CA19-9時間分辨熒光免疫層析檢測方法的建立

王云龍，米亞雙，李玉林，王繼創(chuàng)，程蕾，閆生輝，鄧黎黎

1 河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453002

2 河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450121

3 鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450121

4 生物標志物定量檢測河南省工程實驗室，河南 鄭州 450121

糖鏈抗原 19-9 (Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9) 是 Koprowski等發(fā)現(xiàn)的一種由消化系統(tǒng)腫瘤組織所產(chǎn)生的特異性糖蛋白，也是唾液酸 Lewisa血型抗原的標志[1-2]。CA19-9屬于消化系統(tǒng)相關(guān)抗原，主要表達于胰腺上皮細胞，抗原的分子量約為10 kDa，正常人體血清中的含量小于37 U/mL[3-6]。研究表明，CA19-9在消化系統(tǒng)惡性腫瘤患者體內(nèi)有異常表達，其中在胰腺癌、膽道癌、胃癌、結(jié)腸癌、食管癌、肝癌中存在較高的陽性率，而胰腺癌患者中CA19-9的陽性率最高，達到86%，并且在胰腺癌初期，血清中CA19-9的含量達到406 U/mL，CA19-9可作為胰腺癌重要的早期診斷指標之一[7-12]。

目前，國內(nèi)針對CA19-9的檢測方法有放射免疫測定法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法等，這些方法需要在實驗室借助設(shè)備進行，均不適宜用于床旁快速診斷。熒光快速層析檢測技術(shù)具有安全、費用低、操作簡便、可實現(xiàn)床旁快速檢測等優(yōu)點[13-15]?；诖耍狙芯拷⒘艘环N熒光定量免疫層析快速檢測CA19-9的技術(shù)和方法，以滿足臨床床旁快速檢測和基層社區(qū)醫(yī)院的需要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

PVC板、吸水紙、硝酸纖維素膜 (CN-140)、玻璃纖維棉由鄭州寶賽生物科技公司提供。臨床定值血清標本由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 試劑

羧基修飾時間分辨熒光微球、CA19-9配對單克隆抗體、羊抗鼠IgG、CA19-9線性參考品 (1 000、900、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25 U/mL)、CA19-9精密性質(zhì)控品 (400、100、30 U/mL)、特異性質(zhì)控品 (CEA、AFP、CA125、CA153，4份質(zhì)控品中 CA19-9的含量均為 200 U/mL，CEA質(zhì)控品中CEA含量為400 ng/mL，AFP質(zhì)控品中AFP含量為 400 U/mL，CA125質(zhì)控品中 CA125含量為400 U/mL，CA153質(zhì)控品中CA153含量為400 U/mL)均由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.3 儀器

熒光免疫層析讀數(shù)儀購自杭州峰航科技有限公司；紫外分析儀 (JY03型) 購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；臺式高速離心機 (H1850) 購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；三維噴金點膜儀、微電腦自動斬條機購自上海金標生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫微球的制備

取 20 μL熒光微球于 1.5 mL離心管中，加入1 000 μL 硼酸緩沖液 (0.05 mol/L，pH 8.0，下同)混勻，13 000 r/min離心15 min，棄上清；加入1 000 μL硼酸緩沖液進行重懸，加入15 μL EDC (10 mg/mL)，混勻后室溫振蕩活化18 min，13 000 r/min離心13 min，棄去上清；加1 000 μL硼酸緩沖液進行重懸，加入CA19-9標記抗體100 μg，振蕩混勻，超聲振蕩5 min，低速振蕩標記2 h；14 000 r/min離心20 min，棄上清，400 μL 復(fù)溶液重懸，加入 20 μL BSA (20%)，振蕩混勻，低速振蕩封閉1 h，4 ℃密封保存。

1.2.2 CA19-9熒光免疫層析定量檢測試紙條的制備

調(diào)節(jié)三維平面點膜噴金儀，將 2 mg/mL 的CA19-9包被抗體和 1 mg/mL羊抗鼠包被于 NC膜上分別作檢測線 (T線) 和質(zhì)控線 (C線)，包被量為 1 μL/cm；將制備好的免疫微球噴涂到微球結(jié)合墊上，噴涂量為6 μL/cm。包被抗體的NC膜和微球結(jié)合墊37 ℃干燥1.5 h。將吸水紙、NC膜、結(jié)合墊、樣品墊分別按照相應(yīng)的位置組合于PVC底板上，用微電腦自動斬條機切成 3.8 mm寬的試紙條，組裝卡殼，4 ℃密封保存。

1.2.3 檢測

取 70 μL血清樣本加入到試紙條的點樣窗口，用熒光免疫層析讀數(shù)儀檢測質(zhì)控線與檢測線的熒光強度。

1.2.4 最佳標記蛋白量與包被蛋白量的確定

采用二因素多水平實驗確定最佳 CA19-9標記抗體與CA19-9包被抗體的量，設(shè)計20 μL熒光微球的標記抗體梯度為 40、60、80、100 μg，CA19-9包被抗體濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL。按照1.2.1與1.2.2的方法進行試紙條的制備，用線性參考品檢測試紙條的線性范圍與R2。

1.2.5 檢測時間的確定

用線性參考品 (200、100、50 U/mL) 按照 70 μL的加樣量進行點樣，分別在點樣后5、8、10、12、15、18、20、22 min檢測試紙條的C、T線熒光強度，記錄T線的熒光值，計算T/C。

1.2.6 方法學(xué)評價

線性范圍：使用CA19-9線性參考品，以T/C的值為縱坐標，CA19-9濃度為橫坐標，制作標準曲線，建立線性方程。

最低檢出限：用空白對照進行重復(fù)檢測20次，求出T/C的平均值，+2s代入零濃度和相鄰線性參考品擬合的一次方程得出最低檢出限。

交叉反應(yīng)：取 CEA、AFP、CA125、CA153共4份特異性質(zhì)控品評價試紙條的特異性。

精密性： 用精密性質(zhì)控品 (400、100、30 U/mL)對同一批次和3個不同批次試紙條重復(fù)檢測各10次，分別計算批內(nèi)與批間試紙條的精密性(CV)，計算公式如下：

回收實驗：用基質(zhì)血清將800 U/mL CA19-9血清進行稀釋，獲得3份血清，預(yù)測濃度分別為200、100、50 U/mL。用制備好的試紙條進行檢測，計算試紙條的回收率。

回收率=測定值/預(yù)測值×100%。

穩(wěn)定性：將制備的試紙條，分別存放于4 ℃和37 ℃，在第6、12、18、21、24天分別用精密性質(zhì)控品 (100 U/mL) 檢測試紙條的T線熒光強度和T/C的值。

臨床評價：用所建立的 CA19-9熒光定量檢測試紙條與羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢測) 平行檢測 50份臨床血清，對兩種檢測方法進行比較，得到相關(guān)性曲線。

2 結(jié)果

2.1 最佳標記抗體量與包被抗體濃度的確定

如表 1所示，20 μL熒光微球的標記抗體量為 80 μg，包被抗體濃度為 1.5 mg/mL時，試紙條的線性范圍最寬，R2最大，分別為12.5–800.0 U/mL，R2=0.996 8。

2.2 最適檢測時間的確定

實驗結(jié)果見圖 1。由圖可知熒光強度隨時間的變化而增大，12 min后T/C值趨于平穩(wěn)，選擇15 min作為最適檢測時間。15 min后紫外分析儀檢測結(jié)果如圖2所示。

2.3 方法學(xué)評價

線性范圍：測得 CA19-9線性范圍為 12.5–800 U/mL。

最低檢出限：CA19-9熒光層析試紙條的最低檢出限為6.32 U/mL。

特異性：結(jié)果如表2所示，4份特異性質(zhì)控品檢測結(jié)果差異不顯著，本試紙條的特異性較好。

表1 最佳標記蛋白量與包被蛋白量結(jié)果Table 1 The best amount of labeling and coating

圖1 最適檢測時間結(jié)果Fig. 1 The results of best detection time.

圖2 15 min紫外檢測結(jié)果Fig. 2 The results of UV detection in 15 min. 1: 50 U/mL;2: 100 U/mL; 3: 200 U/mL.

表2 特異性質(zhì)控品檢測結(jié)果Table 2 The results of specific control test

精密性：3份精密性質(zhì)控品 (400、100、30 U/mL)檢測試紙條批內(nèi)精密性分別為 4.32%±0.16%、5.70%±0.21%、6.02%±0.19%，批間精密性分別為4.26%±0.18%、6.46%±0.23%、7.21%±0.19%。均符合小于15%的要求。

回收實驗：試紙條檢測3份血清的回收率分別為101%、103%和99%，平均回收率為101%，符合要求。

穩(wěn)定性：檢測結(jié)果如圖 3、圖 4所示，試紙條在37 ℃存放24 d后T值明顯下降，但是T/C值無明顯變化，說明試紙條的穩(wěn)定性良好。

圖3 試紙條穩(wěn)定性T值Fig. 3 T value of test strip stability.

圖4 試紙條穩(wěn)定性T/C值Fig. 4 T/C value of test strip stability.

臨床評價：分別用兩種方法對50份樣本進行檢測，結(jié)果如圖5所示，兩種檢測方法的相關(guān)系數(shù)為0.980 6，兩者相關(guān)性良好。

圖5 臨床樣本檢測結(jié)果Fig. 5 The results of clinical sample test.

3 討論

時間分辨熒光免疫層析具有無放射性污染、無背景熒光干擾等優(yōu)點，其原理為血清中的CA19-9在層析作用下，與微球墊上的CA19-9單抗結(jié)合形成其微球-抗體-抗原復(fù)合物，在硝酸纖維素膜的毛細管作用下與包被在膜上的 CA19-9單抗結(jié)合，15 min后可檢測熒光信號，實現(xiàn)定量檢測。該方法作為POCT發(fā)展的新方向之一，成為目前的研究熱點，在臨床檢測中具有廣闊的發(fā)展前景。

雖然有學(xué)者進行 CA19-9時間分辨熒光免疫層析產(chǎn)品的相關(guān)研究，但目前他們的研究水平線性范圍窄，試紙條的準確度差等。王青[16]、黃飚等[17]分別利用Eu3+作為標記物、96孔板作為固相載體進行 CA19-9時間分辨熒光免疫分析方法的建立，該方法需進行洗滌等一系列繁瑣的操作步驟，檢測設(shè)備昂貴，不適應(yīng)床旁快速檢測。蔣能輝等[18]申請了腫瘤標志物的定量檢測試劑條專利，采用CA19-9單克隆抗體與抗IgG抗體分別標記熒光微球，包被CA19-9單抗與抗IgG制備檢測試紙條，其試紙條線性范圍為0–200 U/mL，不能完全滿足臨床需要。

為解決試紙條的線性范圍窄、樣品需額外稀釋等問題，我們采用新的思路與方法，在制備工藝微球的偶聯(lián)等方面進行諸多創(chuàng)新，采用CA19-9單克隆抗體的單獨標記，同時在抗體配對的選擇上采用獨特的方法。本研究設(shè)計二因素多水平實驗對最佳包被抗體量與最佳標記抗體量進行研究。發(fā)現(xiàn)包被抗體量的增加，可使線性范圍增寬，但是包被抗體量過多會引起假陽性率增高。羧基熒光微球經(jīng)過活化后羧基與標記抗體的氨基縮合形成酰胺鍵，羧基熒光微球表面的羧基量是一定的，因此熒光微球與 CA19-9標記抗體的比例對于試紙條的性能至關(guān)重要。標記抗體量過少，熒光強度弱，試紙條靈敏性低；抗體量過多，則造成熒光微球聚集。結(jié)合試驗結(jié)果最優(yōu)與經(jīng)濟的原則，最終確定20 μL微球的最佳CA19-9標記抗體量為80 μg，包被抗體濃度為1.5 mg/mL。

熒光微球中包裹了成千上萬個熒光分子，熒光強度高，制備的試紙條在檢測時質(zhì)控線 (C線)和檢測線 (T線) 均能隨著抗原梯度而表現(xiàn)出一定的趨勢。但是試紙條在長期存放過程中，C、T線的熒光值會出現(xiàn)衰減，而T/C的值比較穩(wěn)定。本研究的穩(wěn)定性檢測，將試紙條存放在 4 ℃與37 ℃ (加速破壞實驗) 后，結(jié)果顯示37 ℃存放24 d后T/C的值沒有明顯變化，因此根據(jù)T/C值與抗原濃度建立線性方程。本研究采用線性范圍、精密性、特異性等作為衡量 CA19-9熒光免疫層析試紙條的性能評價標準，經(jīng)過多次重復(fù)，確定線性范圍為 12.5–800 U/mL，批內(nèi)精密性與批間精密性均滿足小于15%的要求，與常見的腫瘤標志物 (CEA、AFP、CA125、CA153) 均無交叉反應(yīng)，與羅氏電化學(xué)發(fā)光法對比，其相關(guān)系數(shù)達到0.980 6。羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測CA19-9，由于儀器試劑昂貴，對操作人員要求較高，在大型醫(yī)院的檢測費用達到上百元，檢測時間需要20 min；而CA19-9熒光免疫層析試紙條對檢測儀器及操作人員要求不高，費用低廉、操作簡單，檢測費用僅為20元左右，15 min即可出結(jié)果，能滿足基層社區(qū)醫(yī)院的需求。本研究建立了一種精密性好、簡便、檢測范圍寬、能滿足床旁快速定量檢測的 CA19-9熒光免疫層析檢測方法，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。進一步研究將增加 CA19-9熒光免疫層析試紙條的生產(chǎn)批次，加大檢測的樣本數(shù)量，為其應(yīng)用于臨床打下基礎(chǔ)。

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