超聲波與菠蘿蛋白酶協(xié)同作用對鴨肉嫩化的影響

趙 立，周 振，賀倩倩，湯 超，黃鳴璐，李苗云，陳 軍，白青云

（1.淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

嫩度是肉品最重要的品質(zhì)之一，是決定消費(fèi)者購買度的重要指標(biāo)。外源酶如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、獼猴桃蛋白酶和無花果蛋白酶，在肉品嫩化方面得到了廣泛的應(yīng)用，菠蘿蛋白酶在國外已有品牌，如McCormick和Knorr。菠蘿蛋白酶是從菠蘿的莖和果實(shí)中提取出的一種半胱氨酸蛋白水解酶，是一種內(nèi)切蛋白酶，由于其較強(qiáng)的蛋白水解能力，商業(yè)上廣泛用于食品、化妝品、醫(yī)藥、編織工業(yè)等[1]。

商品化的外源酶能夠有效水解肌肉纖維蛋白，如肌動蛋白、肌球蛋白、肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白等[2-3]。Sullivan等[4]認(rèn)為菠蘿蛋白酶除可以提高肉的嫩度，還可以改善肉的感觀接受度。Lizuka等[5]將牛肉用菠蘿汁腌制，應(yīng)用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜法持續(xù)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)肉類蛋白結(jié)構(gòu)性的變化。Ketnawa等[6]添加20%的菠蘿蛋白酶可以強(qiáng)烈水解牛肉、雞肉和魷魚的肌肉蛋白。菠蘿蛋白酶還是一種很好的鹽酸水解劑的替代品，有效水解牡蠣肉，生產(chǎn)的蠔油具有較高的感官評分[7]。

超聲波是指頻率在20～100 kHz之間的機(jī)械振動在固、液、氣介質(zhì)中傳播的彈性波。本實(shí)驗(yàn)利用超聲波清洗器進(jìn)行鴨肉的處理，而超聲波清洗器的原理是由超聲波發(fā)生器所發(fā)出的超聲沖擊波產(chǎn)生的空化效應(yīng)，產(chǎn)生機(jī)械破壞作用，從而達(dá)到破壞肉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)以促使肉類嫩化效果。Ahmad等[8]利用超聲功率20 kHz的超聲波處理10 min可顯著減少肌動蛋白和肌球蛋白之間的相互作用以增加雞肉的嫩度。Stadnik等[9]研究表明低頻低密度的超聲波可以顯著改變宰后24、48、72 h和96 h牛肉的pH值、剪切力和色差，不僅能改善肉的嫩度，還能顯著抑制高氧肌紅蛋白的形成。超聲波可以削弱肌纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)的相互作用，通過直接或間接的“空化作用”破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，降低肉的“背景硬度”——肌原纖維和膠原蛋白，從而改善肉的嫩度[10-11]。

有研究表明，在液體介質(zhì)中產(chǎn)生大量機(jī)械的、熱力學(xué)和化學(xué)效應(yīng)能夠斷裂多肽鏈之間的氫鏈和范德華力，進(jìn)而改變酶蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)以鈍化多種酶，如漆酶、過氧化物酶、多酚氧化酶、脫氫酶、果膠酶、脂氧化酶、過氧化氫酶、淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、溶解酵素[12]。但是短時(shí)間和低強(qiáng)度的超聲波處理可以提高一些酶的活性[13]。張永軍等[14]研究發(fā)現(xiàn)相同的處理功率條件下，超聲波對菠蘿蛋白酶的活性影響隨著時(shí)間的變化均呈現(xiàn)出拋物線式的變化，總體上呈下降趨勢。在處理功率為240 W，處理時(shí)間為10 min時(shí)，菠蘿蛋白酶活性增大到未處理菠蘿蛋白酶的119.05%，160 W和200 W對菠蘿蛋白酶的熱穩(wěn)定性的作用非常明顯，處理5～25 min菠蘿蛋白酶的熱穩(wěn)定性均比未處理的菠蘿蛋白酶強(qiáng)。

綜上所述，單一菠蘿蛋白酶和超聲波處理對肉的嫩化均有效果，同時(shí)，超聲波對菠蘿蛋白酶的性質(zhì)有一定的影響，然而目前為止，兩者協(xié)同作用對肉的嫩化作用方面的研究還很少，目前僅限于王晶等[15]所研究的菠蘿蛋白酶和超聲波對羊肉嫩度的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)利用超聲波協(xié)同菠蘿蛋白酶對鴨肉的嫩化工藝進(jìn)行研究，并對嫩化機(jī)理進(jìn)行探討，為肉品的嫩化提供更多更有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨胸肉由安徽強(qiáng)英集團(tuán)有限公司提供，將鴨胸肉在4 ℃解凍24 h，剔除可見脂肪和結(jié)締組織，切成3 cm×2.5 cm×2.5 cm的均勻塊形。

菠蘿蛋白酶（酶活300 000 U/g） 南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；牛血清蛋白、蛋白質(zhì)Marker日本Takara生物公司；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ETS-2大容量高速勻漿機(jī) 江蘇金壇市億通電子有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；722-N可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；pHS-3C型pH計(jì) 上海雷磁科學(xué)儀器股份有限公司；TAXT PLUS物性分析儀 英國Lload公司；Avanti J-26 XP高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼公司；DSA50–GL1超聲波清洗機(jī) 福州德森精工有限公司；CR-10色差計(jì) 日本柯尼卡公司。

1.3 方法

將一定量的菠蘿蛋白酶用不同的pH值緩沖液溶解制備含酶溶液，將含酶溶液噴灑在鴨肉表面（液料比1∶10（mL/g）），冰浴上人工滾揉5 min至含酶溶液完全被鴨肉吸收，置于蒸煮袋中真空包裝，再置于超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行嫩化實(shí)驗(yàn)。

1.3.1 超聲波與酶協(xié)同作用嫩化鴨肉的工藝優(yōu)化

1.3.1.1 單因素試驗(yàn)

固定超聲波功率80 W、酶添加量500 U/g、pH 7、嫩化時(shí)間15 min、溫度40 ℃條件，改變其中一個(gè)條件，設(shè)定溫度為20、30、40、50、60 ℃，時(shí)間為5、10、15、20、25 min，緩沖液pH值為5、6、7、8、9，酶添加量為300、400、500、600、700 U/g，超聲波功率為60、70、80、90、100 W，測定各樣品的剪切力值，考察各因素對嫩化鴨肉的影響。

1.3.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

通過SPSS 11.5軟件對上述5 個(gè)單因素試驗(yàn)進(jìn)行方差分析，選取影響剪切力顯著的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以溫度（A）、pH值（B）、酶添加量（C）和超聲波功率（D）為自變量，以剪切力值為響應(yīng)值進(jìn)行4因素3水平的試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平設(shè)置如表1所示，嫩化時(shí)間為15 min。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table1 Coded and real levels of independent variables used in Box-Behnken design

1.3.2 剪切力的測定

將嫩化后的肉樣于沸水浴中蒸煮30 min，取出，瀝干水分，冷卻，沿肌纖維方向切割成長×寬×高為20 mm×10 mm×10 mm的條型，取樣后立即置于TA.PLUS物性分析儀上進(jìn)行測定。采用復(fù)合剪切探頭（FG/SBS）測試，探頭移動速率30 mm/min，在樣品中下行距離為20 mm，取最大應(yīng)力值為剪切力。

1.3.3 超聲波與酶協(xié)同作用嫩化鴨肉的指標(biāo)測定

利用最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行鴨肉嫩化處理后，取肉樣進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測定（pH值、持水力、肌原纖維蛋白溶解度、色差、剪切力、肌原纖維小片化指數(shù)、不溶性膠原蛋白含量），同時(shí)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和透射電鏡分析。

1.3.3.1 pH值測定

稱取5 g肉糜，加入25 mL的蒸餾水，均質(zhì)30 s，然后采用pH電極計(jì)測量其pH值[16]。

1.3.3.2 持水力測定

10 g肉糜加15 mL 0.6 mol/L的NaCl溶液，置于離心管中，渦旋振蕩1 min，于4 ℃靜置15 min，再次振蕩1 min，置于高速冷凍離心機(jī)中4 ℃、5 000 r/min離心15 min。測量上清液體積，結(jié)果以上清液體積占最初體積百分比表示[16]。

1.3.3.3 色差測定

運(yùn)用色差儀測定L*、a*、b*、c*、h*值和色差值。L*值為亮度值，表示樣品從白到黑的水平；a*值表示樣品顏色從綠到紅的范圍，b*值表示樣品顏色從藍(lán)到黃的范圍；c*值表示彩度，即色彩飽和的程度；h*值表示色調(diào)角；色差值表示色空間的綜合值，即總色差。

1.3.3.4 肌原纖維小片化指數(shù)（myofibril fragmentation index，MFI）測定

肌原纖維懸液的制備采用Rawdkuen等[17]的方法：將4 g肉糜加入40 mL的分離介質(zhì)中（2 ℃），用高速組織搗碎機(jī)勻漿，于5 000 r/min離心15 min。將上清液慢慢倒出，沉淀中再倒入40 mL的分離介質(zhì)，用玻璃棒攪勻，于5 000 r/min離心15 min，緩慢倒出上清液。在沉淀中加入10 mL的分離介質(zhì)制成懸液，通過20 目的篩網(wǎng)過濾除去結(jié)締組織和碎片，再加10 mL的分離介質(zhì)沖洗篩網(wǎng)，制成肌原纖維懸液，蛋白質(zhì)濃度的測定采用雙縮脲法。MFI的測定：取肌原纖維懸液1 mL，用分離介質(zhì)稀釋至蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為（0.5±0.05）mg/mL。稀釋的肌原纖維懸液攪拌后倒入比色皿中，立即在540 nm波長處測定吸光度。MFI以其測得的吸光度乘以200計(jì)。

1.3.3.5 肌原纖維的溶解度測定

肌漿蛋白含量：稱取2 g肉糜，用20 mL冰冷的0.025 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.2）提取，均質(zhì)，4 ℃過夜，不斷振蕩，1 500 r/min離心20 min，上清液蛋白含量用雙縮脲法進(jìn)行測定?？偟鞍缀浚悍Q取2 g肉糜，用40 mL冰冷的磷酸緩沖液（pH 7.2，內(nèi)含1.1 mol/L KI溶液），均質(zhì)，4 ℃過夜，不斷振蕩，1 500 r/min離心20 min，上清液蛋白含量用雙縮脲法進(jìn)行測定。肌原纖維蛋白含量為兩者之差[16]。

1.3.3.6 不溶性膠原蛋白含量測定

膠原蛋白總量：稱取1 g肉樣于25 mL的6 mol/L鹽酸溶液或3 mol/L硫酸溶液中，于108 ℃水解18 h，趁熱過濾至25 mL容量瓶中，用鹽酸或硫酸溶液多次洗滌燒杯和濾紙并入容量瓶，用水定容，搖勻待測。不溶性膠原蛋白量：稱取1 g肉樣加入15 mL 1/4 Ringer’s試劑（1.8 g NaCl，0.25 g KCl，0.06 g CaCl2·6H2O，0.05 NaHCO3，0.186 g CH3COOH，溶于1 L蒸餾水），在離心管中均質(zhì)，77 ℃水浴60 min，冷卻至室溫，4 500 r/min離心15 min，棄去上清液，沉淀加20 mL的6 mol/L鹽酸溶液或3 mol/L硫酸溶液，在108 ℃條件下水解18 h，趁熱過濾至25 mL容量瓶中，用鹽酸或硫酸溶液多次洗滌燒杯和濾紙并入容量瓶，用水定容搖勻待測[16]。待測液參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》方法，計(jì)算公式如式（1）、（2）：

1.3.3.7 SDS-PAGE分析[17-18]

稱取4 g肉樣于10 mL樣品提取液中（85 ℃預(yù)熱），用高速勻漿機(jī)以中速勻漿15 s，于4 ℃高速冷凍離心機(jī)10 000 r/min離心5 min，取上清液備用。上清液和2×樣品緩沖液以1∶1混合，沸水浴5 min，冷卻至室溫上樣，上樣量為20 μg蛋白。初始電壓為80 V，進(jìn)入分離膠后電壓加大至100 V。染色、脫色至背景清晰。

1.3.3.8 透射電鏡分析[19]

將鴨肉樣品于2.5%戊二醛（25%戊二醛溶液與0.1 mol/L、pH 7.4 PBS按1∶9體積比混合）中4 ℃固定，送至南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院電鏡室進(jìn)行透射電鏡分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 ±s表示，采用SPSS 11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。單因素試驗(yàn)各組間數(shù)值的比較分析采用單因素方差分析（ANOVA），Duncan極差檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波與菠蘿蛋白酶協(xié)同作用對鴨肉的嫩化工藝結(jié)果2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 溫度對鴨肉嫩化效果的影響

圖1 溫度對鴨肉嫩化效果的影響Fig.1 Effect of temperatures on tenderization of duck muscle

由圖1可見，隨著嫩化處理溫度的升高，在達(dá)到40 ℃時(shí)剪切力達(dá)到最低（23.997 N），顯著低于其他各組（P＜0.05）。盡管菠蘿蛋白酶的最適作用溫度范圍為55～60 ℃[20]，由于超聲波在工作期間產(chǎn)生的熱效應(yīng)會使處理溫度上升，同時(shí)超聲15 min可以大大增加酶的活性[14]，因此，隨著處理溫度上升到60 ℃時(shí)，實(shí)際溫度已大于60 ℃，鴨肉蛋白質(zhì)在此溫度條件下可能已發(fā)生變性，菠蘿蛋白酶發(fā)生失活，剪切力顯著增加（P＜0.05）。因此，最佳溫度在40 ℃左右。

2.1.1.2 嫩化時(shí)間對鴨肉嫩化效果的影響

圖2 嫩化時(shí)間對鴨肉嫩化效果的影響Fig.2 Effect of treatment time on tenderization of duck muscle

由圖2可見，隨著鴨肉嫩化時(shí)間的延長，15 min時(shí)鴨肉的剪切力降到了24.451 N，顯著低于5 min和10 min（P＜0.05），隨著嫩化時(shí)間的延長，超聲波對酶活力的影響增加，酶的活力顯著下降[9]，酶對鴨肉中蛋白的水解達(dá)到了飽和。而王晶等[15]認(rèn)為超聲波和菠蘿蛋白酶處理30 min羊肉的剪切力達(dá)到最低，這可能是由于原料肉塊較大，酶添加量較低，以及羊肉本身較鴨肉肌纖維粗糙所致。因此，最佳作用時(shí)間為15 min。此嫩化時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于普通外源酶法所需要的1 h[3]，大大縮短了嫩化時(shí)間。

2.1.1.3 pH值對鴨肉嫩化效果的影響

圖3 pH值對鴨肉嫩化效果的影響Fig.3 Effect of pH value on tenderization of duck muscle

由圖3可見，pH值對鴨肉的嫩化效果影響顯著（P＜0.05）。菠蘿蛋白酶的最適作用pH值在5～8之間[20]，pH值為7時(shí)嫩化效果最好，這與吳茂玉等[21]報(bào)道的pH值在7.1附近菠蘿蛋白酶活力達(dá)到最高點(diǎn)一致。因此，最佳作用pH值為7.0。

2.1.1.4 酶添加量對鴨肉嫩化效果的影響

圖4 酶添加量對鴨肉嫩化效果的影響Fig.4 Effect of bromelain concentration on tenderization of duck muscle

由圖4可見，當(dāng)酶添加量為400 U/g時(shí)，鴨肉的剪切力明顯下降（P＜0.05），達(dá)到了25.211 N，盡管隨著酶添加量的增加，剪切力還有輕微下降，但不顯著（P＞0.05），當(dāng)酶添加量達(dá)到700 U/g時(shí)剪切力雖然顯著下降（P＜0.05），但出現(xiàn)了過度嫩化現(xiàn)象，顏色發(fā)黃，肉質(zhì)過軟，感觀品質(zhì)下降。因此，最佳酶添加量為400 U/g。

2.1.1.5 超聲波功率對鴨肉剪切力的影響

圖5 超聲波功率對鴨肉嫩化效果的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on tenderization of duck muscle

由圖5可見，低功率對肉的嫩度有顯著的改善作用，在由60 W增加到80 W時(shí)，鴨肉的剪切力顯著下降（P＜0.05），這也是由于超聲波對肌纖維蛋白產(chǎn)生機(jī)械物理破壞作用，同時(shí)其空化作用使線粒體、肌質(zhì)網(wǎng)和溶酶體膜破壞，加快蛋白酶溶液的擴(kuò)散和滲透，提高嫩化效果[22]。而隨著超聲波功率的增加，肉的嫩化效果并未有顯著的改善。因此，最佳超聲波功率為80 W。

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2.1 響應(yīng)面回歸方程及方差分析

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Box-Behnken design with predicted and measured values of shear force

根據(jù)實(shí)際測定值對表2中的數(shù)據(jù)采用逐步回歸擬合，得到剪切力對溫度（A）、pH值（B）、酶添加量（C）和超聲波功率（D）的模型回歸方程：剪切力/N=277.294 8-1.399 0A-13.535 5B-0.179 2C-3.465 3D+0.022 3A2+1.948 2B2+3.566 7×10-4C2+0.023 2D2-0.107 5AB-1.747×10-3AC+0.010 1AD-0.118 4BD。對所建的模型進(jìn)行方差分析見表3。

由表3可知，模型的F值為28.04，P值小于0.000 1，說明該預(yù)測模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.120 9），說明在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，模型能夠很好地表明各因素值和剪切力之間的關(guān)系。對于各嫩化因素，一次項(xiàng)A（溫度）、C（酶添加量）和D（超聲波功率）對模型影響極顯著（P＜0.01）；B（pH值）對模型影響不顯著（P=0.931 4）；因素間只有AC（溫度和酶添加量）的交互作用對模型的影響極顯著（P＜0.01）；各影響因素二次項(xiàng)均有極顯著的影響（P＜0.000 1）。從F值可以看出各單因素的影響主次順序?yàn)槊柑砑恿浚–）＞溫度（A）＞超聲波功率（D）＞pH值（B）；交互項(xiàng)影響大小為AC＞BD＞AB＞AD＞BC＞CD。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸方程與方差分析Table3 Analysis of variance for response surface regression equation

2.1.2.2 交互作用影響分析

圖6 溫度和酶添加量交互作用對鴨肉剪切力的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of temperature and bromelain concentration on shear force of duck muscle

利用Design-Expert 6.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二元多次回歸擬合，得到各因素之間相互作用的響應(yīng)面及等高線圖，從表3可見，溫度和酶添加量之間交互作用對鴨肉剪切力影響極顯著（P＜0.01），因此只對此交互作用進(jìn)行分析。由圖6可見，溫度和酶添加量等高線圖為橢圓形，交互作用最為顯著（P＜0.01），隨著溫度的升高，鴨肉剪切力先增加后下降，而隨著酶添加量的增加，鴨肉剪切力逐漸增加，隨后趨于不變。當(dāng)酶添加量349.27 U/g、溫度44.63 ℃時(shí)，鴨肉的剪切力達(dá)到極值，預(yù)測值為20.54 N。

2.1.3 最佳工藝參數(shù)確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過軟件分析優(yōu)化結(jié)果可見，響應(yīng)面模型預(yù)測的鴨肉剪切力結(jié)果存在最小值，為20.208 N，最佳的嫩化工藝參數(shù)為溫度44.63 ℃、pH 7.2、酶添加量349.27 U/g、超聲波功率83.90 W、嫩化時(shí)間15 min。按照實(shí)際可操作性，將實(shí)驗(yàn)條件修正為溫度45 ℃、pH 7.2、酶添加量350 U/g、超聲波功率80 W、嫩化時(shí)間15 min，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際鴨肉剪切力為21.110 N，與預(yù)測值接近，證明此預(yù)測模型合理可靠。

2.2 超聲波與菠蘿蛋白酶協(xié)同作用對鴨肉嫩化的作用機(jī)理

2.2.1 協(xié)同嫩化與對照組理化指標(biāo)的比較

表4 對照組與嫩化組鴨肉的嫩化指標(biāo)Table4 Physicochemical properties of control and tenderized duck muscle

由表4可見，除色差外，其余指標(biāo)在嫩化組和對照組間均出現(xiàn)了顯著的變化（P＜0.05）。剪切力由未處理時(shí)鴨肉的38.16 N下降到嫩化后的21.11 N。本實(shí)驗(yàn)中用較高pH值（7.2）的磷酸緩沖液溶解酶并處理鴨肉，增加肉的pH值（鴨肉本身pH 6.23），同時(shí)也是肌肉蛋白水解所致。而pH值的增加會使肌內(nèi)蛋白分子表面帶有更多的凈負(fù)電荷，從而使肌肉蛋白分子結(jié)合更多的水分子。肌絲（肌原纖維蛋白）間的靜電斥力會使肌原纖維膨脹，也會使肌絲發(fā)生部分溶解，這都會導(dǎo)致持水力的增加[8]，而在肉的食用品質(zhì)中，持水力是一個(gè)非常重要的指標(biāo)，它在很大程度上決定了肉的嫩度。MFI是指肌原纖維碎片程度，是肉類嫩化的標(biāo)志，經(jīng)嫩化處理的鴨肉MFI程度明顯增加，由對照組的78.55增加到嫩化后的101.11，后期透射電鏡也顯示姜汁處理組鴨肉在肌原纖維Z線附近發(fā)生了大量的斷裂現(xiàn)象。由表4可知，嫩化處理并未引起鴨肉色澤的變化。超聲波和菠蘿蛋白酶處理的鴨肉嫩度的增加是由于超聲波促使菠蘿蛋白酶在肉中的滲透，而菠蘿蛋白酶和肌肉內(nèi)源酶作用導(dǎo)致肌肉pH值和持水力的增加，致使蛋白質(zhì)的功能性發(fā)生了改變。Dikeman等[23]指出肉類嫩度與肌原纖維蛋白含量之間呈負(fù)相關(guān)。Shin等[24]研究發(fā)現(xiàn)添加外源蛋白酶可以顯著降低牛肉的肌原纖維蛋白含量。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)嫩化處理的鴨肉的肌原纖維蛋白溶解度明顯下降（P＜0.05），MFI增加，鴨肉得到了良好的嫩化。結(jié)締組織主要由膠原纖維構(gòu)成，膠原纖維主要成分是膠原蛋白，膠原蛋白含量和不溶性膠原蛋白含量與肉的嫩度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，不溶性膠原蛋白相對含量由未處理時(shí)的0.21%下降到嫩化處理后的0.12%，因此，超聲波和菠蘿蛋白酶協(xié)同處理可以同時(shí)水解肉的“背景硬度”——肌原纖維和膠原蛋白，對肉的嫩化起到更好的作用。

2.2.2 超聲波協(xié)同嫩化與單一菠蘿蛋白酶嫩化的比較

表5 超聲波協(xié)同嫩化與單一菠蘿蛋白酶嫩化的比較Table5 Comparison of duck meat tenderization with ultrasonicassisted bromelain and single bromelain

由表5可見，利用單一菠蘿蛋白酶對鴨肉進(jìn)行嫩化，通過最佳工藝參數(shù)獲得的最低剪切力為25.14 N，顯著高于超聲波與酶的協(xié)同作用的21.11 N（P＜0.05）。超聲波協(xié)同嫩化時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于單一菠蘿蛋白酶所需要的60 min

（P＜0.05）。在2 種嫩化方法的嫩化溫度沒有顯著性差別的基礎(chǔ)上，協(xié)同嫩化方法所需要的酶量顯著少于單一嫩化方法（P＜0.05）。推測是因?yàn)槌暡ㄌ岣吡瞬ぬ}蛋白酶的活性[12]。

2.2.3 SDS-PAGE結(jié)果

圖7 超聲波與菠蘿蛋白酶協(xié)同作用嫩化鴨肉的SDS-PAGE圖Fig.7 SDS-PAGE protein prof i les of duck muscle treated with ultrasound-assisted bromelain

由圖7可見，與對照組相比，超聲波與酶協(xié)同嫩化鴨肉組的大分子條帶幾乎完全消失，而分子質(zhì)量為14.3 ku附近的條帶明顯加深變粗，說明大分子蛋白被水解成小分子多肽或氨基酸，而此種降解主要由肌球蛋白和肌動蛋白構(gòu)成的肌原纖維蛋白發(fā)生了明顯的降解所致。蛋白質(zhì)水解表明肌原纖維結(jié)構(gòu)的降解以及剪切力的下降，從而肉的嫩度得以改善。Rawdkuen等[17]研究發(fā)現(xiàn)植物巰基蛋白酶能降解肌肉中的肌球蛋白和肌動蛋白，進(jìn)而在肉的嫩化和肉保水性的提高方面起著重要作用。Gerelt等[25]指出用木瓜蛋白酶處理肌原纖維使肌球蛋白重鏈降解成小分子肽類。Sawdy等[26]也證實(shí)了肌球蛋白重鏈碎片化程度和肉嫩度的高度相關(guān)性，水解形成的碎片越多，肉的嫩度越好。與作者前期對木瓜蛋白酶的嫩化研究[3]相比，菠蘿蛋白酶具有更強(qiáng)的蛋白水解能力，在超聲波輔助作用下，肌肉蛋白水解為分子質(zhì)量更小的分子。

2.2.4 透射電鏡結(jié)果

圖8 鴨肉肌原纖維透射電鏡微觀組織結(jié)構(gòu)圖（×4 000）Fig.8 Ultrastructure of myof i brils of duck muscle treated with ultrasound-assisted bromelain by TEM (×4 000)

由圖8可見，對照組樣品肌原纖維的肌節(jié)完整，Z線平滑，I帶和A帶清晰可見；嫩化組的鴨肉肌原纖維Z線斷裂彌散，肌節(jié)松弛變形縮短，I帶和A帶變得模糊，肌原纖維結(jié)構(gòu)被破壞，由圖8B可發(fā)現(xiàn)肌原纖維小片化現(xiàn)象。有研究用掃描電鏡觀察菠蘿蛋白酶處理的牛肉發(fā)現(xiàn)，肌原纖維和肌節(jié)都發(fā)生了收縮變短現(xiàn)象，牛肉嫩度得到了極大改善[27-28]。Ha等[29]研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶、生姜蛋白酶、中華獼猴桃蛋白酶和菠蘿蛋白酶4 種植物水解蛋白酶都能有效地水解牛肉中的肌原纖維和膠原蛋白，而作者前期研究姜汁嫩化鴨肉實(shí)驗(yàn)中也顯示其中的姜汁蛋白酶能夠降解鴨肉中的肌原纖維和膠原蛋白[30]，因此，與單純蛋白酶一樣，超聲波與菠蘿蛋白酶協(xié)同作用對鴨肉的嫩化也是通過肌原纖維和結(jié)締組織的降解，而且水解能力更強(qiáng)。

3 結(jié) 論

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化了超聲波輔助菠蘿蛋白酶嫩化鴨肉的最佳嫩化工藝參數(shù)為處理溫度44.63 ℃、pH 7.2、菠蘿蛋白酶添加量349.27 U/g、超聲波功率83.90 W、嫩化時(shí)間15 min。數(shù)據(jù)采用逐步回歸擬合，得到剪切力對溫度（A）、pH值（B）、菠蘿蛋白酶添加量（C）和超聲波功率（D）的模型，按實(shí)際可操作性，將條件修正為處理溫度45 ℃、pH 7.2、菠蘿蛋白酶添加量350 U/g、超聲波功率80 W、嫩化時(shí)間15 min，預(yù)測值為20.208 N，實(shí)測值為21.110 N。各因素的影響大小為酶添加量＞溫度＞超聲波功率＞pH值。

相對于未處理的鴨肉，嫩化組鴨肉的pH值、持水力和MFI顯著增加，剪切力、肌原纖維溶解度和不溶性膠原蛋白的相對含量顯著下降，而色差無明顯變化。SDSPAGE圖譜顯示嫩化組鴨肉中大分子蛋白被水解成小分子，透射電鏡顯示嫩化組鴨肉肌原纖維Z線斷裂溶解，肌節(jié)變形，出現(xiàn)了肌原纖維小片化現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)說明超聲波與菠蘿蛋白酶協(xié)同作用對鴨肉的嫩化具有顯著的效果，大大縮短了嫩化時(shí)間，使鴨肉更加多汁并富有彈性，鴨肉的品質(zhì)得到了極大的改善。

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