低溫風(fēng)干型醬鴨加工過程中脂質(zhì)氧化特性

程珂萌，周昌瑜，潘道東,2,*，曹錦軒，曾小群，孫楊贏，吳 振

（1.寧波大學(xué) 浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室，浙江 寧波 315211；2.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院食品科學(xué)與營養(yǎng)系，江蘇 南京 210097）

醬鴨作為中國傳統(tǒng)醬鹵肉制品，因肉質(zhì)鮮嫩、風(fēng)味獨特而深受人們喜愛。傳統(tǒng)的醬鴨加工工藝主要有腌制和醬制[1-2]，其風(fēng)味形成有限，不能滿足消費(fèi)者對醬鴨風(fēng)味的追求[3]。近年來的研究指出，風(fēng)干能有效改進(jìn)干腌肉品的風(fēng)味缺陷，腌制后引入高溫風(fēng)干，其可增加腌肉制品的風(fēng)味，但會使其口感變硬，不易咀嚼[4]。而低溫風(fēng)干作為肉制品重要的加工工藝，其可以促進(jìn)腌肉制品的脂質(zhì)分解氧化，加速游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）的積累，形成腌肉制品特有的風(fēng)味[5]。低溫風(fēng)干工藝已在風(fēng)鴨、干腌鵝肉和干腌馬肉的加工中被廣泛研究[5-7]，而醬鴨的生產(chǎn)有著自己獨特的加工方式，低溫風(fēng)干在醬鴨的生產(chǎn)中對醬鴨風(fēng)味品質(zhì)的影響目前尚不清楚，其對醬鴨脂質(zhì)氧化的貢獻(xiàn)也未被研究。

脂質(zhì)氧化作為衡量肉品品質(zhì)和可接受性的重要參數(shù)，對肉制品的化學(xué)和感官特性起重要作用。在肉品加工過程中，肌內(nèi)脂質(zhì)通過脂質(zhì)水解和氧化逐漸降解。脂質(zhì)水解主要包含甘油三酯和磷脂的水解[5]。研究發(fā)現(xiàn)，肉類產(chǎn)品脂質(zhì)水解形成的FFA可能主要來源于磷脂的水解，如鴨肉、香腸和火腿等[8-10]。脂質(zhì)水解產(chǎn)生FFA是揮發(fā)性化合物的主要前體物質(zhì)[6]，這些前體物質(zhì)會進(jìn)一步發(fā)生氧化形成小分子的風(fēng)味物質(zhì)。其中，脂質(zhì)氧化包括脂肪酸的自動氧化和酶促氧化，會產(chǎn)生大量的氫過氧化物，這些氫過氧化物不穩(wěn)定，會進(jìn)一步分解成小分子的醛類、醇類、酮類和呋喃類等揮發(fā)性風(fēng)味化合物[6]。所以，脂質(zhì)氧化與肉類風(fēng)味形成直接相關(guān)[11]。此外，張培培等[12]研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的氫過氧化物和自由基也能促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化。目前，脂質(zhì)氧化研究大多集中在干腌肉制品和發(fā)酵肉制品[6-7,9-10]中，但醬鹵肉制品脂質(zhì)氧化研究還較少，所以低溫風(fēng)干對醬鴨加工過程中脂質(zhì)氧化特性和醬鴨品質(zhì)的影響值得深入地研究和闡釋。

鑒于此，本實驗引入低溫風(fēng)干制備醬鴨，并研究原料、腌制、風(fēng)干、醬制、殺菌等工藝點中鴨肉的pH值、磷脂、FFA、過氧化值（peroxide values，POV）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值和揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值的變化規(guī)律，以期為醬鴨加工過程中脂質(zhì)氧化機(jī)理提供理論支撐和改善醬鴨品質(zhì)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番鴨（（90±5）日齡，雄鴨） 寧波市售；37 種脂肪酸混標(biāo)和十七烷酸標(biāo)品 美國Sigma公司；二氯甲烷、正己烷、異丙醇、乙腈、甲醇和二丁基羥基甲苯均為色譜純；氯仿、14%三氟化硼-甲醇溶液、二氯甲烷、乙酸、乙醚、碘化鉀、硫代硫酸鈉、TBARS、三氯乙酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HSW型智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱 浙江寧波江南儀器廠；FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BSKSD071半定量定氮儀 寧波市鄞州百順實驗儀器設(shè)備有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 杭州億捷科技有限公司；5977A-7890B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀安捷倫科技（中國）有限公司；ACQUITYTM超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-f l ight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）聯(lián)用儀 美國Waters公司；Infinite 200 Pro全波長掃描多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備和取樣

低溫風(fēng)干型醬鴨工藝流程：原料肉→腌制→風(fēng)干→預(yù)煮→清洗→醬制→冷卻→真空包裝→高溫滅菌。

原料肉：取宰后24 h的42 只新鮮番鴨鴨肉；腌制：按100 kg鴨肉計，將8 kg食鹽、5 g亞硝酸鈉拌勻，在4 ℃干腌2.5 h，再在18 ℃用飽和食鹽水中濕腌2.5 h；風(fēng)干：將腌制鴨肉，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中風(fēng)干，其風(fēng)干溫度12 ℃，風(fēng)干相對濕度65%，風(fēng)干時間24 h；預(yù)煮：風(fēng)干后的鴨坯，放入鍋中，清水浸沒，煮沸10 min后撈出，要求預(yù)煮到肉塊中心無血水；清洗：用冷水將煮好的鴨坯洗凈，并瀝干水分；醬制：按100 kg鴨肉計，添加醬油3 kg、白糖2 kg、生姜5 kg、料酒5 kg、鹽2 kg、焦糖色0.9 kg，小火燉60 min，味精待起鍋前適量加入；冷卻：冷卻至室溫；真空包裝：將鴨肉裝入高溫蒸煮袋中進(jìn)行真空包裝；高溫滅菌：滅菌條件采用121 ℃、15 min，滅菌后迅速冷卻。

參照已有研究[2,4-5]，選取原料、腌制后、風(fēng)干6 h、風(fēng)干12 h、風(fēng)干24 h、醬制后、殺菌后這7個工藝點的鴨胸肉作為樣品來分析低溫風(fēng)干型醬鴨加工過程中脂質(zhì)氧化特性變化規(guī)律，選取3 個重復(fù)，將樣品置于-80 ℃冷凍貯藏，以進(jìn)行后續(xù)測定。

1.3.2 pH值的測定

參照Henning等[13]的方法，略作修改。準(zhǔn)確稱取去除可見皮下脂肪和結(jié)締組織的肌肉10.0 g，加入50 mL蒸餾水，用高速分散器于12 000 r/min冰浴勻漿3 次、每次15 s、間歇30 s，室溫靜置15 min，然后按照pH計操作流程測定樣品懸浮液的pH值。

1.3.3 磷脂組分的提取和測定

參照Vasta[14]和Jerónimo[15]等的方法提取脂質(zhì)，略作修改。去除鴨胸肉的可見皮下脂肪和結(jié)締組織，準(zhǔn)確稱取肌肉3.0 g，切碎，加入50 mL二氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）溶液混合，靜置l h，過濾加入0.2 倍體積的生理鹽水（7.3 g/L NaCl、0.5 g/L CaC12），3 000 r/min離心15 min，取下層液體，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（44 ℃），蒸干其中的有機(jī)溶劑，得到總脂質(zhì)，貯存于-40 ℃冰箱中。

磷脂提取參照García Regueiro等[16]的方法。20.0 mg總脂質(zhì)提取物溶解于1.0 mL氯仿中，將0.5 mL的溶液轉(zhuǎn)移到氨丙基硅膠小柱（100 mg、1 mL），在轉(zhuǎn)移之前，將其用1.0 mL氯仿進(jìn)行活化。該微柱用2.0 mL氯仿-異丙醇（2∶1，V/V）溶液清洗，以除去烴類、膽固醇酯類和甘油三酯，然后用3.0 mL乙酸-乙醚（2∶98，V/V）除FFA。最后，用3.0 mL甲醇洗脫出磷脂。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，殘余物溶解在0.3 mL流動相C己烷-異丙醇-水（120∶80∶11，V/V）溶液。

將處理好的樣品，用UPLC-Q-TOF-MS儀器進(jìn)行檢測。液相色譜條件使用C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫55 ℃，進(jìn)樣量5 μL，流速400 μL/min。正離子模式使用不同比例的流動相：A乙腈-水（60∶40，V/V）和B異丙醇-乙腈（90∶10，V/V），流動相體系含10 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸。負(fù)離子模式使用不同比例的流動相：A乙腈-水（60∶40，V/V）和B異丙醇-乙腈（90∶10，V/V）。梯度洗脫程序：60% A-40% B（初始）；57% A-43% B（0～2 min）；46% A-54% B（2～12 min）；1% A-99% B（12～18 min）；60% A-40% B（18～20 min）。質(zhì)譜條件：電噴霧電離，正/負(fù)離子化模式，毛細(xì)管電壓為3.0 kV（正離子）/2.8 kV（負(fù)離子），錘孔電壓為35 V（正離子）/50 V（負(fù)離子），去溶劑氣溫度550 ℃，氣流速率700 L/h，離子源溫度120 ℃，采集范圍m/z 50～2 000。采用峰面積歸一法定量。

1.3.4 FFA的提取和測定

參照Soriano等[17]的方法，略作修改。FFA分離采用氨丙基硅膠小柱（100 mg、1 mL），小柱用3 mL二氯甲烷溶液活化，10 mg脂質(zhì)溶于4 mL 0.2 g/L二丁基羥基甲苯/正己烷溶液中，再用5 mL 2%乙醚-乙酸溶液洗脫，而后用N2吹干，添加20 μL 10 mg/mL的十七烷酸作為內(nèi)標(biāo)，加入1 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，50 ℃水浴20 min使脂肪酸甲酯化，脂肪酸甲酯化產(chǎn)物用2 mL正己烷溶液提取，取樣液1 mL進(jìn)樣分析。

色譜柱：DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm），升溫程序：從100 ℃以10 ℃/min的升溫速率，線性升溫至200 ℃，保持5 min，以2 ℃/min的升溫速率，線性升溫至230 ℃，保持10 min，以10 ℃/min的升溫速率，線性升溫至240 ℃，載氣（He）流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，分流比5∶1。

電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度240 ℃；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～500。采用混標(biāo)進(jìn)行定性和定量。

1.3.5 POV的測定

參照GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》[18]的方法。

1.3.6 TBARS值的測定

參照Wang Ying等[6]的方法，略作修改。準(zhǔn)確稱取去除鴨胸肉可見皮下脂肪和結(jié)締組織的肌肉2.0 g，切碎，加入10 mL 17.5%的三氯乙酸溶液，在冰水浴中以32 000×g均漿2×10 s，過濾，加入1 mL 0.02 mol/L TBARS溶液，于沸水浴加熱40 min，取出冷卻后以2 000×g離心5 min，上清液中加1 mL氯仿?lián)u勻，靜置分層后取上清液分別在532 nm和600 nm波長處比色，記錄吸光度并用以下公式計算：

1.3.7 TVB-N值的測定

參照GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[19]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 7.0軟件對pH值、磷脂組分、FFA、POV、TBARS值和TVB-N值進(jìn)行單因素方差及顯著性分析（Duncan’s multiple range test），統(tǒng)計學(xué)顯著水平設(shè)定為0.05，極顯著水平設(shè)定為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬鴨加工過程中pH值的變化

如圖1所示，醬鴨加工過程中pH值呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢，從原料肉到腌制結(jié)束顯著降低，而在醬制階段顯著升高（P＜0.05）。在醬鴨加工過程中，pH值經(jīng)腌制后顯著降低，這與熏肉腌制階段的變化一致[20]。風(fēng)干階段無顯著性變化。醬制后顯著升高，可能是加熱使蛋白變性，蛋白中穩(wěn)定的化學(xué)鍵遭到破壞，酸性基團(tuán)減少，同時，脂質(zhì)氧化可能產(chǎn)生堿性或中性分解產(chǎn)物，引起肌肉pH值升高[20-21]。醬鴨的pH值范圍為5.62～6.10，與鹵鴨pH值范圍6.02～6.40不同，可能是因為鴨肉品種和加工工藝的不同[22]。

圖1 醬鴨加工過程中pH值的變化Fig.1 Changes in pH during the processing of sauced duck

2.2 醬鴨加工過程中磷脂組分的變化

表1 醬鴨加工過程中磷脂分子種類的變化Table1 Changes in phospholipid composition during the processing of sauced duck%

醬鴨加工過程中主要的磷脂組分包括腦磷脂（phosphatidylethanolamine，PE）和卵磷脂（phosphatidylcholine，PC）。如表1所示，醬鴨殺菌后成品中主要的磷脂組分是PE（C16∶0/C20∶4）、PE（C16∶0/C18∶1）、PE（C16∶0/C22∶5）、PE（C16∶0/C22∶4）和PE（C16∶0/C22∶6），分別占27.43%、16.36%、14.41%、11.19%和8.90%。其中，PE（C16∶0/C20∶4）在風(fēng)干6 h顯著升高，PE（C16∶0/C22∶4）和PE（C16∶0/C18∶1）在風(fēng)干結(jié)束顯著降低，在醬制階段增加。醬鴨成品的PC組分中PC（C16∶0/C22∶5）含量最高，且PC（C16∶0/C22∶5）在殺菌結(jié)束顯著升高（P＜0.05）。

醬鴨中主要的PE組分與高郵鴨中主要的PE組分不同，可能因為鴨肉品種和飼養(yǎng)條件的不同[8]。PE（C16∶0/C20∶4）、PE（C16∶0/C18∶1）、PE（C16∶0/C22∶6）和PC（C16∶0/C22∶5）在鴨蛋黃中也有檢出[23]。醬鴨加工過程中，PC和PE在磷脂組分中比例較高，以PE占主導(dǎo)地位。且根據(jù)醬鴨PE分子種類和變化趨勢的結(jié)果，推測肌內(nèi)磷脂的sn-1和sn-2位置可能優(yōu)先被飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）和多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）占據(jù)。

2.3 醬鴨加工過程中FFA含量的變化

表2 醬鴨加工過程中FFA含量的變化Table2 Changes in free fatty acid composition during the processing of sauced duckmg/g

在醬鴨不同加工階段，各種FFA含量的變化如表2所示。棕櫚酸（C16∶0）、硬脂酸（C18∶0）和油酸（C18∶1）是構(gòu)成原料的主要FFA。而C18∶1在風(fēng)干6 h顯著升高，棕櫚油酸（C16∶1）在風(fēng)干12 h和殺菌階段顯著升高。而C16∶0在殺菌階段顯著降低。在成品中，含量較高的FFA為C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1和二十碳二烯酸（C20∶2）。單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）和總FFA含量均在風(fēng)干12 h顯著升高，風(fēng)干24 h時降低。而PUFA含量在醬制階段升高（P＜0.05）。

醬鴨加工過程中主要的FFA是C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1和C20∶2，其中，C16∶0、C18∶0和C18∶1也是風(fēng)鴨、干腌鵝肉和干腌馬肉加工中被廣泛研究[5-7]的主要FFA。C18∶1在風(fēng)干6 h顯著升高， 而C16∶1在風(fēng)干12 h升高，這可能是脂質(zhì)分解酶作用的結(jié)果[24]。而C16∶0和SFA隨著醬制和殺菌的進(jìn)行，含量降低，這說明在醬制和殺菌過程中加熱作用的進(jìn)行，SFA發(fā)生酯化反應(yīng)降解生成低分子物質(zhì)，低分子物質(zhì)通過聚合又生成新物質(zhì)，致使SFA含量下降[25]。MUFA和總FFA含量均在風(fēng)干12 h顯著升高，說明風(fēng)干中期脂質(zhì)分解酶活力較強(qiáng)，促使脂質(zhì)降解，而在風(fēng)干結(jié)束降低，說明脂質(zhì)分解的同時也伴隨著氧化的發(fā)生[24]。PUFA在醬制后大量積累，說明煮制工藝促使甘油三酯和磷脂水解出不飽和脂肪酸，且PUFA易于氧化[9]，促使更高含量的MUFA的形成，使C16∶1在殺菌階段顯著升高。醬制后SFA、MUFA、PUFA和總FFA的變化與鹵豬肉高溫煮制1 h研究的結(jié)果一致[26]。

2.4 醬鴨加工過程中POV的變化

圖2 醬鴨加工過程POV的變化Fig.2 Changes in POV during the processing of sauced duck

如圖2所示，在醬鴨加工過程中，POV從原料肉到醬制肉顯著升高，殺菌后降低（P＜0.05）。POV反映脂質(zhì)氧化初級氧化產(chǎn)物（過氧化氫）的積累量，通過測定過氧化氫的含量，判斷肉制品脂質(zhì)氧化的程度[27]。醬鴨加工中POV從原料肉至風(fēng)干結(jié)束持續(xù)增加，說明腌制和風(fēng)干階段脂質(zhì)氧化達(dá)到一定程度的快速鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使氫過氧化物的生成速率大于其分解速率[5]，這與靳靜靜等[4]研究的醬鴨在腌制和風(fēng)干階段報道的結(jié)果一致。在醬制階段，脂質(zhì)受熱氧化分解，導(dǎo)致POV上升，這與雷辰等[28]報道的結(jié)果一致。殺菌結(jié)束，因為高溫高壓作用，過氧化氫發(fā)生氧化生成醇、醛等二級氧化產(chǎn)物，使POV降低[29]。

2.5 醬鴨加工過程中TBARS值的變化

圖3 醬鴨加工過程TBARS值的變化Fig.3 Changes in TBARS values during the processing of sauced duck

如圖3所示，在醬鴨加工過程中，TBARS值在腌制、風(fēng)干24 h和醬制后顯著升高（P＜0.05），殺菌結(jié)束降低。TBARS值是評價脂質(zhì)次級氧化產(chǎn)生的以丙二醛為代表的氧化產(chǎn)物的程度，可以更準(zhǔn)確地評價脂質(zhì)氧化程度[29]。從原料肉到腌制肉，TBARS值上升，該結(jié)果表明8%鹽含量具有促氧化作用。隨著風(fēng)干的進(jìn)行，脂質(zhì)初級氧化產(chǎn)物分解氧化的速率大于其生成的速率，脂質(zhì)二級氧化產(chǎn)物快速增加，TBARS值升高，這與醬香風(fēng)鴨[30]研究結(jié)果一致。醬制后，溫度升高促使TBARS值持續(xù)升高。殺菌后TBARS值的下降可能是由于高溫高壓使TBARS分解氧化速率大于生成速率。此外，醛可以進(jìn)一步分解成不能通過TBARS測定方法確定的其他氧化產(chǎn)物，如有機(jī)醇和羧酸等[31]。

2.6 醬鴨加工過程中TVB-N值的變化

圖4 醬鴨加工過程TVB-N值的變化Fig.4 Changes in TVB-N values during the processing of sauced duck

如圖4所示，原料肉的TVB-N值為8.09 mg/100 g樣品，在腌制、醬制、殺菌階段TVB-N值顯著降低，風(fēng)干階段顯著升高（P＜0.05）。TVB-N值是評價肉制品品質(zhì)和安全性的重要指標(biāo)[32]。從原料肉到腌制肉，鹽分抑制鴨肉中微生物的繁殖，同時降低鴨肉中酶的活性，使微生物和酶對鴨肉蛋白質(zhì)的降解作用受到抑制[33]，因此腌制后能使TVB-N值下降，這與李曉燕等[34]的報道相似。風(fēng)干階段，微生物和酶對蛋白質(zhì)的分解作用增強(qiáng)，促進(jìn)TVB-N值升高；醬制殺菌階段TVB-N值降低，是因為加熱和高壓作用使大量酶活力喪失，使其對鴨肉蛋白質(zhì)降解作用下降[33]。

2.7 各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

表3 醬鴨加工過程中各指標(biāo)之間的Pearson相關(guān)系數(shù)Table3 Pearson correlation coeff i cients among all parameters during the processing of sauced duck

如表3所示，在醬鴨加工過程中，PUFA與pH值（R=0.90，P＜0.01），總FFA與MUFA（R=0.92，P＜0.01）、PUFA與TBARS值（R=0.80，P＜0.01）、TBARS值與POV（R=0.89，P＜0.01）、POV與TVB-N值（R=0.81，P＜0.01）均呈高度正相關(guān)；PC與PE呈顯著性負(fù)相關(guān)（R=-1.00，P＜0.01）。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，脂質(zhì)降解產(chǎn)生PUFA，可能促使pH值發(fā)生變化[20]。PUFA易于氧化[9]，可能生成MUFA，從而使MUFA在總FFA中占據(jù)較大比例。在氧化過程中TBARS值也相應(yīng)地發(fā)生變化。TBARS值和POV的相關(guān)性表明，低溫風(fēng)干型醬鴨加工過程中脂質(zhì)發(fā)生了分解氧化，促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的形成[35]。雖然磷脂在加工過程中發(fā)生了降解，但它與FFA之間沒有顯著相關(guān)性。

3 結(jié) 論

本實驗采用低溫風(fēng)干工藝制備了風(fēng)干型醬鴨，并研究其加工過程中脂質(zhì)氧化的動態(tài)變化規(guī)律。低溫風(fēng)干工藝促進(jìn)了POV、TBARS值和TVB-N值的增加。醬鴨加工過程中肌內(nèi)磷脂的主要分子種類是PE（C16∶0/C20∶4）、PE（C16∶0/C18∶1）、PE（C16∶0/C22∶5）、PE（C16∶0/C22∶4）、PE（C16∶0/C22∶6）和PC（C16∶0/C22∶5），PE的含量明顯高于PC，表明PE在醬鴨脂質(zhì)氧化過程中起重要作用。醬鴨成品中主要的FFA是C16∶0、C16∶1、C18∶0和C18∶1。相關(guān)性表明，F(xiàn)FA的形成與磷脂（PE和PC）降解之間不存在顯著的相關(guān)性，但低溫風(fēng)干工藝促進(jìn)了不飽和脂肪酸的氧化。

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