轉AtTGA4小麥田間耐低磷脅迫的功能分析

凌炳琦，柏星軒，周永斌，王春霄，徐兆師，馬有志，陳明，張小紅

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轉小麥田間耐低磷脅迫的功能分析

凌炳琦1，柏星軒2，周永斌2，王春霄2，徐兆師2，馬有志2，陳明2，張小紅1

（1西北農林科技大學生命科學學院，陜西楊凌 712100；2中國農業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081）

【目的】將bZIP類轉錄因子基因轉化小麥創(chuàng)制耐低磷轉基因小麥新材料，同時分析提高小麥抗逆性的生理機制，為小麥耐低磷脅迫分子育種奠定基礎?！痉椒ā坎捎米钚”磉_框基因槍轉化法將和篩選標記基因共轉化受體小麥石4056，通過PCR檢測篩選出無并能穩(wěn)定遺傳的轉基因小麥新株系?；谠囼灥赝寥鲤B(yǎng)分含量狀況施用不同水平的磷肥，形成一定程度的正常和低磷營養(yǎng)脅迫，對轉基因小麥新株系進行低磷脅迫耐受性試驗。在開花期進行了光系統(tǒng)Ⅱ原初光能轉化效率（light efficiency of the light system Ⅱ，F(xiàn)v/Fm），葉綠素相對含量（soil and plant analyzer development readings，SPAD值）和氣冠溫差（canopy temperature depression，CTD）等生理指標的測定，在成熟期進行了株高、分蘗數(shù)、穗粒數(shù)等農藝性狀的調查，并在小麥收獲后進行了產量及不同組分（根、莖、葉、籽粒）磷濃度和磷吸收、殘留總量的測定和統(tǒng)計。【結果】PCR分析結果證明，已在石4056小麥中穩(wěn)定遺傳至T4代，共獲得4個穩(wěn)定轉基因株系。根據(jù)土壤養(yǎng)分含量測定結果，在正常條件地塊施加812.39 kg·hm-2的過磷酸鈣，低磷處理地塊不施磷肥。產量及農藝性狀統(tǒng)計結果顯示，轉基因株系L1和L2在正常和低磷脅迫條件下的產量相對于受體對照小麥顯著增加，正常條件下產量增幅為5.3%—8.6%，低磷脅迫下產量增幅為4.4%—7.7%。在低磷脅迫條件下，過表達的轉基因小麥種子千粒重顯著比受體顯著增加。開花期田間生理指標測定結果顯示，轉基因株系L1和L2在低磷條件下的Fv/Fm和CTD明顯優(yōu)于受體，而SPAD值沒有明顯差異。田間調查時發(fā)現(xiàn)，低磷條件下受體比轉基因材料提早結束灌漿，表現(xiàn)在穗子提早變黃。成熟末期磷含量測定結果顯示，轉基因株系L1和L2在低磷條件下莖桿磷濃度比受體顯著提高，在其他組織中則無顯著差異。2個轉基因株系在低磷條件下莖、葉和籽粒吸收、殘留的總磷含量都要高于受體，地上部總磷含量增幅達6.38%—17.47%。轉基因材料表達量分析結果顯示，目標基因在株系L2中的表達量較株系L1中的低，是株系L1的0.69倍?！窘Y論】在低磷脅迫條件下可以顯著提高轉基因小麥對磷元素的吸收及運輸，提高轉基因小麥的產量，進而提高轉基因小麥對低磷脅迫的耐性。

轉基因小麥；；低磷營養(yǎng)脅迫；產量；生理指標

0 引言

【研究意義】磷是植物體生長發(fā)育所需的大量元素之一，它在膜系統(tǒng)的構成、物質和能量代謝、遺傳等生理生化過程中扮演著極其重要的角色[1]。研究表明，耕地土壤中的磷主要以無機磷、有機磷及其他金屬螯合磷的形式存在；一般情況下，植物以吸收無機磷為主，而無機磷當中可被直接吸收利用的有效磷卻占總磷含量的不足0.5%[2-3]。如今植物當季從土壤中吸收的磷大多來源于人為施加的磷肥，而磷肥在土壤中很容易被吸附和固定，并且耕地中的可溶性磷易隨著灌溉和降雨流失，這不僅導致了磷肥的當季利用率低下，也造成耕地土壤無效磷庫的逐年增長，更引發(fā)了許多環(huán)境問題[4-5]。小麥是中國第二大糧食糧作物，在種植過程中普遍面臨著土壤有效磷不足的問題；隨著人口的不斷增長、生活質量需求的不斷提高和不斷縮小的耕地面積，培育穩(wěn)產、高產的耐低磷脅迫小麥迫在眉睫[6-7]。因而發(fā)掘新的耐低磷脅迫基因，通過轉基因技術創(chuàng)制耐低磷脅迫小麥具有重要的實際意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，在擬南芥、煙草、水稻等植物低磷逆境脅迫研究中發(fā)現(xiàn)了許多起重要作用的轉錄因子。其中WANG等[8]和Rubio等[9]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個以AtPHR1蛋白為中心的磷信號調控網絡，AtPHR1蛋白屬于MYB-CC家族轉錄因子，能在低磷條件下調控其下游基因的表達（如磷轉運蛋白基因等），增強擬南芥對磷及其他元素的吸收，提高其對低磷的耐受性，該基因還能通過增加單穗的結實率從而促進轉基因小麥的增產。Devaiah等[10]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了WRKY型轉錄因子AtWRKY75，它的表達受低磷脅迫誘導，并且其RNAi突變體對低磷的敏感度更高，表現(xiàn)出提早的花青素積累。Sano等[11]發(fā)現(xiàn)，給受到低磷脅迫的煙草BY2細胞補充磷元素能夠誘導（bZIP類）的表達。Yi等[12]在水稻中發(fā)現(xiàn)了（表達bHLH型轉錄因子），在水稻低磷處理條件下，過表達能提高水稻對磷的吸收，表現(xiàn)在轉基因植株根系和莖生物量的增加，進而提升轉基因水稻的低磷耐受性。Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)大豆在低磷脅迫條件下能誘導的表達，其表達產物通過與GmSPX1互作，對大豆應答低磷脅迫中起負調控作用?；谇叭说难芯?，表明不同類型的轉錄因子在植物對抗低磷非生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用?！颈狙芯壳腥朦c】擬南芥AtTGA4屬于bZIP轉錄因子家族成員，Zhong等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中能被干旱和低氮脅迫誘導表達，該基因的過表達可以顯著提高轉基因擬南芥的抗旱性，但是還未有任何與植物低磷脅迫響應相關的研究報導。而本研究將通過基因槍介導法轉化至常規(guī)小麥品種石4056中，通過PCR檢測獲得4個穩(wěn)定轉基因小麥株系，用以進行田間低磷脅迫試驗?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過試驗鑒定轉小麥的低磷耐受性，創(chuàng)制耐低磷脅迫轉基因小麥新材料，分析提高石4056小麥低磷耐受性的生理機制，為小麥耐低磷脅迫分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及種植條件

采用最小表達框的基因槍轉化法，將和分別與只含有啟動子（Ubiquitin）、目的基因、終止子（Nos）的DNA片段連接，通過轟擊石4056小麥的愈傷組織，共獲得7株T0代陽性植株。后經逐年的篩選、鑒定和繁育，共獲得4個穩(wěn)定遺傳的T3代轉基因株系供試，依次命名為AtTGA4-L1、AtTGA4-L2、AtTGA4-L3和AtTGA4-L4。

試驗地位于北京市順義區(qū)后桑園村中國農業(yè)科學院順義試驗基地（40o18′N，116o28′E）。2015年10月秋播前，以S型土樣采集辦法在不同營養(yǎng)地塊均勻的采集6份土樣，用以測定土壤中堿解氮、有效磷和速效鉀含量，后根據(jù)《北京市土壤養(yǎng)分指標評定規(guī)則》和測定結果進行施肥[15]。供試材料采用完全隨機區(qū)組的種植方式，通過自動播種機按照3.14×106·hm-2基本苗進行播種，每個種植小區(qū)6 m2（1.5 m×4 m），每個營養(yǎng)地塊3個生物學重復。播種后的日常田間管理由試驗基地相關責任人負責。

1.2 轉基因小麥的常規(guī)PCR檢測

采用GMO作物提取檢測試劑盒（TIANGEN）提取轉基因小麥全基因組DNA（于拔節(jié)期從每個轉基因株系中隨機選取10株對其倒二葉進行全基因組DNA的提?。?，并根據(jù)和Nos終止子序列、和Nos終止子序列通過DNAman軟件設計引物對其進行常規(guī)PCR檢測。

的檢測引物：正向引物為5′-TCAAGCT GATCATCTGAGACAT-3′；反向引物為5′-ATAAAAA CCCATCTCATAAATAACG-3′，擴增片段為300 bp。PCR反應體系為10 μL 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye（GenStar）、正向引物和反向引物各0.8 μL（10 μmol·L-1）、200—600 ng的DNA模板，補加蒸餾水至20 μL。PCR反應程序采用Touchdown的方法：95℃10 min；95℃30 s，58℃30 s（從第二個循環(huán)開始，每一輪循環(huán)降低0.5℃），72℃30 s，20個循環(huán)；95℃30 s，52℃30 s，72℃30 s，20個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。

的檢測引物：正向引物為5′-CGATTCCCAGT CATCAAGTG-3′；反向引物為5′-ATTCAGCGACTT CTGGCA-3′，擴增片段大小為380 bp。PCR反應體系為10 μL 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye（GenStar）、正向引物和反向引物各0.5 μL（10 μmol·L-1）、200—600 ng的DNA模板，補加蒸餾水至20 μL。PCR反應程序為95℃10 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，25個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。

擴增產物經1%濃度的瓊脂糖凝膠檢測并拍照。

1.3 轉基因小麥產量及部分農藝性狀分析

雖然產量及其農藝性狀受田間多種因素的影響，但其能直觀的反應出供試材料在實際農業(yè)生產環(huán)境下的產出狀況[16-19]。因此，在收獲期進行產量及以下農藝性狀的統(tǒng)計和分析：產量（kg·hm-2）由小區(qū)產量折算；分穗數(shù)（×104/hm2）則通過在小區(qū)長勢均勻的樣段中隨機選取2段1 m行長的樣段進行全分蘗數(shù)的統(tǒng)計，折算成小區(qū)實際分蘗數(shù)，進而換算；穗粒數(shù)則是在小區(qū)長勢均勻的樣段中隨機取完整的20個穗子進行穗粒數(shù)清點而得出。

1.4 轉基因小麥開花期部分生理指標的測定

1.4.1 PSⅡ原初光能轉化效率（Fv/Fm） 于晴天的14：00時在小區(qū)中隨機選取3棵單株，用捷克產的FluorPen手持葉綠素熒光儀進行原初光能轉化效率的測定。

1.4.2 葉綠素相對含量（SPAD） 于晴天在小區(qū)中隨機選取5棵單株，用產自日本的SPAD-502型葉綠素儀對其旗葉的葉基、葉片中部和葉尖進行葉綠素相對含量的測定，取平均值。

1.4.3 氣冠溫差（CTD） 于晴天的13：00至14：00時段，用德國產的Optris紅外測溫儀對供試材料小區(qū)的兩端和中部進行冠層溫度和大氣溫度的測量，通過計算得出氣冠溫差。

1.5 轉基因小麥不同組分磷含量的測定

為了比較轉基因材料與受體的磷吸收、利用能力，在小麥成熟末期對供試材料根、莖、葉和籽粒的磷濃度和吸收、殘留總量進行了測定和統(tǒng)計分析。

采用濃H2SO4-H2O2消煮法結合全自動流動分析儀測定供試材料不同組分磷濃度：小麥成熟后，從小區(qū)中選取10株長勢一致的小麥進行根、莖、葉、籽粒的分離，用蒸餾水洗凈后，烘干、稱重，并用FW100型高速萬能粉碎機（天津）進行充分粉碎；每份粉碎樣品稱取3份0.5000 g進行H2SO4-H2O2消煮，最后稀釋到合適的濃度并通過全自動流動分析儀進行全磷含量的測定[20]。由于根系無法完整的取樣，只能對成熟末期供試材料地上部各組分吸收、殘留總磷含量進行統(tǒng)計和分析。

1.6 轉基因小麥AtTGA4的定量表達分析

取正常營養(yǎng)條件下的轉基因株系苗期葉片，采用DP432植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取總RNA，反轉錄采用全式金公司的RNA反轉錄試劑盒，采用qPCR Master Mix（SYBR Green）試劑盒進行Real-time PCR分析。通過NCBI設計的正向引物為5′-TGGAGGCTTTGGTCAGCTTT-3′，反向引物為5′-ACGTTGGTTCACGTTGCCTA-3′；小麥內參所用正向引物為5′-TGCTATCCTTCGTTTGGAC CTT-3′，反向引物為5′-AGCGGTTGTTGTGAGGGAG T-3′[21]。

2 結果

2.1 基因槍法線性轉化片段

和線性轉化片段如圖1所示，由于轉化片段中不含有任何載體骨架序列，最大程度地減少了由于載體骨架序列可能帶來的安全風險；此外，由于和分別單獨構制在2個線性轉化片段中，為日后在轉基因材料后代中篩選篩除的轉基因株系提供了可能性。

圖1 線性轉化片段示意圖

2.2 轉基因小麥的PCR檢測

T4代轉基因小麥PCR檢測結果表明，已成功的整合受體石4056小麥基因組中，并穩(wěn)定的遺傳至T4代（圖2）；并沒有檢測到，說明在后代中發(fā)生了分離而被人為篩除，該轉基因材料中只含有目的基因，而不含有篩選標記基因。

M：DNA Marker；1：陽性質粒對照；2：陰性受體對照；3：空白對照；4和5：株系L1；6—8：株系L2

2.3 試驗地土壤養(yǎng)分含量測定結果及實際施肥情況

試驗地土壤養(yǎng)分含量測定結果顯示，正常和低磷處理土壤中有效氮、磷、鉀養(yǎng)分的含量都比較一致。其中，正常和低磷處理中速效鉀含量分別為256.39和254.54 mg·kg-1；堿解氮的含量則都偏高，分別為91.68和83.08 mg·kg-1，有效磷的含量則都偏低，分別為34.59和32.64 mg·kg-1。因此，在播種前分別施與適當?shù)牡剩蛩兀┖土追剩ㄟ^磷酸鈣），實際施肥情況如下：正常處理地塊施加過磷酸鈣（812.39 kg·hm-2）和尿素（97.57 kg·hm-2）；而低磷處理地塊則只施加尿素（97.57 kg·hm-2）。

2.4 灌漿期田間表型

研究發(fā)現(xiàn)的2個轉基因株系L1和L2在灌漿期相對于受體石4056表現(xiàn)出一定的生長優(yōu)勢。其中，株系L1的表型尤其明顯（圖3），在正常營養(yǎng)條件下，株系L1與受體長勢基本一致；而在低磷處理條件下，受體明顯比株系L1提早結束灌漿，主穗普遍提早變黃。

圖3 灌漿期田間表型

2.5 低磷對轉基因小麥產量及部分農藝性狀的影響

從產量及部分農藝性狀的統(tǒng)計結果（表1）可以看出，2個轉基因株系在正常和低磷處理條件下的產量都顯著高于受體，增幅在4.45%—8.60%；低磷對供試材料的株高沒有明顯的影響，但是普遍都降低了植株的分蘗和單穗結實率，表現(xiàn)在低磷處理條件下，供試材料的分蘗數(shù)和穗粒數(shù)都較正常營養(yǎng)條件下的低，分蘗減少9.84%—15.24%，穗粒數(shù)減少10.07%—13.38%；相反的，磷養(yǎng)分的缺少反而促進了供試材料籽粒重量的增加，表現(xiàn)在低磷脅迫條件下供試材料的千粒重都較正常條件下的要高，并且轉基因株系L1和L2在低磷條件下的千粒重顯著比受體提高8.10%—9.91%。該統(tǒng)計結果表明，低磷脅迫雖然促進了供試材料籽粒重量的增加，但由于普遍降低了其分蘗和單穗結實率，以致產量的下降；但由于2個轉基因株系在不同處理條件下的分蘗和穗粒數(shù)與受體相當，籽粒重量比受體高，因而導致轉基因材料在正常和低磷脅迫條件下的產量都要顯著高于受體。

2.6 低磷對轉基因小麥開花期部分生理指標的影響

如圖4田間部分生理指標測定結果所示，在開花期，供試材料在低磷處理條件下的Fv/Fm都比正常條件下要低，降幅在8.40%—11.40%，正常營養(yǎng)條件下供試材料的Fv/Fm無明顯差別；而低磷處理條件下，2個轉基因株系L1和L2的光合速率都顯著強于受體。開花期氣冠溫差測定結果表明，低磷條件下，2個轉基因株系的CTD值都顯著高于受體，表明轉基因株系開花期體內水分代謝強度都要顯著強于受體。然而開花期SPAD的測定結果卻顯示低磷脅迫對受體和轉基因株系的葉綠素相對含量都沒有表現(xiàn)出很明顯的負面影響作用，受體和轉基因株系之間的葉綠素相對含量也沒有明顯的差別。

表1 產量和部分農藝性狀統(tǒng)計分析

*在0.01＜＜0.05時差異顯著，**在＜0.01時差異極顯著。下同

* means significant difference at 0.01＜＜0.05, ** means extremely significant difference at＜0.01. The same as below

轉基因株系與受體在相應營養(yǎng)條件下的顯著性分析，*在0.01＜P＜0.05時差異顯著。下同

2.7 低磷對轉基因小麥不同組分磷含量的影響

成熟末期，供試材料不同組織部位磷濃度測定結果如圖5所示，受低磷條件的影響，供試材料在低磷脅迫條件下的各組分磷濃度都有不同程度的下降。在低磷處理條件下，2個轉基因株系的莖桿磷濃度都要顯著高于受體，L1和L2株系的莖桿磷濃度是受體的1.37—1.52倍，株系L1的葉片磷含量和L2的籽粒磷濃度也較受體顯著提高；正常條件下的則都無顯著差異。

雖然轉基因材料不同組分的磷濃度在除了莖桿以外的其他組織中相對于受體而言沒有普遍的差異，但是成熟末期地上部各部位的磷吸收、殘留總量統(tǒng)計結果（表2）卻顯示，2個轉基因材料在莖桿、葉片中的磷殘留總量在低磷脅迫條件下顯著的高于受體，籽粒吸收的總磷含量在低磷條件下也顯著的比受體高，而2個轉基因材料在低磷營養(yǎng)脅迫條件下的莖桿、葉片和籽粒干重未發(fā)現(xiàn)有顯著差異，這可能與作物開花后葉片、莖桿等組織中磷養(yǎng)分的再利用與分配有關[22-23]。結果表明，轉基因小麥材料在低磷脅迫條件下地上部各部位對磷的保有能力都要顯著高于受體石4056；低磷條件下，轉基因小麥地上部整體總磷含量較受體增幅達6.38%—17.47%。

2.8 轉基因材料AtTGA4的定量分析

為了解釋2個轉基因株系在應對低磷脅迫時的表現(xiàn)差異，通過qRT-PCR分析，結果（圖6）顯示，以株系L1中的表達量為標準，株系L2中目標基因的表達量要比株系L1的低，是株系L1中的0.69倍。

轉基因株系與受體在相應營養(yǎng)條件下的顯著性分析。**在P＜0.01時差異顯著

表2 各組分磷吸收、殘留總量統(tǒng)計結果

圖6 轉基因材料中AtTGA4的qRT-PCR分析

3 討論

AtTGA4轉錄因子是bZIP轉錄因子家族成員之一，其亮氨酸拉鏈區(qū)能夠特異的識別并結合TGACG調控序列，對靶基因進行轉錄激活/抑制的調節(jié)，參與植物抵御眾多生物/非生物逆境脅迫的反應[24-26]。已有研究表明，不同物種、同一物種的不同基因型間對磷吸收和利用效率存在著遺傳差異[8]。小麥屬于異源六倍體植物，基因組龐大，遺傳背景相對于玉米、水稻等其他作物要復雜得多[27]。在擬南芥中已經發(fā)現(xiàn)了一個以PHR為中心的調控網絡，在水稻、小麥等植物中也發(fā)現(xiàn)了其同源基因。擬南芥AtPHR1能夠識別并結合到其下游基因啟動子的P1BS順式作用元件上，調控其表達，參與植物應對低磷營養(yǎng)脅迫，而有研究表明，大多數(shù)磷饑餓響應基因的啟動子區(qū)都擁有P1BS結構域[9,28-29]。植物一方面在不同的生長階段對營養(yǎng)的需求有很大的不同，另一方面由于體內代謝的需要，養(yǎng)分在植物體內的分配與再利用也隨著生長階段的變化而在不斷的調整中[30-31]。但是到了生殖生長后期，絕大多數(shù)一年生植物都會調動營養(yǎng)器官中的養(yǎng)分向生殖器官進行轉運和再利用，以繁衍后代[32-33]。小麥與同源，研究發(fā)現(xiàn)，在小麥中過表達能夠增強轉基因小麥在低磷營養(yǎng)條件下對磷養(yǎng)分的吸收，并主要通過穗粒數(shù)的增加而致使增產，但是吸收的總磷量轉化效率（磷收獲指數(shù)）并沒有提升[8]；同樣的，這種磷養(yǎng)分吸收的增加在和的過表達株系低磷脅迫研究中也出現(xiàn)過[34-35]。在本研究中，過表達轉基因小麥株系在田間低磷營養(yǎng)脅迫條件下主要通過籽粒重量的增加而導致增產，這可能與轉基因株系開花期較強的養(yǎng)分吸收和延長的灌漿期有關；此外，成熟期轉基因株系低磷脅迫條件下地上部各部位磷吸收、殘留總量都顯著比受體要高，表明增強了小麥在低磷條件下對磷的吸收和磷養(yǎng)分由根系向地上部運輸?shù)膹姸?，這與Nilsson[34]和Zhou[35]等關于PHR1類蛋白的研究結果相似。但是，在小麥應對低磷營養(yǎng)脅迫中發(fā)揮的作用又與不盡相同，在本研究中轉基因小麥材料在正常和低磷營養(yǎng)條件下的分蘗和穗粒數(shù)都與受體無明顯差異，反而是千粒重相對于受體得到了明顯的增加。目前還沒有數(shù)據(jù)證明與有關聯(lián)。

土壤中磷養(yǎng)分的缺乏會降低植株葉片光合速率及各項葉綠素熒光參數(shù)（Fv/Fm，最大熒光等）[36]，與本研究開花期Fv/Fm測定結果相同，供試材料低磷條件下的Fv/Fm都低于正常營養(yǎng)條件下的，但轉基因株系在低磷條件下的Fv/Fm仍舊顯著高于受體；而根系對土壤中養(yǎng)分的吸收、葉片光合作用對CO2的同化作用是植物體正常生長發(fā)育的基礎，直接或間接的影響了作物產量的形成[37]。在光合作用中，光合色素對光能的吸收、轉換和傳遞起著至關重要的作用，但是光合色素含量的高低與光合速率并無偶聯(lián)關系[38]。本研究中，供試材料在開花期低磷條件下的SPAD與正常營養(yǎng)條件下的相當，同一營養(yǎng)條件下受體與轉基因株系間的SPAD也無明顯差異；此外，雖然CTD通常在評價植物抗旱強弱方面作為一個關鍵性指標，其往往反映的是植物從土壤中吸收有限水分進行體內各種生理代謝的能力，但是在土壤水分供應充足的情況下，通過測定CTD也能反映出不同植物、不同品系間體內生理代謝的強弱差異[39-40]，在本研究中，轉基因株系在開花期兩種營養(yǎng)條件下的CTD都普遍高于受體，表明轉基因株系在開花期午間時段的體內生理代謝水平要比受體強，有利于光合作用的碳同化。

此外，由于外源基因的插入位點、插入拷貝數(shù)以及受體自身轉錄翻譯調控等原因，不同轉基因株系在應對外界生物/非生物脅迫時會產生不同程度的響應。本研究中，轉基因株系L1在正常和低磷營養(yǎng)條件下的畝產、籽粒/地上部磷吸收總量和不同組織的磷濃度表現(xiàn)都要普遍優(yōu)于株系L2，這剛好與株系L1中較高的表達量相對應，表明株系L1在應對低磷脅迫時相對于株系L2在各方面變現(xiàn)出來的優(yōu)越性可能與其較高的表達有關。本研究從表型、產量及農藝性狀等方面初步分析了提高石4056小麥低磷脅迫耐受性的生理機制，相關的作用機理有待后續(xù)進一步的深入研究。

4 結論

在低磷脅迫條件下，轉小麥產量及各項生理生化指標均有提升，顯著提高了轉基因小麥對低磷脅迫的耐性。

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（責任編輯 李莉）

Functional Analysis ofTransgenic Wheat Tolerance to Low Phosphorus Stress in Field

Ling BingQi1, Bai XingXuan2, Zhou YongBin2, Wang ChunXiao2, Xu ZhaoShi2, Ma YouZhi2, Chen Ming2, Zhang XiaoHong1

(1College of Life Sciences, Northwest A & F University, Yangling 712100, Shaanxi;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

【Objective】In previous work, we had proven that a bZIP type transcription factor gene,can improve the drought resistance and low nitrogen tolerance of transgenic. In this study,was transformed into wheat to identify the tolerance of transgenic wheats to low phosphorus stress in field. At the same time, the physiological mechanism ofgene to improve the stress resistance of transgenic wheats was analyzed, which laid the foundation for the molecular breeding of wheat tolerant to low phosphorus stress. 【Method】Used particle bombardment method of minimal expression box to co-transformand marker geneinto wheat variety Shi4056. After transformation, we screened many transgenic wheat lines withoutgene and withgene through PCR assay. In field experiment, base on fertilizer nutrient content in soil we applied different levels of phosphate, which led to low phosphorus stress in soil.transgenic wheat lines were tested under low phosphorus. During the flowering stage some physiological indexes were identified such as light efficiency of the light system Ⅱ (Fv/Fm), the relative content of chlorophyll (SPAD) and crown the temperature difference (CTD), and other agronomic traits were investigated, during mature stage such as plants height, tiller number, grains per spike in mature period, and some values such as the grain yield and phosphorus concentration and phosphorus uptake in different components in wheat (root, stem, leaf and grain) were measured and data statistic analysis were completed. 【Result】PCR analysis showed thatgene had been stable heritability for T4generation in Shi4056 and four stable transgenic lines were obtained. According to the results of soil nutrient content, 812.39 kg·hm-2of superphosphate was applied to normal plots, and no phosphorus was applied in low phosphorus treatment plots. The statistical results of yield and agronomic characters showed that the grain yield oftransgenic lines L1 and L2 increased compared to wild type (WT) significantly under normal condition and low phosphorus stress. Under normal conditions the yield of transgenic wheat increase of 5.3%-8.6%, and under low phosphorus stress grain yield of transgenic wheat increased of 4.4%-7.7%. Thousand seed weight oftransgenic wheat increased significantly than WT. The results of physiological indexes assay in field showed that the Fv/Fm and CTD of transgenic lines L1 and L2 were significantly better than those of WT under the condition of low phosphorus, while SPAD had no significant difference. We found that under low phosphorus stress WT were in early grain filling than the transgenic wheat, and the ears turn yellow early in WT than that in transgenic wheat plants. The phosphorus content assay during the late mature stage showed that the phosphorus concentration in the stems of L1 and L2 of transgenic lines increased significantly compared with that of WT under the condition of low phosphorus, but there was no significant difference in other tissues. Under the condition of low phosphorus, the total phosphorus content in stems and leaves and grains of two transgenic lines was higher than that of WT, and the total phosphorus content in the aerial part increased by 6.38%-17.47%. qRT-PCR results oftransgenic wheat showed that the expression ofLine 2 (L1) was 0.69 times lower than that of Line 1 (L1). 【Conclusion】The above results showed that under the condition of low phosphorus stress,can improve the uptake and transportation of phosphorus in transgenic wheat plants, and increase the yield of transgenic plants, and further enhance the tolerance of transgenic wheat to low phosphorus stress.

transgenic wheat;; low phosphorus stress; yield; physiological index

2018-01-29；

2018-04-06

轉基因生物重大專項（2016ZX08002-005）

凌炳琦，E-mail：370135413@qq.com。

張小紅，E-mail：zhxh2493@126.com