者：王紅 Email:wangh43@126.com

R54

A

1000-3614（2017）06-0612-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.06.019