植物品種SSR指紋分析專用軟件SSR Analyser的研發(fā)

王鳳格，李欣，楊揚，易紅梅，江彬，張憲晨，霍永學(xué)，朱麗，葛建镕， 王蕊，任潔，王璐，田紅麗，趙久然

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植物品種SSR指紋分析專用軟件SSR Analyser的研發(fā)

王鳳格1，李欣2，楊揚1，易紅梅1，江彬2，張憲晨2，霍永學(xué)2，朱麗2，葛建镕1， 王蕊1，任潔1，王璐1，田紅麗1，趙久然1

（1北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心/玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室，北京 100097，2北京華生恒業(yè)科技有限公司，北京 100083）

【目的】開發(fā)適用于植物品種SSR指紋分析的軟件工具，實現(xiàn)植物品種SSR指紋分析的自動化和標(biāo)準(zhǔn)化，解決SSR標(biāo)記在實際應(yīng)用中存在的數(shù)據(jù)采集效率較低、數(shù)據(jù)共享難度較大等問題?！痉椒ā吭谏虡I(yè)化軟件GeneMarker?的基礎(chǔ)上，針對植物品種SSR指紋分析的特殊性，在SSR指紋處理、panel設(shè)計、數(shù)據(jù)庫對接等方面進行算法開發(fā)或優(yōu)化，形成植物品種定制化軟件SSR Analyser，并在玉米等多種作物上測試其分析效果?！窘Y(jié)果】在SSR指紋處理功能上，軟件通過先用系統(tǒng)計算的矩陣進行弱消除，再用Pull-up峰匹配算法進行單峰消除的方案實現(xiàn)了對pull-up峰準(zhǔn)確自動消除；通過優(yōu)化N+1峰、連續(xù)多峰等特殊峰型讀取的算法，解決了特異峰不識別、讀不準(zhǔn)、誤讀等問題，對2 bp重復(fù)類型SSR標(biāo)記為主的植物品種指紋采集更加精準(zhǔn)；通過完善鄰峰過濾、高低峰過濾和二倍體過濾算法，解決了植物品種混合樣品的有效峰采集問題。在Panel設(shè)計功能上，軟件兼顧了Panel設(shè)計的靈活性、方便性和統(tǒng)一性，在保證數(shù)據(jù)采集標(biāo)準(zhǔn)化的前提下，更加適應(yīng)復(fù)雜的試驗情況：提高了標(biāo)記參數(shù)設(shè)置的靈活性，根據(jù)不同參數(shù)作用范圍，標(biāo)記參數(shù)設(shè)置既有針對特定物種、Panel一次性固定設(shè)置的參數(shù)，也有針對每個引物位點、每塊電泳板單獨設(shè)定或微調(diào)的參數(shù)；實現(xiàn)了從已有標(biāo)記中快速重新組合形成新panel的功能；保證了panel的統(tǒng)一調(diào)用和同步更新。通過將軟件與指紋庫管理系統(tǒng)的無縫對接，實現(xiàn)了樣品準(zhǔn)備到指紋采集全流程的自動化、標(biāo)準(zhǔn)化，形成的指紋庫具有直觀可追溯的優(yōu)勢。將SSR Analyser在玉米大規(guī)模建庫中試用，表明該軟件的指紋分析更加簡單高效，比原軟件分析效率提高了10倍以上；將SSR Analyser擴大到水稻、大豆、黃瓜、西瓜、大白菜等多種二倍體作物和小麥、棉花等多倍體作物中試用，表明在二倍體作物上使用效果較好；在多倍體作物上，對其中的二倍體化的標(biāo)記使用效果較好，但對非二倍體化的標(biāo)記仍需進一步完善過濾算法。【結(jié)論】開發(fā)的SSR Analyser軟件具有數(shù)據(jù)分析程序簡單高效、對特殊峰型的SSR標(biāo)記指紋采集精準(zhǔn)、適合基于混合樣品的植物品種SSR指紋采集、與指紋庫管理系統(tǒng)無縫對接的優(yōu)點，大大改善了SSR標(biāo)記在植物品種鑒定中的應(yīng)用效果。

植物品種；SSR；DNA指紋；熒光毛細(xì)管電泳；軟件開發(fā)

0 引言

【研究意義】SSR標(biāo)記由于其多態(tài)性高、共顯性等特點在DNA指紋庫構(gòu)建、品種鑒定及種質(zhì)資源分析中具有獨特的優(yōu)勢[1]。然而，由于SSR標(biāo)記的等位基因數(shù)較多，與只有2個等位基因的SNP、INDEL等標(biāo)記相比，在實際應(yīng)用中存在數(shù)據(jù)采集效率較低、數(shù)據(jù)共享難度較大等問題[2-3]，影響了SSR標(biāo)記的應(yīng)用效果。通過采用熒光毛細(xì)管電泳平臺代替普通凝膠電泳平臺，已初步實現(xiàn)了SSR標(biāo)記在試驗程序上的自動化和標(biāo)準(zhǔn)化[4]。如果能進一步通過開發(fā)SSR指紋分析工具，實現(xiàn)SSR標(biāo)記在數(shù)據(jù)采集上的自動化和標(biāo)準(zhǔn)化，將對推動SSR標(biāo)記在實踐中更加廣泛應(yīng)用具有重要意義。【前人研究進展】目前，SSR指紋分析的常用商業(yè)化軟件有GeneMapper?和GeneMarker?2個系列[5]。GeneMapper?是ABI公司委托第三方開發(fā)的與熒光毛細(xì)管電泳儀捆綁銷售的DNA片段分析軟件，分析對象以人類及馬、牛、羊等動物為主[6]，針對法庭科學(xué)和司法鑒定等應(yīng)用需求，形成了人類DNA鑒定專用定制版本GeneMapper? ID，主要兼容使用AmpF?STR試劑盒[7-8]。GeneMarker?是SoftGenetics公司研發(fā)的能夠處理主流的熒光毛細(xì)管電泳平臺輸出的DNA數(shù)據(jù)的商業(yè)化軟件，面對人類個體鑒定等業(yè)務(wù)的巨大需求，專為法醫(yī)學(xué)研究提供了人類身份認(rèn)定STR分型檢測軟件GeneMarker? HID[9]。可免費獲取的分析軟件主要有ABI公司提供peak scanner[10]，SoftGenetics公司提供的GeneMarker?試用版（http://www.softgenetics. com/GeneMarker.php），以及University of California Davis提供的STRend（http://www.vgl.ucdavis.edu/ informatics/strand.php）等。為解決人類DNA指紋鑒定中的混合樣品分析問題，先后開發(fā)了MasterMIX[11]、PENDULUM[12]、MIX05[13]、LoComatioN[14]、TrueAllele[15]、Forensim[16]等開放軟件以及GeneMapper ?ID- X[17]、GeneMarker?HID[18]等商業(yè)化軟件。此外，為了商業(yè)化客戶的需要，除了單機版的分析工具，還出現(xiàn)了一些將分析軟件與實驗室管理系統(tǒng)等相耦合的操作更加便捷的集成系統(tǒng)[19-20]。【本研究切入點】雖然已經(jīng)開發(fā)了大量的SSR分型軟件，特別是GeneMapper?和GeneMarker?系列商業(yè)化定制軟件在人類DNA指紋庫構(gòu)建及親子鑒定中得到成功應(yīng)用，然而，這些軟件直接應(yīng)用到植物品種SSR指紋分析時效果還不太理想，主要原因如下：（1）人類DNA鑒定以單一來源樣品的個體識別為主，不同個體的樣品混合需作為特殊情況處理[21]，植物品種DNA鑒定則以群體識別為主，利用同一品種內(nèi)部大量不同個體混合形成的混合樣品進行DNA指紋分析是主要的樣品準(zhǔn)備形式，需要將混合樣品帶來的問題作為普遍問題處理[22]；（2）人類的DNA指紋研究比較成熟，SSR標(biāo)記位點質(zhì)量高，重復(fù)序列以4—5堿基為主，已形成商業(yè)化的各種試劑盒產(chǎn)品[23-24]，而不同植物物種的DNA指紋研究基礎(chǔ)參差不齊，只有少數(shù)植物開始參照人類對標(biāo)記選擇的標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)篩選適合品種鑒定需要的SSR標(biāo)記[25-26]，多數(shù)植物入選的SSR標(biāo)記仍以2堿基重復(fù)的標(biāo)記類型為主，且試驗條件標(biāo)準(zhǔn)化程度較低，容易出現(xiàn)連續(xù)多峰、N+1峰等特殊峰型，需要更加強大的峰識別算法；（3）人類是二倍體物種，生成的基因分型數(shù)據(jù)類型較為簡單，易于后期的數(shù)據(jù)分析，而植物物種較多，倍性復(fù)雜[27]，除了二倍體（如玉米、水稻），還有四倍體（如棉花、油菜）、六倍體（如小麥）等多種類型，增加了指紋采集的難度；（4）人類的DNA指紋庫只需要采集數(shù)據(jù)入庫，而植物品種由于其指紋圖譜反映的信息量比較大，有同時采集數(shù)據(jù)和指紋圖譜的需求。因此，開發(fā)一款適合植物品種SSR指紋分析的軟件是非常必要的?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究針對植物品種SSR指紋的特殊性，在GeneMarker的基礎(chǔ)上進一步定制適用于植物品種SSR指紋分析的專用軟件-SSR Analyser，解決植物品種SSR指紋分析的自動化和標(biāo)準(zhǔn)化的問題，并以玉米等植物的SSR指紋分析為例，驗證SSR Analyser的分析性能及應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 供試材料及數(shù)據(jù)獲取

軟件開發(fā)階段所用供試材料為玉米品種，參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR標(biāo)記法》[28]進行DNA提取、PCR擴增、熒光毛細(xì)管電泳（DNA分析儀型號：ABI3730XL），通過Data Collection軟件將DNA分析儀上獲得信號轉(zhuǎn)換為.fsa格式文件，這些原始文件將用于測試軟件指紋分析效果。軟件試用階段所用供試材料擴大到水稻[29]、小麥[30]、棉花[31]、高粱[32]、黃瓜[33]、蘇丹草[34]等作物品種，所用SSR引物主要從相應(yīng)作物的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中或試用單位自行篩選的引物名單中選取。

1.2 軟件開發(fā)整體方案

針對植物品種SSR指紋分析的特殊性，在Genemarker的基礎(chǔ)上形成整體定制方案（圖1），涉及3個方面：SSR指紋處理、panel編輯、數(shù)據(jù)庫對接。SSR指紋處理是整個軟件開發(fā)的難點，分為3個環(huán)節(jié)：原始數(shù)據(jù)預(yù)處理、特異峰識別、有效峰采集。原始數(shù)據(jù)預(yù)處理的研究對象是電泳形成的原始數(shù)據(jù)，主要包括熒光基線校正、峰圖坐標(biāo)轉(zhuǎn)換、峰的平滑、飽和峰校正、Pull-up峰消除等；特異峰識別的研究對象是原始數(shù)據(jù)預(yù)處理后形成的原始峰，包括單峰、N+1峰、連續(xù)多峰等的識別；有效峰采集的研究對象是已識別出的特異峰，包括鄰峰過濾、高低峰過濾、二倍體過濾等。Panel編輯主要解決Panel設(shè)計、標(biāo)記參數(shù)設(shè)置、panel調(diào)用等問題。為了實現(xiàn)植物品種指紋庫構(gòu)建及鑒定的全程自動化，將單機版軟件進一步與指紋庫管理系統(tǒng)進行無縫對接，實現(xiàn)軟件直接調(diào)用、數(shù)據(jù)和指紋自動上傳、指紋庫統(tǒng)一管理和分析等功能。

圖1 軟件開發(fā)方案

1.3 SSR指紋處理功能開發(fā)

1.3.1 原始數(shù)據(jù)預(yù)處理 原軟件對熒光基線校正、峰圖坐標(biāo)轉(zhuǎn)換、飽和峰校正等問題已經(jīng)解決，因此該環(huán)節(jié)主要問題是對pull-up峰的識別和消除效果有待改善。Pull-up峰的解決方案有2種：第一種是定義不同熒光之間的作用關(guān)系矩陣，按其比例關(guān)系對某一顏色的熒光進行整體消除，該方案有2個缺陷，一是不精準(zhǔn)，容易產(chǎn)生過度消除或者消除不足；二是熒光之間的作用關(guān)系在不同電泳板間是變化的，按固定的比例關(guān)系進行消除會出現(xiàn)與實際不符的情況。第二種是結(jié)合峰高比例、峰型特征、峰位置等信息，對Pull-up峰進行定位及消除，該方案也有2個缺陷，一是峰高比例偏高時容易過度消除；二是峰型跨度大于分析單元時容易誤消。原軟件的算法采用了第一種方案，即采用用戶自定義的矩陣或系統(tǒng)自動計算的矩陣進行Pull-up峰消除，新軟件的算法綜合了上述2種方案，即先用系統(tǒng)計算的矩陣進行弱消除，避免過度消除的問題，如果有消除不徹底的情況，再用自定義矩陣進行單峰消除，從而兼顧了自動化和靈活性。

1.3.2 特異峰識別 原始數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理后，以峰圖的形式呈現(xiàn)，需要從中識別出特異峰。特異峰的基本類型有單峰、N+1峰、連續(xù)多峰3種。N+1峰、連續(xù)多峰是識別的難點，原軟件對這兩種峰的識別存在位置讀不準(zhǔn)、峰值估不準(zhǔn)、多識別或少識別峰的問題。

N+1峰是 PCR過程中普通Taq酶在非模板擴增片段3'端自動加一個腺苷酸引起的，表現(xiàn)為在同一等位基因位置出現(xiàn)相差1 bp的2個峰[35]。原軟件對N+1峰按照讀取最高峰的方式進行識別，由于N+1峰按照最高峰出現(xiàn)的位置分為總是左高或總是右高型、時左時右型和接近等高型3種類型，對后2種類型在位置讀取時容易造成1 bp的偏差。為此，新軟件提供了3種讀取方式，即讀最高峰、讀左峰、讀右峰。用戶根據(jù)標(biāo)記的N+1峰類型自行設(shè)定不同讀取方式：對總是左高或總是右高型，設(shè)定讀最高峰；對接近等高型，固定讀左峰或讀右峰；對有時左高有時右高型，根據(jù)最常出現(xiàn)的情況初始設(shè)定讀左峰或讀右峰，隨后針對特定電泳板的實際情況可進行臨時調(diào)整。無論位置讀的是哪個峰，峰值均采集最高峰的。

連續(xù)多峰是PCR擴增過程中Taq酶在模板鏈上滑動引起的，表現(xiàn)為擴增產(chǎn)物長度連續(xù)梯度遞減的一組峰[36]，原軟件對連續(xù)多峰采取讀最高峰的方式進行識別，識別能力較弱，體現(xiàn)在幾個方面：（1）連續(xù)多峰由于其峰型的特殊性，將一個正常特異峰的高度分散到相差2 bp的多個小峰上，使得單個峰的高度很低，如果采用最高峰的峰值，則該連續(xù)多峰容易被隨后的高低峰過濾和二倍體過濾算法過濾掉；（2）連續(xù)多峰最高峰的位置因樣品不同或試驗不同而出現(xiàn)變化，造成至少2 bp的讀取偏差。新軟件形成改進的連續(xù)多峰識別算法：將引物擴增區(qū)間范圍內(nèi)有3個及以上間隔約2 bp、遞增的子峰當(dāng)成一個整體識別為連續(xù)多峰；如果連續(xù)多峰由峰高遞增的子峰構(gòu)成，則將其最高峰識別為終點峰，如果連續(xù)多峰由峰高接近的子峰構(gòu)成，以峰高大于最高子峰峰高的特定閾值（默認(rèn)值是87%）的最右邊子峰為其終點峰；將終點峰的位置作為為該連續(xù)多峰的讀取位置；將連續(xù)多峰的所有子峰峰高的累加值作為該連續(xù)多峰的峰值并標(biāo)注在終點峰上，后續(xù)的高低峰過濾、二倍體過濾環(huán)節(jié)均采用此峰值作為過濾依據(jù)。

1.3.3 有效峰采集 特異峰識別環(huán)節(jié)完成后，往往還會有鄰峰、高低峰、三峰或多峰的情況，需進一步篩選出可采集入庫的有效峰，這就需要一系列過濾掉無效峰的算法，主要包括鄰峰過濾、高低峰過濾和二倍體過濾算法。

原軟件的過濾算法主要是針對個體樣品的指紋采集設(shè)計的，在應(yīng)用到植物品種混合樣品的指紋采集時效果不太理想，主要原因在于：個體樣品上出現(xiàn)的高低峰主要是PCR擴增時因引物不對稱擴增造成的；出現(xiàn)3個或多個峰主要是特異峰識別錯誤造成的，因此過濾算法主要保證數(shù)據(jù)采集的準(zhǔn)確性。而植物品種混合樣品上出現(xiàn)的高低峰、三峰或多個峰，則是樣品一致性差和引物不對稱擴增兩種因素綜合作用的結(jié)果，過濾算法主要保證數(shù)據(jù)采集的一致性。為此，新軟件對原有過濾算法改進后形成新算法如下：首先執(zhí)行鄰峰過濾，將特異峰中相差2 bp且峰高低于鄰峰閾值的低峰過濾掉；然后執(zhí)行高低峰過濾，將峰高低于高低峰閾值的低峰過濾掉；如果剩下的峰仍有2個以上，進一步執(zhí)行二倍體過濾算法，將低于二倍體閾值的繼續(xù)過濾掉，最終剩下1—3個峰。如果是3個峰，對峰高前兩位的采集入庫，對第三個峰在指紋圖譜上標(biāo)識，但數(shù)據(jù)不入庫，如果是1—2個峰，則直接采集入庫。

1.4 Panel編輯

Panel編輯主要包括新panel設(shè)計、標(biāo)記參數(shù)設(shè)置、panel調(diào)用3個方面內(nèi)容。原軟件在panel編輯上存在靈活性、方便性和統(tǒng)一性的欠缺問題：新panel生成時需要先從標(biāo)記設(shè)計開始，不能利用已有panel中的標(biāo)記進行重組；標(biāo)記參數(shù)設(shè)置完成后不能根據(jù)具體試驗情況進行調(diào)整修改；panel的調(diào)用比較隨意，不同實驗員在自己的電腦上分析時，可隨時修改panel，造成不同批次分析的數(shù)據(jù)不具有可比性。

新軟件為提高panel設(shè)計的方便性，增加了針對已有panel中的標(biāo)記重組設(shè)計的功能，用戶進行panel設(shè)計時只需遵守標(biāo)記組合的基本原則（即相同熒光的不同引物范圍沒有交叉區(qū)，不同熒光的引物重疊區(qū)最?。涂蓪σ延械臉?biāo)記進行重新組合形成新的panel。

新軟件為提高標(biāo)記參數(shù)設(shè)置的靈活性，不再對所有參數(shù)固定化統(tǒng)一設(shè)定，而是區(qū)分了不同參數(shù)的作用范圍，分為3種情況：（1）針對特定物種或panel統(tǒng)一設(shè)定的參數(shù)，包括讀取長度范圍、讀取峰高范圍、高低峰過濾、二倍體過濾；（2）針對每個引物位點單獨設(shè)定的參數(shù)，包括連續(xù)多峰過濾、N+1峰過濾、鄰峰過濾、Intensity過濾；（3）針對每塊電泳板進行微調(diào)的參數(shù)，包括N+1 峰過濾、Intensity過濾。

新軟件為保證不同實驗室、不同實驗員在同一時期使用完全相同的一套panel，實現(xiàn)建庫標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)共享，采取了三節(jié)點的panel調(diào)用方案，將panel從原來的一種狀態(tài)或類型區(qū)分為3種，即用戶自定義的、分析時正在啟用的、系統(tǒng)默認(rèn)的：（1）用戶自定義panel與原軟件的狀態(tài)相同，由實驗員自行設(shè)計、自己使用，可新建、修改或刪除，包括從已設(shè)定的panel中選擇引物自由組合成新的panel。（2）新軟件新增了2個狀態(tài)，一個是系統(tǒng)默認(rèn)panel，由管理員設(shè)計并提供給整個系統(tǒng)同步使用，實驗員只能使用，但不能做任何修改和調(diào)整，以保證實驗員能夠采用相同的panel進行分析，并保證panel的實時更新；一個是正在啟用panel，實驗員可修改其部分參數(shù)，但不能自動保存，可進行標(biāo)記范圍的左右整體移動，但不可修改等位基因命名及范圍，以兼容不同電泳試驗的系統(tǒng)誤差。

1.5 與數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)無縫對接

在軟件的功能開發(fā)及調(diào)試完畢后，將其與北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心開發(fā)的植物品種DNA指紋庫管理系統(tǒng)（以下簡稱指紋庫系統(tǒng)，軟件登記號：2015SR085905）進行無縫對接，主要內(nèi)容包括：（1）軟件直接調(diào)用，將軟件與指紋庫系統(tǒng)鏈接，在數(shù)據(jù)庫界面下可直接打開軟件進行SSR指紋分析，原始文件、panel文件則在指紋庫系統(tǒng)中管理和調(diào)用。（2）數(shù)據(jù)和指紋圖譜自動上傳，軟件分析后形成的數(shù)據(jù)和指紋，直接點擊上傳，指紋庫系統(tǒng)將無效數(shù)據(jù)和指紋過濾后，對符合條件的自動入庫，供下一步分析使用。

2 結(jié)果

2.1 軟件總體情況

軟件基于 Borland公司的Borland C++ Builder 6、在GeneMarker基礎(chǔ)定制開發(fā)而成，可在Windows（XP及以上）操作系統(tǒng)上運行。計算機硬件環(huán)境的基本性能要求為：Pentium?III、1 GHz以上的CPU處理器；512 MB以上的內(nèi)存；20GB以上的可用硬盤空間。該軟件具有界面友好、操作簡單、功能強大等優(yōu)點（圖2），已經(jīng)以SSR指紋分析器（英文名：SSR Analyser）的名稱申請并獲得了計算機軟件著作權(quán)（登記號：2015SR161217）。SSR Analyser軟件可以從官方網(wǎng)站或QQ群上獲取，QQ群名為ssr-analyser，群號為683096128；網(wǎng)站鏈接為http://ssr-analyser.maizedna.org/或http://ssr-analyser.soft.today，在線文檔可以幫助潛在用戶學(xué)習(xí)軟件各項功能，安裝指南及快速上手指南可以幫助用戶安裝及使用軟件，如果仍有問題，可通過郵箱與作者直接聯(lián)系。

2.2 SSR指紋處理效果

SSR Analyser軟件實現(xiàn)了對pull-up峰準(zhǔn)確自動消除；解決了N+1峰、連續(xù)多峰等特殊峰型不識別、讀不準(zhǔn)、誤讀等問題；通過改進鄰峰過濾、高低峰過濾和二倍體過濾算法，解決了植物品種混合樣品的有效峰采集問題。圖3以玉米SSR引物為例展示了新軟件在pullup峰消除（圖3-A）、N+1峰識別（圖3-B）、連續(xù)多峰識別（圖3-C）、鄰峰過濾（圖3-D）、高低峰過濾（圖3-E）、二倍體過濾（圖3-F）等方面的效果，表明SSR Analyser對植物品種的SSR指紋分析效果有明顯改善，滿足了基于混合樣品的、以2 bp重復(fù)類型SSR標(biāo)記為主的植物品種SSR指紋分析的需求。

2.3 Panel編輯功能改進

SSR Analyser軟件較好的兼顧了Panel編輯的靈活性、方便性和統(tǒng)一性，在保證數(shù)據(jù)采集標(biāo)準(zhǔn)化的前提下，更加適應(yīng)復(fù)雜的試驗情況：（1）實現(xiàn)了從已有panel中快速重新組合形成新panel的功能，保證了即使沒有使用相同的panel，只要使用了相同的標(biāo)記就能形成標(biāo)準(zhǔn)化的指紋數(shù)據(jù)（圖4-A）；（2）提高了標(biāo)記參數(shù)設(shè)置的靈活性，根據(jù)不同參數(shù)作用范圍，標(biāo)記參數(shù)設(shè)置既有針對特定物種、panel一次性固定設(shè)置的參數(shù)，也有針對每個引物位點、每塊電泳板單獨設(shè)定或微調(diào)的參數(shù)（圖4-B）；（3）保證了panel的統(tǒng)一調(diào)用和同步更新，通過三節(jié)點的panel調(diào)用方案，將系統(tǒng)統(tǒng)一管理的panel和實驗員自己管理的panel分開，和正在運行的可進行參數(shù)微調(diào)的panel分開，兼顧了panel的穩(wěn)定性和試驗的靈活性（圖4-C）。

A：主界面；B：原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入；C：參數(shù)設(shè)置；D：分析工程生成

A: main interface; B: Raw data import; C: Parameter settings; D: creation of analysis project

圖2 SSR Analyser軟件分析界面

Fig. 2 The user interface of the SSR analyser

A：Pull-up峰消除（以前的算法：pull-up峰由于位于引物擴增區(qū)間范圍內(nèi)，未能準(zhǔn)確識別并消除；新的算法：pull-up峰識別時考慮到峰型特征，將其準(zhǔn)確識別并消除。其中紅色底紋表明識別的峰未落入設(shè)定的等位基因區(qū)間內(nèi)，灰色底紋表明識別的峰落入設(shè)定的等位基因區(qū)間內(nèi)）；B：N+1峰識別（以前的算法：由于總是讀最高峰，導(dǎo)致位置存在1 bp誤差，新的算法：根據(jù)該引物N+1峰的特征指定讀右峰，避免了位置誤差）；C：連續(xù)多峰識別（以前的算法：該組連續(xù)多峰由于峰高過低未能識別；新的算法：成功識別該組連續(xù)多峰，峰的高度為所有子峰高度的累加）；D：鄰峰過濾（以前的算法：未能將相鄰的低峰過濾掉；新的算法：將相鄰的低于設(shè)定閾值的鄰峰過濾掉）；E：高低峰過濾（以前的算法：未能將低峰過濾掉；新的算法：能夠?qū)⒌头暹^濾掉）；F：二倍體過濾（以前的算法：僅標(biāo)識2個峰；新的算法：對符合設(shè)定閾值的第三個峰在圖上用未加框的灰色底紋標(biāo)識。）。左側(cè)和右側(cè)的圖分別為原軟件和新軟件的處理效果

A: Pull-up peak elimination (previous algorithm: Because the pull-up peak was located in the range of the primer amplification products, it couldn’t be accurately identified and eliminated; new algorithm: Considering the peak shape feature, it was accurately identified and eliminated. Red shading indicated that the peak did not fall into the allele interval, while grey shading showed that the peak fell into the allele interval); B: N+1 peak recognition (previous algorithm: always read the highest peak, cause 1bp error in position; with new algorithm: read the right peak); C: Tailed peak recognition (pervious algorithm: the height of the tailed peak is too low to be recognized; new algorithm: the tailed peak are successfully identified since the peak height is the summation of all sub peaks height); D: Adjacent peak filtration (Previous algorithms: failed to filter adjacent low peaks; new algorithm: filtered adjacent peaks below the set threshold); E: High-low peak filtration (Previous algorithms: failed to filter low peaks; new algorithm: low peaks couldn’t be filtered out); F: Diploid filtration (Previous algorithms: only two peaks was identified; new algorithm: the third peak that meted the set threshold was marked on the map with no framed grey shade).Graphs on the left show the results of the previous software; graphs on the right show the results of the new software

圖3 SSR指紋處理功能的實現(xiàn)效果

Fig. 3 The effect of SSR fingerprint processing function

A：利用已有panel設(shè)計新panel；B：標(biāo)記參數(shù)設(shè)置；C：Panel使用

A: Designing a new panel with a existing panel; B: Parameter setting of the markers; C: Using the panel

圖4 Panel編輯功能的實現(xiàn)效果

Fig. 4 The implementation of the panel editing function

2.4 與指紋庫系統(tǒng)對接

SSR Analyser軟件與指紋庫系統(tǒng)的無縫對接，實現(xiàn)了樣品準(zhǔn)備到指紋采集全流程的自動化、標(biāo)準(zhǔn)化，形成的指紋庫具有直觀可追溯的優(yōu)勢（圖5）。

2.5 軟件實際應(yīng)用案例

SSR Analyser軟件開發(fā)后，率先在玉米品種SSR指紋庫構(gòu)建中得到大規(guī)模應(yīng)用[37]。建庫SSR引物40個，采用十重電泳，一塊電泳板形成的FSA原始文件中包括96個樣品、96×10=960個數(shù)據(jù)點，按10個引物一組設(shè)計形成4組系統(tǒng)默認(rèn)panel（Q1、Q2、Q3和Q4），由兩位實驗員進行兩組獨立平行試驗并獨立進行指紋分析。不考慮數(shù)據(jù)缺失進行的補板，共形成FSA文件數(shù)為42×4×2=336個。首先通過比較兩位實驗員獨立分析的平行試驗數(shù)據(jù)來評估軟件分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，兩組指紋數(shù)據(jù)的的吻合度達到99.9%。其次評估軟件分析效率，如果用GeneMapper分析一個FSA文件，需要人工訂正的數(shù)據(jù)占10%—20%，平均分析時間為30—40 min，用SSR Analyser分析同樣的文件，人工訂正的數(shù)據(jù)量減少為0.5%—1%，平均分析時間縮短為約3 min，兩位實驗員完成全部336個FSA文件的分析最快需要84 h/人。由此可見，SSR Analyser軟件不僅分析準(zhǔn)確性高，分析效率也提高了10倍。

A：在指紋庫系統(tǒng)上直接調(diào)用分析器；B：分析完畢后直接上傳指紋庫系統(tǒng)；C：在指紋庫系統(tǒng)上管理數(shù)據(jù)和指紋

為全面系統(tǒng)評價SSR Analyser對不同物種的分析效果，進一步聯(lián)合多家研究單位在水稻、高粱、黃瓜、番茄、蘇丹草等多種二倍體植物的指紋庫構(gòu)建中試用，表明在二倍體作物上的應(yīng)用是成功的；在小麥、棉花等多倍體植物的指紋庫構(gòu)建中試用，表明對其中二倍體化的標(biāo)記使用效果較好，對非二倍體化的標(biāo)記仍需進一步完善過濾算法。

3 討論

3.1 SSR Analyser軟件的應(yīng)用價值

隨著品種審定登記、品種權(quán)保護等系列制度的實施，植物品種SSR指紋庫構(gòu)建及品種鑒定已經(jīng)進入日程。本研究開發(fā)的SSR Analyser軟件解決了植物品種SSR分析自動化和標(biāo)準(zhǔn)化的問題，與已有的軟件相比，更加符合植物品種SSR指紋分析的需求：（1）數(shù)據(jù)分析更加簡單高效，從導(dǎo)入數(shù)據(jù)、設(shè)置參數(shù)、分析數(shù)據(jù)、上傳數(shù)據(jù)，只需連續(xù)的四步就可完成，比原軟件分析效率提高了10倍以上。（2）對2 bp重復(fù)類型SSR標(biāo)記為主的植物品種指紋采集更加精準(zhǔn)，提供了N+1峰、連續(xù)多峰等特殊峰型讀取的完美解決方案。（3）更加適合基于混合樣品的植物品種SSR指紋采集，對混合樣品帶來的高低峰、三峰、多峰等的指紋采集進行了針對性開發(fā)，解決了混合樣品的指紋準(zhǔn)確讀取的問題。（4）與DNA指紋庫管理系統(tǒng)自動對接，批量上傳數(shù)據(jù)和指紋圖譜。

3.2 軟件的物種兼容性

與GeneMapper ID、GeneMarker HID等定制化商業(yè)軟件僅解決人類一個物種的指紋自動化分析不同，SSR Analyser需要解決大部分植物物種的指紋自動化分析。從SSR Analyser在多個作物上試用的情況看，在二倍體作物上分析效果最好，下一步可在更多的二倍體作物上推廣使用。在多倍體作物上的使用效果則受不同SSR標(biāo)記特征的影響，如果選用的SSR標(biāo)記類型是二倍體化的，則分析效果較好；如果是多倍體化的，但不同染色體亞組的等位基因落在不同的區(qū)間范圍內(nèi)，通過拆解成2個或3個二倍體化的標(biāo)記，也可獲得較好的分析效果。如果無法進行拆解，則面臨采集的數(shù)據(jù)信息不完全的問題。從SSR Analyser軟件本身而言，下一步可完善二倍體過濾算法，形成可兼容二倍體、四倍體、六倍體等多種倍性植物的過濾算法；然而，從指紋庫構(gòu)建而言，多倍體過濾算法不僅改變了SSR Analyser的數(shù)據(jù)采集，還影響到數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)設(shè)計及品種比較算法的邏輯，因此當(dāng)開展多倍體植物品種SSR指紋庫構(gòu)建工作時，到底是采取開發(fā)二倍體化的SSR標(biāo)記的方案，還是采取開發(fā)多倍體過濾算法的方案，仍需更多的實踐檢驗。

3.3 混合樣品的解決方案

人類DNA指紋鑒定多數(shù)情況下采集的是個體樣品的DNA指紋，個別情況下采集的混合樣品主要來自犯罪現(xiàn)場的未知樣品，混合樣品中混合的不同個體數(shù)一般只有2個，即一個未知DNA指紋的個體（嫌疑人）和一個已知DNA指紋的個體（受害者）[11-21]，即使如此，對混合樣品的指紋解析仍很難達成一致結(jié)果[38]。與人類不同，植物品種DNA指紋鑒定可以采集由大量個體混合形成的混合樣品，也可以先分別采集多個個體樣品，然后統(tǒng)計其主要基因型作為該品種的標(biāo)準(zhǔn)指紋，而混合樣品在品種預(yù)期一致性較高的情況下是首選方案[22]。與人類上主要處理個體樣品或混合2個個體的混合樣品的情況不同，SSR Analyser主要處理植物品種混合大量個體的混合DNA，需采取不同的指紋采集算法。在開發(fā)策略選擇上，采取數(shù)據(jù)采集和指紋圖譜采集相結(jié)合的方式，數(shù)據(jù)采集時通過高低峰過濾和二倍體過濾算法，僅保留峰高排在前面的1—2個峰，對第3個峰在指紋圖譜上標(biāo)注，在上傳數(shù)據(jù)庫時，將數(shù)據(jù)及對應(yīng)的指紋圖譜一并上傳，在指紋庫管理系統(tǒng)中建立數(shù)據(jù)和指紋圖譜之間的鏈接，以便于通過指紋圖譜獲得更詳細(xì)的信息。從已構(gòu)建的玉米等作物品種SSR指紋庫使用情況看，同時采集數(shù)據(jù)和指紋大大提升了指紋庫的應(yīng)用價值，在品種真實性鑒定中發(fā)揮了重要的作用[37-39]。

4 結(jié)論

基于GeneMarker開發(fā)了適用于植物品種SSR指紋分析的定制化專用軟件-SSR Analyser，解決了植物品種SSR指紋分析的自動化和標(biāo)準(zhǔn)化的問題。與已有軟件相比，數(shù)據(jù)分析程序更加簡單高效，對特殊峰型的SSR標(biāo)記指紋采集更加精準(zhǔn)，更加適合基于混合樣品的植物品種SSR指紋采集。軟件的開發(fā)及在多種作物上的成功應(yīng)用大大改善了SSR標(biāo)記在植物品種鑒定中的應(yīng)用效果。

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（責(zé)任編輯 李莉）

SSR Analyser：A Special Software Suitable for SSR Fingerprinting of Plant Varieties

WANG FengGe1, LI Xin2, YANG Yang1, YI HongMei1, JIANG Bin2, ZHANG XianChen2, HUO YongXue2, ZHU Li2, GE JianRong1, WANG Rui1, REN Jie1, WANG Lu1, TIAN HongLi1, ZHAO JiuRan1

(1Maize Research Center, Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences/Beijing Key Laboratory of Maize DNA Fingerprinting and Molecular Breeding, Beijing 100097;2BeijingTodaysoft Limited Company, Beijing 100083)

【Objective】Develop software tools for plant variety identification by SSR fingerprinting to realize the automatic and standardized analysis of plant variety identification, solving problems of low efficiency of data collection and hard for data sharing et al for SSR markers in practice. 【Method】Based on commercialized software GeneMarker?, develop and optimize algorithms to deal with the specialty of SSR fingerprinting analysis for data analysis, panel design, database synchronization et al. SSR Analyser is generated as personalized software and tested on maize and other crops for its effectiveness. 【Result】From the perspective of processing function, the software is able to first weakly eliminate pull-up peak using matrix by system calculation. Then, use matching algorithm with single peak removal method to completely remove pull-up peak automatically and correctly. By optimizing the reading algorithm of N+1 peak, stutter peak et al, unrecognized/inaccurate/mis-reading of special peak is solved. Therefore, it is more accurate for Dinucleotide SSR markers’ fingerprinting. By completing the filtering algorithm of neighboring peak, high and low peak, and diploid crops, it solves the problem of effective peak collection for blended samples. From the perspective of panel design, the software balances the flexibility, convenience and uniformity. On the premise of standardized data collection, the software is more suitable for complicated experiment: enhances the flexibility of marker parameter settings, which include setting parameters at one time for specific species using panels, or setting parameters individually for electrophoresis gel for each primer locus; realizes that generating new panels from existing markers; ensures the unification by calling panels and its synchronous updating. By seamless connecting the software and fingerprinting database management system, it realizes the automation and standardization from sample preparation to fingerprint collection, which makes the database more intuitive and traceable. Using the SSR Analyser for building database of maize indicates that the software is more efficient than the original software, which is 10 times of efficiency; After expanding the SSR Analyser’s application scope to rice, soybean, cucumber, watermelon, Chinese cabbage and other diploid crops, and polyploidy crops such as wheat and cotton, suggests that it is more applicable to diploid crops for polyploidy crops, markers developed based on diploid principle have better application. However, other types of markers need optimization on filtering algorithm. 【Conclusion】SSR Analyser is simple and effective in data analysis, which can accurately collect special peak for SSR markers. It is suitable for fingerprint collection of mixed samples and seamless connects with fingerprint database system, which greatly improves the application of SSR markers in plant variety identification.

plant varieties; SSR; DNA fingerprinting; fluorescent capillary electrophoresis; software development

2018-02-06；

2018-03-28

國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0102001）、北京市科委科技計劃課題（Z161100001116089）

王鳳格，E-mail：gege0106@163.com。李欣，E-mail：lxwgcool@gmail.com。楊揚，E-mail：caurwx@163.com；王鳳格、李欣、楊揚為同等貢獻作者。

趙久然，E-mail：maizezhao@126.com