芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定方法研究及耐鹽候選基因的挖掘

張玉娟，游均，劉愛(ài)麗，黎冬華，于景印，王燕燕，周瑢，宮慧慧，張秀榮

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芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定方法研究及耐鹽候選基因的挖掘

張玉娟1，2，游均1，劉愛(ài)麗1，黎冬華1，于景印1，王燕燕1，周瑢1，宮慧慧2，張秀榮1

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所/農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430062；2山東棉花研究中心，濟(jì)南 250100）

【目的】確定芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定適宜的NaCl脅迫濃度和評(píng)價(jià)指標(biāo)，發(fā)掘耐鹽種質(zhì)和耐鹽相關(guān)重要基因，為芝麻耐鹽性大規(guī)模鑒定、遺傳改良和耐鹽機(jī)理研究提供方法借鑒和優(yōu)異基因資源?！痉椒ā恳?份耐鹽性差異較大的芝麻種質(zhì)為材料，在不同濃度的NaCl（0、50、100、150、200和250 mmol·L-1）脅迫下發(fā)芽，測(cè)定其發(fā)芽勢(shì)、成苗率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)和鮮重等指標(biāo)，通過(guò)對(duì)指標(biāo)值的方差分析、主成分分析、隸屬函數(shù)和相關(guān)性分析等，篩選芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定適宜的NaCl處理濃度和評(píng)價(jià)指標(biāo)。以100 mmol·L-1NaCl溶液為處理濃度，相對(duì)成苗率為鑒定指標(biāo)對(duì)71份芝麻核心種質(zhì)進(jìn)行發(fā)芽期耐鹽性鑒定和全基因組關(guān)聯(lián)分析，并對(duì)獲得的候選基因進(jìn)行功能注釋；通過(guò)NaCl脅迫下芝麻幼苗葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和熒光定量PCR分析候選基因的表達(dá)模式，篩選耐鹽相關(guān)候選基因。【結(jié)果】對(duì)不同濃度NaCl脅迫下8份芝麻材料發(fā)芽各指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析表明，100 mmol·L-1的NaCl處理下，除發(fā)芽勢(shì)外，發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、成苗率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)和苗鮮重的標(biāo)準(zhǔn)偏差值均較大，所有指標(biāo)在0.05水平上均存在顯著差異，100 mmol·L-1的 NaCl溶液可以作為芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定的適宜脅迫濃度；相對(duì)成苗率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)芽長(zhǎng)、相對(duì)根長(zhǎng)和相對(duì)鮮重7個(gè)指標(biāo)與芝麻發(fā)芽期耐鹽性關(guān)系密切，貢獻(xiàn)率較高，可以作為芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定的評(píng)價(jià)指標(biāo)。71份芝麻核心種質(zhì)材料的相對(duì)成苗率變異比較豐富，符合正態(tài)分布；通過(guò)對(duì)71份芝麻核心種質(zhì)相對(duì)成苗率與SNP標(biāo)記進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，檢測(cè)到7個(gè)與芝麻發(fā)芽期耐鹽性顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記（LG5:688003、LG7:9582027、LG10:5274091、LG10:10788493、LG11:11924186、LG14:2128695和LG16:3930301），SNP標(biāo)記上、下游各100 kb區(qū)間內(nèi)共有基因67個(gè)，其中有功能注釋的基因34個(gè)；通過(guò)耐鹽材料S04在鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和熒光定量PCR對(duì)預(yù)測(cè)的候選基因進(jìn)行表達(dá)模式分析，共有21個(gè)候選基因受到鹽脅迫誘導(dǎo)顯著差異表達(dá)?！窘Y(jié)論】芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定的適宜NaCl脅迫濃度為100 mmol·L-1，相對(duì)成苗率等7個(gè)指標(biāo)可以作為適宜的評(píng)價(jià)指標(biāo)；檢測(cè)到與芝麻發(fā)芽期耐鹽性顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記7個(gè)，并鑒定出耐鹽候選基因21個(gè)。

芝麻；耐鹽性；全基因組關(guān)聯(lián)分析；耐鹽基因

0 引言

【研究意義】鹽堿化和次生鹽堿化土壤廣泛分布于世界各地，特別是沿海、內(nèi)陸干旱和半干旱地區(qū)較為嚴(yán)重，土壤鹽堿化造成了作物生境條件的變化，影響其生長(zhǎng)過(guò)程和干物質(zhì)積累，重度鹽堿土壤甚至無(wú)法種植利用，嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展[1]。當(dāng)前，中國(guó)鹽堿地總面積約1×108hm2，主要分布在華北、西北和東北等內(nèi)陸干旱地區(qū)及沿海地區(qū)，且面積逐年增加[2]。芝麻是中國(guó)五大油料作物之一，年消費(fèi)量（約1.5×106t）和進(jìn)口量（2016年達(dá)到9.3×105t）均居世界之首，但國(guó)內(nèi)芝麻生產(chǎn)總供給不足50%。因此，加強(qiáng)西部和內(nèi)陸干旱、半干旱地區(qū)次生鹽堿地和濱海土壤的開(kāi)發(fā)利用，對(duì)擴(kuò)大芝麻種植面積、提高自給率具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者對(duì)其他植物耐鹽性研究比較深入，建立了針對(duì)不同作物的耐鹽性鑒定方法，開(kāi)展了大量的耐鹽作物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)工作，對(duì)多種作物如小麥、水稻、玉米、棉花等種質(zhì)資源進(jìn)行了耐鹽性鑒定篩選工作[3-6]。植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)、抵御機(jī)理是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，包括鹽信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、特異轉(zhuǎn)錄因子的激活和下游應(yīng)答基因的表達(dá)等[7]。迄今研究較清楚的鹽脅迫應(yīng)答機(jī)制是SOS（salt overly sensitive）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包含6個(gè)關(guān)鍵基因，在鹽脅迫下通過(guò)不同的作用方式調(diào)控植物對(duì)鹽脅迫的抵御[8]。通過(guò)QTL定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）挖掘耐鹽基因應(yīng)用較多。Xu等[9]以小麥耐鹽重組自交系群體為材料，定位到11個(gè)與耐鹽性顯著關(guān)聯(lián)的QTL位點(diǎn)；Yu等[10]對(duì)198份苜蓿地方品種進(jìn)行了GWAS分析，發(fā)現(xiàn)了23個(gè)與耐鹽性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，獲得2個(gè)耐鹽基因；Thudi等[11]對(duì)鹽脅迫下擬南芥群體進(jìn)行耐鹽相關(guān)性狀的連鎖分析和GWAS分析，獲得4個(gè)耐鹽關(guān)鍵基因；、、、和等耐鹽基因先后被驗(yàn)證了其提高耐鹽性的功能[12-16]。【本研究切入點(diǎn)】目前，芝麻耐鹽性研究嚴(yán)重滯后于小麥、玉米、棉花等其他作物[17-19]，缺乏完善的耐鹽性鑒定方法，分子基礎(chǔ)研究極其薄弱，基本處于空白，可用的耐鹽基因資源未見(jiàn)報(bào)道，制約著芝麻耐鹽育種的發(fā)展?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】種子發(fā)芽期不僅是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中最關(guān)鍵的一個(gè)生長(zhǎng)階段，有研究表明在鹽脅迫逆境環(huán)境下，種子發(fā)芽期的耐鹽性最敏感，隨著植物的生長(zhǎng)，其耐鹽性逐漸提高[20-21]。本研究以芝麻核心種質(zhì)為研究材料，篩選芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定適宜的NaCl處理濃度和評(píng)價(jià)指標(biāo)，發(fā)掘耐鹽優(yōu)異種質(zhì)和相關(guān)重要基因，為芝麻耐鹽性大規(guī)模鑒定發(fā)掘和耐鹽育種提供方法和基因資源支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2017年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所芝麻種質(zhì)資源培養(yǎng)間進(jìn)行。供試芝麻核心種質(zhì)材料共71份，包括53份國(guó)內(nèi)種質(zhì)（來(lái)自吉林、新疆和福建等18個(gè)省份）和18份國(guó)外種質(zhì)（來(lái)自美國(guó)、日本和印度等10個(gè)國(guó)家），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所芝麻種質(zhì)中期庫(kù)提供。

1.2 種子發(fā)芽期的適宜脅迫濃度和評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.2.1 NaCl脅迫適宜濃度的確定 挑選耐鹽性差異較大的種質(zhì)材料8份，設(shè)置0（對(duì)照，去離子水）、50、100、150、200和250 mmol·L-1的NaCl溶液，共6個(gè)處理，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)用種50粒；將2%次氯酸鈉消毒后的種子均勻放在鋪有2層濾紙、直徑為10 cm、高7 cm的塑料培養(yǎng)皿中，加入NaCl溶液15 mL，置于28℃、濕度60%的培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗發(fā)芽。第2天開(kāi)始記錄每皿的發(fā)芽種子數(shù)（發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)為胚根長(zhǎng)度≥種子長(zhǎng)度），第6天調(diào)查統(tǒng)計(jì)幼苗根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、鮮重和正常苗數(shù)；計(jì)算各材料發(fā)芽勢(shì)、成苗率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)和鮮重的均值。

正常苗判定標(biāo)準(zhǔn)：各器官生長(zhǎng)良好、勻稱、健康的幼苗；帶有輕微缺陷的幼苗（某一器官生長(zhǎng)稍遲緩，但其他與健康幼苗相近）；輕微感染的幼苗（由真菌或細(xì)菌感染導(dǎo)致幼苗發(fā)病腐爛，但被感染前各器官生長(zhǎng)基本正常[22]。

各指標(biāo)按以下公式計(jì)算：

發(fā)芽勢(shì)（%）=（第3天發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100；

成苗率（%）=（第6天正常苗數(shù)/供試種子數(shù)）×100；

發(fā)芽指數(shù)=∑（Gt/Dt），Gt表示時(shí)間t的發(fā)芽數(shù)，Dt表示對(duì)應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)；

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×鮮重；

指標(biāo)相對(duì)值=處理平均測(cè)定值/對(duì)照平均測(cè)定值。

1.2.2 測(cè)定數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和適宜評(píng)價(jià)指標(biāo)的確定 利用Excel2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)計(jì)算，利用SAS9.1軟件對(duì)測(cè)定指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、主成分分析和相關(guān)性分析。耐鹽性綜合評(píng)價(jià)采用隸屬函數(shù)法[23]。

公式（1）中計(jì)算每一個(gè)材料各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，X表示第個(gè)綜合指標(biāo)的測(cè)定值；Xmin、Xmax分表表示第個(gè)綜合指標(biāo)的最小值和最大值。公式（2）計(jì)算綜合指標(biāo)的權(quán)重，代表各材料第個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。公式（3）計(jì)算各材料的耐鹽性綜合評(píng)價(jià)值。

1.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析及耐鹽候選基因的預(yù)測(cè)

調(diào)查71份核心種質(zhì)群體在適宜濃度NaCl處理后的相對(duì)成苗率表型數(shù)據(jù)，基于本課題組前期芝麻核心種質(zhì)全基因組重測(cè)序獲得的SNP[24]，利用TASSEL 5.0軟件[25]，采用混合線性模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并利用qqMan繪制曼哈頓圖；顯著關(guān)聯(lián)SNP寬松閾值設(shè)為-lg（）=3，嚴(yán)謹(jǐn)閾值設(shè)為-lg（）= 4.5；在顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)上下游各100 kb的序列作為候選區(qū)間，對(duì)區(qū)間內(nèi)候選基因進(jìn)行功能注釋。

1.4 耐鹽候選基因表達(dá)分析

取一份耐鹽材料（S04），用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)至第一對(duì)真葉展開(kāi)時(shí)，用150 mmol·L-1NaCl營(yíng)養(yǎng)液處理幼苗根部，分別于處理0（CK）、6、12和24 h各取10株幼苗葉片混合后用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析和熒光定量PCR（qRT-PCR）分析。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成，顯著差異基因篩選的閾值為|log2FoldChange(處理/對(duì)照)|≥1。采用天根RNA提取試劑盒提取樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄利用HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis kit（諾唯贊，南京）試劑盒，利用ChamQTM SYBR?qPCR Master Mix試劑（諾唯贊，南京）在羅氏LightCycler480系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR。內(nèi)參基因?yàn)镠istone H3.3 (LOC105176435)[26]，引物設(shè)計(jì)利用Primer 5軟件（表1）。

2 結(jié)果

2.1 芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定適宜NaCl濃度的確定

在不同濃度的NaCl脅迫下，8份芝麻種質(zhì)材料的發(fā)芽均受到不同程度的影響（圖1，圖2），在50 mmol·L-1的NaCl脅迫下，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)與對(duì)照相比均未出現(xiàn)明顯變化，成苗率和芽長(zhǎng)略有下降，而5份材料的根長(zhǎng)和6份材料的鮮重卻略有升高，說(shuō)明低濃度的NaCl脅迫對(duì)某些材料的幼苗生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用。在100 mmol·L-1的NaCl脅迫下，7份材料的發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照相比未出現(xiàn)明顯變化，僅S38顯著下降，所有材料的成苗率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)和鮮重與對(duì)照相比均出現(xiàn)顯著下降。當(dāng)NaCl濃度升高到150 mmol·L-1，所有材料的發(fā)芽均受到明顯抑制，各發(fā)芽指標(biāo)值均顯著下降；多數(shù)材料的胚根雖然能夠萌動(dòng)，但發(fā)芽后期多為畸形、壞死、子葉不能正常伸展等等。在200和250 mmol·L-1NaCl脅迫下，多數(shù)材料不能萌動(dòng)。

表1 候選基因的引物序列

對(duì)不同濃度NaCl脅迫下8份芝麻材料發(fā)芽各指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析表明（表2）：50 mmol·L-1的NaCl處理與對(duì)照相比，發(fā)芽勢(shì)、根長(zhǎng)和鮮重均無(wú)顯著差異，說(shuō)明鹽脅迫程度較輕；100 mmol·L-1的NaCl處理下，除發(fā)芽勢(shì)外，發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、成苗率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)和苗鮮重的標(biāo)準(zhǔn)偏差值均較大，所有指標(biāo)在0.05水平上均存在顯著差異，說(shuō)明這些指標(biāo)在8份芝麻材料間分散程度均較大：150、200和250 mmol·L-1的NaCl處理下，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、成苗率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)和苗鮮重與對(duì)照相比均差異顯著，但大多數(shù)種質(zhì)材料的絕大多數(shù)種子不能成長(zhǎng)為正常苗（圖1，圖2），說(shuō)明鹽脅迫程度過(guò)重。因此，100 mmol·L-1的NaCl可以作為芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定的適宜處理濃度。

圖2 不同濃度NaCl脅迫下耐鹽（S04）和敏感（S38）芝麻種質(zhì)材料發(fā)芽第6天的表現(xiàn)

表2 不同濃度NaCl脅迫下8份芝麻材料發(fā)芽各指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析

同一列不同字母表示在=0.05水平差異顯著

Different letters in the same column for each variable indicates a significant difference at 0.05 level

2.2 芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定適宜評(píng)價(jià)指標(biāo)的篩選

對(duì)100 mmol·L-1的NaCl脅迫下芝麻發(fā)芽各指標(biāo)的相對(duì)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、相關(guān)性分析、主成分分析和隸屬函數(shù)分析。8份芝麻材料的各發(fā)芽指標(biāo)差異明顯，其中相對(duì)成苗率變化幅度最大，為28.97%—88.63%，標(biāo)準(zhǔn)偏差值也最大，表明該指標(biāo)在各材料間分散程度最大（表3）。相關(guān)性分析表明（表4），各指標(biāo)間均存在一定的相關(guān)性，其中相對(duì)鮮重、相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)芽長(zhǎng)和相對(duì)成苗率之間的相關(guān)性在0.05水平上極顯著，相關(guān)系數(shù)分別為0.815*、0.787*和0.759*。主成分分析結(jié)果顯示（表5），第一主成分貢獻(xiàn)率為76.920%，第二主成分貢獻(xiàn)率為9.984%，前2個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到86.904%，包含了原始指標(biāo)的絕大部分信息。第一主成分主要包括相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)芽長(zhǎng)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)發(fā)芽勢(shì)，第二主成分主要包括相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)鮮重和相對(duì)成苗率，表明這7個(gè)指標(biāo)均能反映芝麻的耐鹽性。

表3 100 mmol·L-1的NaCl處理?xiàng)l件下芝麻發(fā)芽期各指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析

表4 100 mmol·L-1的NaCl處理?xiàng)l件下芝麻發(fā)芽期各指標(biāo)的相關(guān)性分析

** 在0.01水平差異極顯著；*在0.05水平差異顯著

** indicates a significant relationship at 0.01 level; * indicates a significant relationship at 0.05 level

表5 2個(gè)綜合指標(biāo)的特征值、貢獻(xiàn)率及特征向量

基于前2個(gè)主成分的綜合指標(biāo)值，采用隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)8份芝麻種質(zhì)材料的耐鹽性。先根據(jù)公式（1）獲得各材料所有綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，通過(guò)公式（2）計(jì)算出各綜合指標(biāo)的權(quán)重，再根據(jù)公式（3）計(jì)算出各材料在100 mmol·L-1NaCl脅迫下耐鹽性綜合評(píng)價(jià)D值（表6）。D值越大，材料的綜合耐鹽性越強(qiáng)，從中評(píng)選出2份高耐鹽種質(zhì)S11和S10，其D值分別為0.991和0.907，S04種質(zhì)耐鹽性較強(qiáng)，D值為0.721。相關(guān)性分析顯示D值與7個(gè)耐鹽鑒定指標(biāo)間均呈顯著正相關(guān)（表4），表明這7個(gè)指標(biāo)能較好的區(qū)分芝麻不同種質(zhì)的耐鹽性差異。

表6 各材料綜合指標(biāo)值、權(quán)重、μ(x)值和D值

2.3 芝麻核心種質(zhì)群體全基因組關(guān)聯(lián)分析及耐鹽候選基因的預(yù)測(cè)

對(duì)71份（含以上8份）芝麻核心種質(zhì)在100 mmol·L-1NaCl脅迫下發(fā)芽期的相對(duì)成苗率調(diào)查記載，數(shù)值范圍為16.67%—88.26%，平均值為51.04%，變異系數(shù)為30.08。當(dāng)樣本數(shù)量n＞50時(shí)，參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4882-85進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，D檢驗(yàn)結(jié)果為0.0785（大于0.05），符合正態(tài)分布，且在各個(gè)等級(jí)均有分布，耐鹽性變異比較豐富（圖3），該群體適合做耐鹽性全基因組關(guān)聯(lián)分析。

71份核心種質(zhì)相對(duì)成苗率與SNP標(biāo)記進(jìn)行GWAS分析，共檢測(cè)到7個(gè)與相對(duì)成苗率顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記（LG5:688003、LG7:9582027、LG10:5274091、LG10:10788493、LG11:11924186、LG14:2128695和LG16:3930301），分別位于LG5、LG7、LG10、LG11、LG14和LG16連鎖群上（圖4），SNP標(biāo)記上、下游各100 kb區(qū)間內(nèi)共有基因67個(gè)，其中有功能注釋的基因34個(gè)，包含了7個(gè)參與植物非生物逆境脅迫應(yīng)答的基因，如甲基轉(zhuǎn)移酶（LOC105171975和LOC105171977）、尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（LOC105172099）、紅素氧還蛋白（LOC105176797）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（LOC105176801）和富亮氨酸重復(fù)類受體蛋白激酶（LOC105176803）等基因，涉及多種生物學(xué)功能。候選基因中還包含了5個(gè)去甲烏藥堿合成酶類似蛋白基因和4個(gè)去甲烏藥堿合成酶2類似蛋白基因，均位于第7連鎖群，其中LOC105166829、LOC105166830、LOC105166831和LOC105166832、LOC105166836和LOC105166837為兩組串聯(lián)重復(fù)基因。

圖3 核心種質(zhì)群體相對(duì)成苗率正態(tài)分布圖

圖4 鹽脅迫下芝麻發(fā)芽期相對(duì)成苗率全基因組關(guān)聯(lián)分析的曼哈頓圖

2.4 耐鹽候選基因的表達(dá)分析

利用耐鹽材料S04在鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果（未發(fā)表數(shù)據(jù)）對(duì)以上預(yù)測(cè)的34個(gè)候選基因進(jìn)行表達(dá)模式分析，其中21個(gè)候選基因在芝麻葉片中受到鹽脅迫誘導(dǎo)顯著差異表達(dá)（圖5，表7），有12個(gè)基因在鹽脅迫24與0 h相比表達(dá)量顯著下降，9個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)，基因LOC105172100和LOC105166820分別編碼了多聚半乳糖醛酸酶和ATP酶，在NaCl脅迫6、12和24 h均顯著上調(diào)表達(dá)，基因LOC105166829、LOC105172096、LOC105166932、LOC105166836、LOC105166833、LOC105166827和LOC105176796在NaCl脅迫6或12 h顯著上調(diào)表達(dá)（圖5）。

從21個(gè)候選基因中隨機(jī)選取8個(gè)基因進(jìn)行qRT- PCR分析，結(jié)果顯示，LOC105166820、LOC105166829、LOC105166932和LOC105172100在NaCl脅迫后6—24 h上調(diào)表達(dá)，LOC105172099、LOC105176797、LOC105176803和LOC105166823在NaCl脅迫后下調(diào)表達(dá)（圖6），表達(dá)量變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。

3 討論

發(fā)芽期耐鹽性鑒定快速、簡(jiǎn)便、高效，適用于資源和育種群體的大規(guī)模評(píng)價(jià)篩選，已被廣泛應(yīng)用于其他作物。目前，國(guó)內(nèi)小麥種質(zhì)資源芽期耐鹽性鑒定參考農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《小麥耐鹽性鑒定評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》NY/PZT001-2002進(jìn)行，該標(biāo)準(zhǔn)以350 mmol·L-1NaCl為篩選濃度，以相對(duì)鹽害率為鑒定指標(biāo)；《棉花耐鹽性鑒定評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》DB13T1339-2010規(guī)定了棉花發(fā)芽期耐鹽性鑒定方法，該方法以0.5%的NaCl或0.4%的地下咸水為鹽脅迫濃度，以相對(duì)鹽害率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)；水稻和玉米種質(zhì)芽期耐鹽性鑒定目前在國(guó)內(nèi)尚未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，田蕾等[4]利用125 mmol·L-1NaCl溶液對(duì)64份粳稻種質(zhì)資源耐鹽性進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià)，相對(duì)鹽害率、發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)根長(zhǎng)可以作為粳稻芽期耐鹽性快速鑒定的重要指標(biāo)；張海艷等[5]以220和270 mmol·L-1的NaCl兩種脅迫濃度對(duì)47份玉米品種進(jìn)行發(fā)芽期耐鹽性綜合評(píng)價(jià)，認(rèn)為發(fā)芽率在所有玉米發(fā)芽期鑒定指標(biāo)中與耐鹽性關(guān)系最密切，在品種間的表現(xiàn)也最穩(wěn)定。本研究篩選的芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定以100 mmol·L-1NaCl為適宜脅迫濃度，與以上介紹的幾種作物均不同，可能與不同作物對(duì)鹽脅迫的耐受能力不同有關(guān)；本研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)芽長(zhǎng)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)鮮重和相對(duì)成苗率與耐鹽性關(guān)系均較為密切，與報(bào)道的其他作物類似，當(dāng)然，各指標(biāo)的貢獻(xiàn)率存在一定差異，表明芝麻耐鹽性是一個(gè)較復(fù)雜的性狀，為研究制訂綜合評(píng)價(jià)方法或標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

圖5 NaCl脅迫下21個(gè)候選基因的差異表達(dá)模式

表7 芝麻耐鹽性顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)和耐鹽候選基因

圖6 NaCl脅迫后8個(gè)耐鹽候選基因的表達(dá)模式

本研究在前期芝麻核心種質(zhì)全基因組重測(cè)序[24]的基礎(chǔ)上，利用GWAS方法，獲得了7個(gè)與耐鹽性顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，可優(yōu)先選擇貢獻(xiàn)率較大的標(biāo)記，進(jìn)一步驗(yàn)證后開(kāi)發(fā)耐鹽分子標(biāo)記，用于芝麻耐鹽品種的遺傳改良。本研究挖掘到21個(gè)與芝麻耐鹽性有關(guān)的重要候選基因，其中，SNP 5274091候選區(qū)間的候選基因LOC105172100位于10號(hào)連鎖群，編碼一個(gè)多聚半乳糖醛酸酶（PG），該酶是植物最大的水解酶家族之一，已被證實(shí)其參與植物非生物逆境脅迫的響應(yīng)過(guò)程之中[27-29]。Orozcocárdenas等[28]研究發(fā)現(xiàn)基因在逆境脅迫下大量上調(diào)表達(dá)，PG催化的水解反應(yīng)中間產(chǎn)物寡聚半乳糖醛酸可以快速觸發(fā)H2O2反應(yīng)，H2O2作為第二信使參與到植物的防御反應(yīng)?？軙院鏪29]利用NaCl脅迫處理番茄幼苗和綠熟期的果實(shí)組織圓片，發(fā)現(xiàn)在NaCl處理1 h后顯著上調(diào)表達(dá)，認(rèn)為很有可能作為一個(gè)早期的信號(hào)基因參與NaCl引起的脅迫反應(yīng)，并利用產(chǎn)物激發(fā)子傳遞信號(hào)，激發(fā)植物防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)途徑中一系列基因的表達(dá)。本研究中LOC105172100在芝麻幼苗葉片中受鹽脅迫快速顯著上調(diào)表達(dá)，提示其可能以類似的方式參與到芝麻鹽脅迫初期防御系統(tǒng)。

在本研究中，候選基因LOC105172099編碼了一種尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferase，UGT），UGT被發(fā)現(xiàn)可能通過(guò)調(diào)節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物和體內(nèi)激素平衡而參與植物的非生物逆境脅迫抵御過(guò)程[30-31]，芝麻幼苗葉片中LOC105172099基因在鹽脅迫下顯著下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明它很可能以負(fù)調(diào)控方式參與到芝麻鹽脅迫調(diào)控過(guò)程。研究表明紅素氧還蛋白基因在植物抵御非生物脅迫方面發(fā)揮著重要的作用[32-33]，Li等[34]研究發(fā)現(xiàn)紅素氧還類似蛋白基因可以通過(guò)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)離子平衡和清除體內(nèi)活性氧來(lái)提高擬南芥對(duì)NaCl脅迫的抵御，本研究篩選到一個(gè)紅素氧還蛋白基因LOC105176797，位于第14連鎖群，該基因很可能在芝麻抵御NaCl脅迫過(guò)程中也起到類似的作用。這些候選基因的發(fā)現(xiàn)，對(duì)芝麻耐鹽定向育種具有重要的意義。除此之外，SNP 9582027候選區(qū)間LOC105166829、LOC105166830、LOC105166831和LOC105166832為一組串聯(lián)重復(fù)基因，均編碼一種去甲烏藥堿合成酶（NCS）類似蛋白，NCS是芐基異喹啉類生物堿合成代謝途徑初始反應(yīng)步驟的關(guān)鍵酶[35]，目前，尚未有研究發(fā)現(xiàn)其參與植物的逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程，但基因表達(dá)模式分析顯示這些基因很可能與芝麻鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制有關(guān)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。總之，本研究鑒定得到的與芝麻耐鹽性相關(guān)的SNP位點(diǎn)和候選基因?yàn)楹罄m(xù)開(kāi)展芝麻大規(guī)模耐鹽等位基因發(fā)掘、耐鹽基因驗(yàn)證和功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)等相關(guān)研究奠定重要的工作基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

確定了100 mmol·L-1NaCl為芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定的適宜濃度，相對(duì)成苗率等7個(gè)指標(biāo)與芝麻耐鹽性關(guān)系密切。71份芝麻核心種質(zhì)材料的耐鹽性數(shù)值變異比較豐富，符合正態(tài)分布，共檢測(cè)到與芝麻發(fā)芽期耐鹽性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)7個(gè)，連鎖不平衡區(qū)域包含候選基因67個(gè)，基因功能注釋和鹽脅迫表達(dá)分析獲得耐鹽候選基因21個(gè)。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Screening Method for Salt Tolerance in Sesame (L.) and Identification of Candidate Salt-tolerant Genes

ZHANG YuJuan1,2, YOU Jun1, LIU AiLi1, LI DongHua1, YU JingYin1, WANG YanYan1, ZHOU Rong1, GONG HuiHui2, ZHANG XiuRong1

(1Oil Crops Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062;2Cotton Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100 )

【Objective】In order to evaluate salt tolerance of sesame germplasms and reveal the genetic basis of salt tolerance in sesame at the germination stage, optimum NaCl concentration and best salt tolerance indexes were determined, salt-tolerant sesame genotypes as well as candidate genes were identified in this study. 【Method】Eight sesame genotypes with different salt tolerance were germinated under different NaCl concentrations (0, 50, 100, 150, 200 and 250 mmol·L-1). Seven germination indexes including germination potential, germination index, vigor index, seedling rate, radicle length, embryo length and fresh weight of seedling were measured. The optimum NaCl concentration and salt tolerance indexes of sesame were determined using variance analysis, principal component analysis, membership function and correlation analysis based on the relative values of multiple indexes. In addition, genome-wide association analysis (GWAS) of salt tolerance related trait in 71 sesame germplasms was performed to find the SNP loci and candidate genes related to salt tolerance in sesame. Gene function annotation, transcriptome analyses and real-time quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR) were used to identify important candidate genes involved in salt tolerance. 【Result】The larger standard value deviations of germination indexes were observed at 100 mmol·L-1NaCl concentration, implying that 100 mmol·L-1is the optimum NaCl concentration for salt-tolerance screening in this study. The seven indexes were highly correlated with salt tolerance at germination stage, suggesting that, these indexes could be targeted for effective screening of salt-tolerance in large sesame germplasm. The genome-wide association analysis identified 7 SNP loci peaks (LG5:688003, LG7:9582027, LG10:5274091, LG10:10788493, LG11:11924186, LG14:2128695 and LG16:3930301) significantly associated with salt tolerance and 34 functional candidate genes. The transcriptome analysis and qRT-PCR showed that 21 candidate genes respond strongly to salt stress.【Conclusion】In this study, 100 mmol·L-1is the optimum NaCl concentration for salt-tolerance screening and seven indexes including relative seedling rate could be targeted for effective screening of salt-tolerance in large sesame germplasm. In addition, 7 SNP loci peaks significantly associated with salt tolerance were identified and 21 candidate salt-tolerant genes were discovered.

sesame; salt tolerance; genome-wide association study; salt-tolerant genes

2018-02-06；

2018-04-09

農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（2017007）、國(guó)家特色油料產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-14）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2013-OCRI）、農(nóng)業(yè)部黃淮海棉花遺傳改良與栽培生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（2016KL03）、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程“棉花與特色經(jīng)濟(jì)作物學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)”

張玉娟，E-mail：723949246@qq.com。

張秀榮，E-mail：zhangxr@oilcrops.cn