抗菌肽VIP在畢赤酵母中的高效表達(dá)及鑒定

喬想金，李文新，白麗娟，胡巍，南懷燕

1 蘭州蘭石能源裝備工程研究院 生物制造工程技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730300

2 中國(guó)科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境研究院，甘肅 蘭州 730000

抗菌肽是一類具有天然抗菌活性的小肽，最初是從昆蟲(chóng)血淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的[1]。自瑞典科學(xué)家Boman等從天蠶蛹中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)抗菌肽后，科學(xué)家相繼從細(xì)菌、真菌、高等植物、高等動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)并分離得到了具有類似天然抗菌活性的小肽類[2]。到目前為止發(fā)現(xiàn)的抗菌肽有1 000多種[2-3]。過(guò)去的幾十年中，人們發(fā)現(xiàn)大量使用傳統(tǒng)抗生素容易誘導(dǎo)耐藥性菌株的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致治療同種感染時(shí)抗生素的使用量越來(lái)越多[4-6]，陷入一種惡性循環(huán)模式。因此，開(kāi)發(fā)不具有誘導(dǎo)耐藥性菌株產(chǎn)生的新型抗生素極為迫切。

大多數(shù)抗菌肽都帶有正電荷，具有正電性和兩親性分子的特征[7-8]。其殺菌機(jī)制主要是通過(guò)直接破壞生物膜或與細(xì)胞內(nèi)大分子相互作用而抑殺細(xì)菌，從而不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌株[2,8]。抗菌肽具有廣譜的抗菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有一定的抗性，被認(rèn)為是最具有開(kāi)發(fā)新型抗生素藥物的肽類物質(zhì)[9-10]。目前，國(guó)外有一些抗菌肽藥物已經(jīng)應(yīng)用于臨床[11-13]?？咕腣IP是有機(jī)體內(nèi)廣泛分布的具有抗菌活性的小肽，對(duì)細(xì)菌和真菌都有很好的抗菌活性[14]。VIP的天然產(chǎn)量很低，化學(xué)合成成本相當(dāng)昂貴，這是其開(kāi)發(fā)利用過(guò)程中的關(guān)鍵瓶頸[15]。因此，通過(guò)基因工程方法高效生產(chǎn)VIP具有很好的前景。

抗菌肽 VIP對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的抑殺作用，因此不能在原核表達(dá)系統(tǒng)中直接表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室曾將人抗菌肽VIP與用硫氧還蛋白串聯(lián)，用pET32a在大腸桿菌中融合表達(dá)，但是由于需要切除融合標(biāo)簽和破碎菌體，成本還是相對(duì)較高，不太理想。畢赤酵母具有可以直接分泌表達(dá)蛋白和折疊修飾的優(yōu)勢(shì)，是目前分泌表達(dá)外源蛋白最理想的表達(dá)系統(tǒng)之一[16]。VIP對(duì)真核生物幾乎沒(méi)有毒性[14]，因此，我們嘗試采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)直接分泌表達(dá) VIP，從而省略切割標(biāo)簽和破碎菌體的繁瑣步驟，以期VIP高效表達(dá)，降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

畢赤酵母 GS115、表達(dá)質(zhì)粒 pPICZαA、NCM460和IPEC-J2由西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；大腸桿菌Escherichia coliDH5α、E. coliATCC25922、金黃色葡萄球菌S. aureusATCC25923均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑耗材

限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、XbaⅠ及T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；PCR試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購(gòu)自天庚生物科技有限公司；博來(lái)霉素、DNA Marker、蛋白Marker購(gòu)自BBI生命科學(xué)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 VIP目的基因的克隆

VIP氨基酸序列為：HSDAVFTDNYTRLRKQ MAVKKYLNSILN。根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，優(yōu)化獲得VIP核苷酸序列：CACAGCGACGCCGT ATTCACAGATAACTACACCAGACTAAGAAAA CAAATGGCCGTAAAAAAGTACCTAAACAGCA TCCTAAAC，在序列兩端添加X(jué)hoⅠ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和基因序列之間添加Kex2酶切位點(diǎn)，基因序列末端添加終止密碼子TAA，引物序列設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

其中，所述引物序列P1和引物序列P2中的方框分別表示XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，使用套疊PCR (Splice overlap extension PCR，SOE-PCR)擴(kuò)增vip基因，反應(yīng)條件如下：94 ℃變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。將 PCR產(chǎn)物和克隆載體質(zhì)粒PUC19同時(shí)用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐抗性 LB固體平板，挑取5個(gè)單克隆，用小量質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，送往生工生物工程 (上海) 股份有限公司測(cè)序。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

將SOE-PCR擴(kuò)增的目的基因與pPICZαA質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和XbaⅠ同時(shí)進(jìn)行雙酶切，用DNA膠回收試劑盒對(duì)基因和質(zhì)粒片段進(jìn)行回收，用T4 DNA連接酶于16 ℃連接過(guò)夜。將連接混合液轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃搖床孵育60 min，取100 μL轉(zhuǎn)化菌液涂布固體LB培養(yǎng)基(含 20 μg/mL 博來(lái)霉素)，37 ℃培養(yǎng) 18 h。挑取單克隆，雙酶切和基因測(cè)序鑒定正確后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定

制備畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，具體過(guò)程如下：從超低溫冰箱取出 GS115菌種，接種于YPD固體平板上，30 ℃培養(yǎng)30 h；挑取單克隆接種于10 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；取500 μL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液接種于50 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至OD600為0.8–1.2時(shí)離心，收集菌體；用冰水浴預(yù)冷的超純水洗滌3次；用山梨醇緩沖液洗滌一次，用1 mL山梨醇緩沖液重懸，每100 μL分裝到1.5 mL離心管中，以備電轉(zhuǎn)。

取 50 μL重組質(zhì)粒 pPICZαA-vip，用限制性內(nèi)切酶SacⅠ進(jìn)行線性化，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定并回收，膠回收的最后一步用超純水進(jìn)行洗脫，以保證較低的離子強(qiáng)度以便電轉(zhuǎn)。取 10 μL線性化回收的質(zhì)粒片段，加入到GS115感受態(tài)細(xì)胞中，迅速吹打均勻后置冰上10 min；將感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)?；旌弦貉杆俎D(zhuǎn)入2 mm預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，2 500 V電擊；電擊完成后迅速加入800 μL YPD培養(yǎng)基，冰上靜置10 min，放入30 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)3 h；取300 μL菌液涂布于博來(lái)霉素抗性的YPD固體平板上，培養(yǎng)2 d；挑取單克隆接種于含有200 μg/mL博來(lái)霉素的YPD液體培養(yǎng)基上；用酵母基因組提取試劑盒提取重組酵母基因組 DNA，以 5’AOX1 和 3’AOX1 為引物，用 PCR檢測(cè)目的基因在GS115中的整合情況，將驗(yàn)證正確的重組菌命名為GS115-PIC-vip。

1.2.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及質(zhì)譜鑒定

將基因工程菌 GS115-PIC-vip接種于 50 mL YPD培養(yǎng)基，30 ℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。取上述過(guò)夜培養(yǎng)菌液，按照1∶100的比例接種于1 L新鮮YPD培養(yǎng)基中，待OD600值達(dá)到0.8–1.2時(shí)，6 000 r/min離心，將菌體重懸于50 mL新鮮YPM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，每24 h補(bǔ)加甲醇5 mL，連續(xù)誘導(dǎo)120 h。

重組VIP的純化：用5倍柱體積的去離子水沖洗陽(yáng)離子交換柱(層析柱介質(zhì)為 CM Sepharose Fast flow，柱尺寸 1.6 cm×20 cm)，流速 2 mL/min；用4倍柱體積0.1 mol/L NaOH處理陽(yáng)離子交換柱，流速2 mL/min；用去離子水沖洗至中性；用4倍柱體積0.1 mol/L HCl處理陽(yáng)離子交換柱，流速2 mL/min；去離子水沖洗至中性；用4倍柱體積的A液(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.5)進(jìn)行平衡，流速2 mL/min；將發(fā)酵上清液稀釋5倍，用0.45 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，超聲脫氣10 min后上樣，流速1 mL/min；用磷酸緩沖液洗脫雜蛋白，直至280 nm處沒(méi)有紫外吸收峰；用A液和B液(1 mol/L NaCl)進(jìn)行線性梯度洗脫，收集280 nm處的紫外吸收峰。將純化的VIP用透析袋進(jìn)行脫鹽處理，通過(guò)冷凍干燥儀進(jìn)行濃縮，用 Bradford法測(cè)定濃縮液重組VIP的濃度，取樣進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，其余的濃縮液在–20 ℃保存，以便后續(xù)重組VIP溶液的稀釋配制。

質(zhì)譜測(cè)定的是核質(zhì)比m/z，因此測(cè)定的物質(zhì)分子量計(jì)算公式如下：

1.2.5 重組VIP的抑菌活性檢測(cè)

用瓊脂孔擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)對(duì)重組表達(dá)的人抗菌肽VIP從定性方面檢測(cè)抗菌活性。將E. coliATCC25922和S. aureusATCC5923培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600為 0.4–0.6)，用平板稀釋法稀釋至108CFUs/mL，將其按照1%的比例接到LB固體培養(yǎng)基中，混勻后倒平板。等平板凝固后用打孔器進(jìn)行打孔，每孔加入70 μL液體，37 ℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜，觀察抑菌圈情況。

1.2.6 重組VIP的最小抑菌濃度(MIC)檢測(cè)

從–80 ℃取出凍存的E. coliATCC25922和S. aureusATCC25923，劃線接種于肉湯培養(yǎng)基(MH)中培養(yǎng)過(guò)夜；挑單克隆接種于MH液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜；將過(guò)夜培養(yǎng)的菌按照1∶100的比例轉(zhuǎn)接到MH培養(yǎng)基，待OD600達(dá)到0.4–0.6時(shí)，取適量菌液，通過(guò)平板稀釋法，用MH培養(yǎng)基稀釋至 1×105–5×105CFUs/mL；取 96孔板，每孔加入100 μL菌液，再加入100 μL用MH培養(yǎng)基稀釋好的重組VIP溶液，使VIP終濃度為2–64 μmol/L(陰性對(duì)照孔加入200 μL MH培養(yǎng)基；陽(yáng)性對(duì)照加入 100 μL 菌液+100 μL MH 培養(yǎng)基)；37 ℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜后用酶標(biāo)儀測(cè)OD600值，分析純化后的VIP對(duì)E. coliATCC25922和S. aureusATCC25923的MIC。

1.2.7 重組VIP搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

將過(guò)夜培養(yǎng)的工程菌 GS115-PIC-vip按照1∶100的比例轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)OD600至0.4–0.6時(shí)，設(shè)置誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)度、誘導(dǎo)溫度、甲醇誘導(dǎo)濃度梯度，通過(guò)檢測(cè)VIP分泌的量確定實(shí)驗(yàn)室搖瓶最佳發(fā)酵條件。

1.2.8 VIP細(xì)胞毒性檢測(cè)

將人腸上皮細(xì)胞 (NCM460) 和豬腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)進(jìn)行活化，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；細(xì)胞濃度稀釋至 1×105個(gè)/mL，將稀釋好的細(xì)胞液轉(zhuǎn)接至96孔板，每孔加入 90 μL，5% CO2、37 ℃靜置培養(yǎng)4 h；待細(xì)胞貼壁后，加入10 μL稀釋好的VIP溶液(用0.22 μm的濾器過(guò)濾除菌)，使VIP終濃度為 16 μmol/L；空白對(duì)照：90 μL DMEM+10 μL PBS，正常對(duì)照：90 μL 細(xì)胞懸液+10 μL PBS。培養(yǎng) 24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸取上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩15 min使結(jié)晶紫充分溶解；490 nm下測(cè)吸光值。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

1.2.9 VIP溶血活性檢測(cè)

取5 mL SD大鼠靜脈腹腔血，在含有玻璃珠的三角瓶中輕搖 10 min；將三角瓶中的血液用0.9% NaCl稀釋10倍，1 000 r/min離心收集血細(xì)胞；收集的血細(xì)胞用0.9% NaCl重懸，1 000 r/min離心，棄上清；重復(fù)上述步驟，直到上清不顯紅色；將所得的紅細(xì)胞用0.9% NaCl配制成2%的紅細(xì)胞懸液；取10個(gè)10 mL無(wú)菌離心管，每管加入2.5 mL紅細(xì)胞懸液。加入0.9% NaCl和純化的VIP溶液。使重組VIP終濃度為5、10、20、40、80 μmol/L；陰性對(duì)照：2.5 mL紅細(xì)胞懸液和2.5 mL 0.9% NaCl；陽(yáng)性對(duì)照：2.5 mL紅細(xì)胞懸液和2.5 mL ddH2O；37 ℃靜置4 h，1 000 r/min離心5 min，吸取上清在545 nm下測(cè)吸光值。紅細(xì)胞溶血率計(jì)算公式：

紅細(xì)胞溶血率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)–OD陰性)/(OD陽(yáng)性–OD陽(yáng)性)×100%。

1.2.10 VIP抗菌機(jī)制檢測(cè)

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的E. coliATCC25922和S. aureusATCC25923稀釋1 000倍，加入終濃度為MIC濃度的重組VIP。37 ℃孵育2 h，3 000 r/min離心，用5%的戊二醛溶液重懸，放入4 ℃冰箱固定過(guò)夜。做包埋后切片，在 JEM-1230型透射電鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的獲取

通過(guò)SOE-PCR法，以3條引物合成vip基因序列。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，PCR產(chǎn)物片段大小與理論值 (122 bp)相一致，挑取的陽(yáng)性克隆測(cè)序正確。

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

通過(guò)雙酶切對(duì)重組質(zhì)粒PIC-vip進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖 2所示。結(jié)果表明，雙酶切得到的 DNA片段大小與理論值一致。進(jìn)一步測(cè)序表明，目的基因已成功構(gòu)建到質(zhì)粒pPICZaA上。

圖1 目的基因vip的擴(kuò)增Fig. 1 Amplification of the target gene vip. M: DNA marker; 1: target gene.

圖2 雙酶切鑒定重組質(zhì)粒PIC-vipFig. 2 Recombinant plasmids PIC-vip were identified by double enzyme digestion. M: DNA marker; 1: target gene.

2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定

將重組質(zhì)粒PIC-VIP通過(guò)電轉(zhuǎn)化將其整合到畢赤酵母GS115中。提取畢赤酵母基因組DNA，以5’AOX1和3’AOX1為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒整合情況，結(jié)果如圖3所示。PCR擴(kuò)增條帶大小與理論值 (613 bp)一致，這表明重組質(zhì)粒PIC-vip已成功整合到畢赤酵母GS115中。

圖3 全基因組擴(kuò)增鑒定質(zhì)粒整合Fig. 3 Plasmid integration was identified by wholegenome PCR amplification. M: DNA marker; 1: target gene.

2.4 VIP的誘導(dǎo)表達(dá)及質(zhì)譜鑒定

轉(zhuǎn)接重組菌GS115-PIC-vip，進(jìn)行誘導(dǎo)。用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)分泌的VIP進(jìn)行純化，通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖4所示。質(zhì)譜中M+6H、M+5H、M+4H等均為同一個(gè)物質(zhì)，只是所帶電荷數(shù)不同。質(zhì)譜測(cè)定的是核質(zhì)比m/z，因此所檢測(cè)物質(zhì)的分子量為：555.46×6–6=3 326.76 或 666.36×5–5=3 326.80 或 832.71×4–4=3 326.84 或 1 109.93×3–3=3 326.79，根據(jù)計(jì)算結(jié)果，在誤差允許的范圍內(nèi)，分泌表達(dá)的人抗菌肽VIP分子量與理論值 (3 326.82)一致，這表明重組菌 GS115-PIC-vip能夠成功分泌表達(dá)VIP。

2.5 重組VIP抗菌活性檢測(cè)

通過(guò)抑菌圈法可以從定性角度觀察重組VIP是否具有抗菌活性。結(jié)果如圖 5所示，對(duì)照組 YPM培養(yǎng)基、空質(zhì)粒誘導(dǎo)培養(yǎng)上清液和纖維素酶緩沖液均沒(méi)有抗菌活性，重組菌GS115-PIC-vip誘導(dǎo)后上清液有明顯的抑菌圈出現(xiàn)，純化后的VIP具有更強(qiáng)的抗菌活性。實(shí)驗(yàn)表明，分泌的VIP從定性角度具有良好的抗菌活性。下一步將通過(guò)最小抑菌濃度MIC從定量角度驗(yàn)證分泌的VIP抗菌活性。

2.6 重組VIP的最小抑菌濃度檢測(cè)

通過(guò)測(cè)定重組VIP最小抑菌濃度MIC，從定量角度分析VIP的抗菌能力。檢測(cè)結(jié)果顯示，純化后的VIP對(duì)E. coliATCC25922和S. aureusATCC25923的MIC分別為8 μmol/L和16 μmol/L，從定量角度說(shuō)明重組 VIP對(duì)E. coliATCC25922和S. aureusATCC25923具有很好的抗菌活性。

圖4 重組VIP質(zhì)譜鑒定結(jié)果Fig. 4 Identification of VIP by mass spectrometry.

2.7 重組VIP搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

通過(guò)測(cè)定誘導(dǎo)后VIP的含量確定搖瓶最佳發(fā)酵條件，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，在24–96 h范圍內(nèi)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，VIP表達(dá)量呈上升趨勢(shì)；96 h后，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，VIP表達(dá)量呈緩慢下降趨勢(shì)；在 24–28 ℃范圍內(nèi)，VIP表達(dá)量隨著溫度的升高呈上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度超過(guò)28 ℃時(shí)，隨著溫度的上升，VIP表達(dá)量呈下降趨勢(shì)；甲醇誘導(dǎo)濃度在 0.1%–0.7%范圍時(shí)，隨著甲醇濃度的升高，VIP表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)甲醇濃度超過(guò)0.7%時(shí)，隨著甲醇誘導(dǎo)濃度的上升，VIP表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。結(jié)果表明重組菌GS115-PIC-vip在 28 ℃、0.7%甲醇濃度條件下誘導(dǎo) 96 h時(shí)VIP表達(dá)量最高，為13.37 mg/mL。

圖5 重組VIP對(duì)E. coli和S. aureus的抑菌活性Fig. 5 Antibacterial activity of recombinant VIP against E. coli and S. aureus. ①: YPM medium; ②: induced supernatant of empty plasmid; ③: cellulase buffer; ④:induced supernatant of recombinant GS115-PIC-vip; ⑤,⑥: purified VIP.

2.8 重組VIP細(xì)胞毒性檢測(cè)

通過(guò)檢測(cè) VIP對(duì)人腸上皮細(xì)胞 (NCM460)和豬腸上皮細(xì)胞 (IPEC-J2) 存活率的影響測(cè)定VIP對(duì)正常機(jī)體細(xì)胞的毒性 (圖 7)。結(jié)果表明重組VIP對(duì)正常NCM460和IPEC-J2細(xì)胞存活率沒(méi)有影響。

2.9 重組VIP溶血活性檢測(cè)

取SD大鼠靜脈腹腔血，檢測(cè)重組VIP對(duì)其的溶血活性。結(jié)果如圖8所示，5–40 μmol/L VIP處理后的 SD大鼠紅細(xì)胞都沒(méi)有發(fā)生溶血作用，表明VIP不具有溶血性。

2.10 重組VIP抗菌機(jī)制研究

用MIC濃度 VIP處理后的E. coliATCC25922和S. aureusATCC25923形態(tài)如圖9所示。結(jié)果顯示，對(duì)照組E. coliATCC25922形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，呈桿狀，細(xì)胞質(zhì)分布均勻；而與對(duì)照組相對(duì)應(yīng)的用MIC濃度VIP處理之后的實(shí)驗(yàn)組E. coliATCC25922細(xì)胞膜和細(xì)胞壁遭到嚴(yán)重破壞，細(xì)胞質(zhì)固縮、內(nèi)容物外泄甚至空泡化。正常對(duì)照組S. aureusATCC25923呈球形，表面光滑，細(xì)胞質(zhì)分布均勻；而用 MIC濃度VIP處理之后的S. aureusATCC25923幾乎看不到完整的細(xì)胞，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜嚴(yán)重變形甚至破裂，內(nèi)容物外泄，細(xì)胞質(zhì)固縮。說(shuō)明在MIC濃度的VIP處理下，E. coliATCC25922和S. aureusATCC25923細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞極其顯著。

圖6 發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化Fig. 6 Optimization of fermentation parameters.

圖7 VIP對(duì)NCM460和IPEC-J2存活率的影響Fig. 7 Effect of VIP on the survial rate of NCM460 and IPEC-J2.

圖8 VIP對(duì)SD大鼠紅細(xì)胞溶血活性分析Fig. 8 Analysis of erythrocyte hemolytic activity of VIP on SD rats.

圖9 VIP對(duì)E. coli ATCC25922和S. aureus ATCC25923的抗菌機(jī)制 (1×MIC，2 h，30 000×)Fig. 9 Antimicrobial mechanism of VIP on E. coli ATCC25922 and S. aureus ATCC25923 (1×MIC, 2 h, 30 000×).

3 討論

抗菌肽起初是從昆蟲(chóng)血淋巴細(xì)胞中分離得到的一類具有抗菌活性的多肽，具有分子量小、熱穩(wěn)定性好、不具有免疫原性、抗菌譜廣等特點(diǎn)[17-18]。Bals等[13]研究發(fā)現(xiàn)大多抗菌肽對(duì)細(xì)菌和真菌都有很好的殺傷活性，而對(duì)正常動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有殺傷作用[19-20]。本研究結(jié)果也再次證明了人抗菌肽VIP對(duì)正常細(xì)胞NCM460和IPEC-J2不具有細(xì)胞毒性?？咕牡娜苎詣t直接反映了其在生物體內(nèi)的安全性，對(duì)于抗菌肽是否能運(yùn)用于臨床起到?jīng)Q定性的作用[7]。本研究結(jié)果顯示5–40 μmol/L的VIP對(duì)SD大鼠靜脈腹腔血紅細(xì)胞均未發(fā)生溶血現(xiàn)象，表明VIP對(duì)SD大鼠紅細(xì)胞沒(méi)有溶血活性。本研究電鏡觀察到人抗菌肽VIP主要通過(guò)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜進(jìn)行破壞而抑殺細(xì)菌。徐博成等也發(fā)現(xiàn)，抗菌肽殺菌機(jī)制主要是通過(guò)直接破壞生物膜或與細(xì)胞內(nèi)大分子相互作用而抑殺細(xì)菌，從而不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌株[8]?？咕氖切滦涂股亻_(kāi)發(fā)的首選[2-3]，由于抗菌肽天然產(chǎn)量非常低，化學(xué)合成成本昂貴，無(wú)法滿足臨床需求[21]。因此，利用基因工程方法獲得高產(chǎn)、高效、低成本的抗菌肽極為迫切。畢赤酵母被美國(guó)FDA認(rèn)定為GRAS(Generally recognized as safe) 微生物，從而為畢赤酵母在食品和醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)[22]。畢赤酵母具有翻譯后修飾、分泌表達(dá)外源蛋白、表達(dá)量高等諸多優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于外源蛋白的表達(dá)[23]。

本研究根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性優(yōu)化人抗菌肽VIP基因序列，并通過(guò)畢赤酵母菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)人抗菌肽VIP進(jìn)行表達(dá)與分離純化，成功構(gòu)建了表達(dá)載體 pPICZαA-vip。通過(guò)電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒pPICZaA-vip整合到畢赤酵母GS115基因組上。經(jīng)0.5%的甲醇誘導(dǎo)后，人抗菌肽VIP得以表達(dá)。28 ℃、0.7%甲醇誘導(dǎo)96 h產(chǎn)量達(dá)到最大值13.37 mg/mL。通過(guò)發(fā)酵液的純化，純化產(chǎn)物的鑒定，質(zhì)譜鑒定結(jié)果均顯示分泌表達(dá)的產(chǎn)物與人抗菌肽VIP大小完全一致，表明人抗菌肽VIP成功分泌表達(dá)。分泌表達(dá)人抗菌肽VIP的抗菌活性實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)大腸桿菌E. coliATCC25922和金黃色葡萄球菌S. aureusATCC25923均有明顯的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)只選擇了具有代表性的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行抗菌活性實(shí)驗(yàn)，對(duì)于人抗菌肽VIP的抗菌譜還要進(jìn)行更深入的研究。

本研究采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功分泌表達(dá)了具有生物活性的人抗菌肽 VIP，并對(duì)搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，為VIP進(jìn)行大量生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)成為新型肽類抗生素藥物奠定了基礎(chǔ)。

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