染色體8q拷貝數(shù)變異與肝細胞癌患者術(shù)后總生存期的相關(guān)性及其靶基因篩選

趙昆，徐菊英，許青，，朱忠政

本研究創(chuàng)新點：

（1）本研究首次發(fā)現(xiàn)染色體8q24.13-24.3增益是肝細胞癌（HCC）患者術(shù)后總生存期（OS）的影響因素，有助于在HCC診斷早期對HCC患者的預(yù)后進行判斷，為早期臨床干預(yù)和個體化治療提供依據(jù)。（2）染色體8q24.13-24.3增益片段內(nèi)ATAD2、PVT1、NDRG1呈拷貝數(shù)依賴性表達上調(diào)，可能參與了HCC不良預(yù)后的演進過程，為可能的分子靶向治療提供了潛在靶點。

我國肝細胞癌（HCC）的死亡率為422.1/10萬，占所有惡性腫瘤的第三位［1］。盡管目前手術(shù)、放療、化療和分子靶向治療有所進展，但HCC患者的預(yù)后仍然很差。目前尚缺乏在診斷初期對HCC患者的預(yù)后進行預(yù)測的可靠的預(yù)后評估體系，因此篩選可以預(yù)測HCC預(yù)后的分子標(biāo)志物具有重要意義［2］?？截悢?shù)變異（CNA）即基因組DNA的片段性增益和丟失，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為篩選預(yù)測HCC預(yù)后的標(biāo)志物的有效途徑［3-4］。既往研究報道，染色體8q增益與口腔癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤等腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)［5-9］，并且與HCC的臨床病理學(xué)特征如腫瘤直徑大、分化差、分期高相關(guān)［10-12］，但有關(guān)染色體8q增益與HCC預(yù)后的關(guān)系目前仍不清楚。為此，本研究探討染色體8q CNA與HCC患者術(shù)后總生存期（OS）的相關(guān)性并篩選預(yù)后相關(guān)潛在靶基因，以期在診斷初期對HCC患者的預(yù)后進行判斷，從而對預(yù)后不良患者進行特殊干預(yù)和個體化治療。

1 對象與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：行根治性切除術(shù)，病理證實為HCC；術(shù)前未行放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：病理證實伴肝內(nèi)膽管癌成分、癌組織中癌細胞占比＜80%或癌旁肝組織過少。

1.2 研究對象 收集2007—2008年于第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院手術(shù)住院的HCC患者187例為研究對象。其中男148例，女39例；年齡19～79歲，平均年齡（51.3±12.8）歲。收集所有患者癌組織，標(biāo)本離體30 min內(nèi)液氮冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.3 一般資料收集 記錄患者性別、年齡、術(shù)后甲胎蛋白（AFP）水平、肝功能Child-Pugh分級、肝硬化情況、糖尿病史、Edmondson-Steiner分級、有無完整腫瘤包膜、TNM分期。

1.4 染色體8q CNA檢測與數(shù)據(jù)處理 采用Qiagen抽提純化試劑盒（Qiagen公司）提取癌組織基因組DNA。采用Agilent 244K（Hu-244A，Agilent公司）微陣列比較基因組雜交（aCGH）技術(shù)檢測染色體8q CNA。該平臺在染色體8q共包含7 487個寡核苷酸探針，DNA分辨率高達13.23 kb。采用Agilent G2565BA微陣列掃描儀對芯片進行掃描，采用Feature Extraction 9.5進行數(shù)據(jù)提取。利用R統(tǒng)計學(xué)軟件包DNAcopy對全部樣本進行基于探針log2比值比（癌組織與正常組織DNA拷貝數(shù)比值的log2對數(shù)）的染色體8q片段循環(huán)二元分割，每一分割片段的log2比值比被賦予該片段內(nèi)所有探針log2比值比的平均值。只有5個或5個以上的連續(xù)探針發(fā)生同向變異才能定義為一個變異片段。片段log2比值比＞0.5定義為CNA增益；片段log2比值比為-0.5～0.5定義為CNA穩(wěn)定（即CNA無增益/丟失）；片段log2比值比＜-0.5定義為CNA丟失。依據(jù)UCSC公共數(shù)據(jù)庫（http：//genome.ucsc.edu，NCBI35/hgl7）定位探針序列和基因。

1.5 染色體8q24.13-24.3片段內(nèi)50個已知基因mRNA表達水平檢測與數(shù)據(jù)處理 采用TRIZOL一步法（Invitrogen公司）提取癌組織總RNA。分別采用QIAGEN RNAeasy kit和QIAGEN Oligotex Direct mRNA kit（Qiagen公司）進行總RNA純化和Poly（A）+mRNA提取。采用Affymetrix U133 Plus 2.0寡核苷酸基因芯片（Affymetrix公司）檢測染色體8q24.13-24.3片段內(nèi)50個已知基因mRNA表達水平。采用Gene array Scanner 3000 7G激光共聚焦掃描系統(tǒng)（Affymetfix公司）對雜交后芯片進行信號掃描，利用GCOS 1.4軟件讀取數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)預(yù)處理及歸一化采用R統(tǒng)計學(xué)軟件包affy中的GCRMA法。基因mRNA表達水平以log2比值比表示。

1.6 隨訪 術(shù)后采用病歷結(jié)合電話隨訪方式進行隨訪，每1～6個月隨訪1次，末次隨訪時間為2016-12-31。隨訪時間2.6～108.6個月，中位隨訪時間45.0個月。最終共66例患者完成隨訪，其中52例因HCC死亡。OS定義為手術(shù)至因HCC死亡或末次隨訪時的時間間隔。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Stata 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以（）表示，計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；一般資料、染色體8q內(nèi)各高頻CNA（增益發(fā)生率＞20%）片段與OS的相關(guān)性分析采用Log-rank檢驗；采用Cox比例風(fēng)險回歸模型分析OS的影響因素；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，其比較采用Log-rank檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。CNA增益HCC患者和CNA無增益HCC患者基因mRNA表達水平比較采用Mann-Whitney U檢驗，以P＜0.000 1為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者一般資料與OS的相關(guān)性 HCC患者性別、年齡、術(shù)后AFP水平、肝功能Child-Pugh分級、肝硬化情況、Edmondson-Steiner分級與OS均無相關(guān)性（P＞0.05）；HCC患者糖尿病史、有無完整腫瘤包膜、TNM分期與OS有相關(guān)性（P＜0.05，見表1）。

2.2 染色體8q內(nèi)各高頻CNA片段與OS的相關(guān)性 完成隨訪的66例患者中，染色體8q全臂或部分增益22例（33.3%）。染色體8q片段循環(huán)二元分割結(jié)果顯示，高頻CNA片段共5個，分別定位于為染色體8q13.3-21.3、染色體8q21.3-23.3、染色體8q23.3-24.13、染色體8q24.13-24.3和染色體8q24.3（見表2）。

以O(shè)S為因變量（連續(xù)性變量），分別以染色體8q13.3-21.3、染色體8q21.3-23.3、染色體8q23.3-24.13、染色體8q24.13-24.3和染色體8q24.3為自變量（賦值：無增益=0，增益=1），進行單因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析，結(jié)果顯示，染色體8q24.13-24.3增益與OS有相關(guān)性（P＜0.05，見表2）。

表1 HCC患者一般資料與OS的相關(guān)性Table 1 Association of general clinicopathological factors with overall survival

以O(shè)S為因變量（連續(xù)性變量），以染色體8q24.13-24.3（賦值：無增益=0，增益=1）、性別（賦值：女=0，男=1）、年齡（賦值：≤50歲=0，＞50歲=1）、術(shù)后AFP水平（賦值：≤20 μg/L=0，＞20 μg/L=1）、肝功能Child-Pugh分級（賦值：A級=0，B級=1）、肝硬化情況（賦值：無=0，有=1）、有無糖尿病史（賦值：無=0，有=1）、Edmondson-Steiner分級（賦值：Ⅱ級=0，Ⅲ級=1）、有無完整腫瘤包膜（賦值：無=0，有=1）、TNM分期（賦值：Ⅰ/Ⅱ期=0，Ⅲ期=1）為自變量，進行多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析，結(jié)果顯示，染色體8q24.13-24.3增益、有無糖尿病史、有無完整腫瘤包膜、TNM分期是OS的影響因素（P＜0.05，見表3）。

生存分析結(jié)果顯示，染色體8q24.13-24.3增益HCC患者生存率低于染色體8q24.13-24.3無增益HCC患者（χ2=6.56，P=0.010，見圖1）。

2.3 染色體8q24.13-24.3增益片段內(nèi)的差異表達基因

為進一步探討染色體8q24.13-24.3增益片段內(nèi)與OS相關(guān)的潛在靶基因，本研究組針對具有配對aCGH和mRNA表達數(shù)據(jù)的109例患者，比較染色體8q24.13-24.3增益HCC患者（n=29）與染色體8q24.13-24.3無增益HCC患者（n=80）染色體8q24.13-24.3片段內(nèi)50個已知基因mRNA表達水平的差異，結(jié)果顯示，染色體 8q24.13-24.3增益 HCC患者 C8orf76、ATAD2、WDYHV1、FBXO32、TMEM65、TATDN1、ZNF572、SQLE、KIAA0196、NSMCE2、PVT1、FAM49B、ASAP1、NDRG1、ZFAT、KHDRBS3、EIF2C2 mRNA 表達水平高于染色體8q24.13-24.3無增益HCC患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1）；染色體8q24.13-24.3增益HCC患者與染色體8q24.13-24.3無增益HCC患者 FAM83A、TRIB1、PHF20L1、ST3GAL1、PTK2、NDUFB9、TRMT12、FAM91A1、GPR20、COL22A1、MTSS1、TSNARE1、EFR3A、SLC45A4、TG、GSDMC、ZHX1、TMEM71、MYC、ANXA13、FAM135B、HHLA1、WISP1、KCNK9、RNF139、LRRC6、DENND3、CCDC26、CHRAC1、NCRNA00051、TRAPPC9、FAM84B、KCNQ3 mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.000 1，見表4）。

表2 染色體8q高頻CNA片段及其與HCC患者術(shù)后OS的相關(guān)性Table 2 Association of high-frequency CNA（s） in chromosome 8q with overall survival in patients with hepatocellular carcinoma

表3 HCC患者術(shù)后OS影響因素的多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析Table 3 Multiple Cox regression analysis of the associated factors for overall survival in patients with hepatocellular carcinoma

圖1 染色體8q24.13-24.3增益HCC患者與染色體8q24.13-24.3無增益HCC患者生存曲線分析Figure 1 Survival curve of hepatocellular carcinoma patients with 8q24.13-24.3 gain and those without

3 討論

近年來有關(guān)染色體CNA與腫瘤預(yù)后的相關(guān)性研究備受關(guān)注。染色體8q增益作為惡性腫瘤常見分子事件，與多種腫瘤預(yù)后相關(guān)，但其與HCC預(yù)后的相關(guān)性尚不清楚。為此，本研究探討染色體8q CNA與HCC患者術(shù)后OS的相關(guān)性并篩選預(yù)后相關(guān)潛在靶基因，以期在診斷初期對HCC患者的預(yù)后進行判斷，從而對預(yù)后不良患者進行特殊干預(yù)和個體化治療。

染色體8q增益頻繁發(fā)生于包括HCC在內(nèi)的多種惡性腫瘤，且與HCC腫瘤大、分化差、分期高相關(guān)［10-12］。本研究單因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析結(jié)果顯示，染色體8q24.13-24.3增益與OS有相關(guān)性。既往研究報道，染色體8q增益與口腔癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤等患者的不良預(yù)后相關(guān)［5-9］。這些研究結(jié)果共同提示，染色體8q增益可能是多種腫瘤的不良預(yù)后因素，因此其與其他腫瘤的預(yù)后關(guān)系值得進一步研究。VINCENT-CHONG等［5］報道口腔癌不良預(yù)后相關(guān)的染色體8q增益片段定位于染色體8q22.3-23.1；HAMMOND等［9］報道葡萄膜黑色素瘤不良預(yù)后相關(guān)的染色體8q增益最小關(guān)鍵區(qū)域定位于染色體8q22.1-8qter；而本研究多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析結(jié)果顯示，染色體8q24.13-24.3增益是OS的影響因素。以上結(jié)果共同提示，不良預(yù)后相關(guān)的染色體8q增益最小關(guān)鍵區(qū)域具有腫瘤類型特異性，可能反映了不同類型腫瘤在預(yù)后相關(guān)基因譜的差異。一項關(guān)于乳腺癌的研究顯示，染色體8q增益與以紫杉醇為基礎(chǔ)的新輔助化療耐藥有關(guān)［13］。未來需進一步研究驗證在染色體8q24.13-24.3增益HCC患者中是否存在同樣的化療耐藥性及其影響HCC患者OS的程度。

腫瘤DNA片段性增益的生物學(xué)效應(yīng)主要是通過片段內(nèi)重要腫瘤相關(guān)基因的拷貝數(shù)依賴性表達上調(diào)實現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，染色體8q24.13-24.3增益HCC 患 者 C8orf76、ATAD2、WDYHV1、FBXO32、TMEM65、TATDN1、ZNF572、SQLE、KIAA0196、NSMCE2、PVT1、FAM49B、ASAP1、NDRG1、ZFAT、KHDRBS3、EIF2C2 mRNA表達水平高于染色體8q24.13-24.3無增益HCC患者，提示其中某（些）基因可能驅(qū)動了染色體8q24.13-24.3的增益，并在HCC患者不良預(yù)后中發(fā)揮重要作用。ATAD2作為染色體8q24片段增益的驅(qū)動基因，其編碼的ATAD2蛋白在細胞生長、分化和凋亡等多種細胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，且ATAD2蛋白過表達與HCC的不良預(yù)后相關(guān)［14-15］。PVT1是一種長鏈非編碼RNA，其通過調(diào)節(jié)細胞增殖、轉(zhuǎn)移、細胞周期、細胞凋亡和耐藥性來促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展［16］，其過表達與包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤不良預(yù)后相關(guān)［17-21］。NDRG1基因編碼的NDRG1蛋白屬于α/β水解酶超家族成員，其過表達更常見于侵襲性、轉(zhuǎn)移性高且生存率低的HCC患者中［22-23］。目前尚缺乏其他基因相關(guān)研究，筆者推測針對這些基因進行相關(guān)功能學(xué)研究將有助于理解基因上調(diào)與染色體8q24.13-24.3增益的因果關(guān)系及其在HCC患者預(yù)后中的作用。

表4 染色體8q24.13-24.3增益HCC患者與染色體8q24.13-24.3無增益HCC患者染色體8q24.13-24.3片段內(nèi)50個已知基因mRNA表達水平比較Table 4 Comparison of the mRNA expression level of 50 known genes in chromosome 8q24.13-24.3 segment between hepatocellular carcinoma patients with 8q24.13-24.3 gain and those without

本研究存在以下局限性。首先，本研究中HCC患者的樣本量相對較小，尤其是染色體8q CNA與OS的相關(guān)性分析僅涉及66例患者，未來需進一步在更大樣本量的基礎(chǔ)上進行驗證性研究。其次，雖然既往一些研究已表明，Affymetrix陣列分析結(jié)果與定量PCR分析結(jié)果具有一致性［24-25］，但本研究Affymetrix陣列分析檢測出的表達上調(diào)基因未經(jīng)其他方法驗證。最后，被篩選出的差異表達基因未進行體內(nèi)外功能學(xué)實驗研究。

綜上所述，染色體8q24.13-24.3增益與HCC患者OS有關(guān)，可作為HCC的一個預(yù)后預(yù)測因子。ATAD2、PVT1、NDRG1拷貝數(shù)依賴性表達上調(diào)可能參與了HCC不良預(yù)后的發(fā)生發(fā)展過程。

志謝：感謝第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院病理科董輝主治醫(yī)師在樣本收集和術(shù)后生存隨訪中給予的幫助。

作者貢獻：趙昆進行文章的構(gòu)思與設(shè)計、數(shù)據(jù)收集，撰寫論文；徐菊英進行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學(xué)處理；朱忠政進行研究的實施與可行性分析、論文的修訂，負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；許青對文章整體負責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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