人大隱靜脈干細胞原代培養(yǎng)方法的改良

凌思英，張柏楊，滕勇，魏巍，喻武，孫建明，唐博，陳以寬

重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，重慶 400010

干細胞作為組織器官再生修復的種子細胞，是近年來研究的熱點與難點。從組織器官中獲取的成體干細胞 (Somatic stem cells) 不僅可用于細胞生物學的體外研究還可參與組織再生[1]。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞可促進胃大部切除術后創(chuàng)面的愈合[2]；小鼠下肢缺血肌肉組織中注射內(nèi)皮祖細胞可促進血管新生[3]；靜脈血栓中注射干細胞可促進血栓溶解[4]。骨髓干細胞動員劑可以促進大鼠深靜脈血栓的機化、溶解和吸收[5]。國內(nèi)外多項研究表明血管外膜存在 CD34、CD117、CD133、CXCR4等陽性干細胞[6]，其參與血管疾病的發(fā)生發(fā)展機制研究受到廣泛重視[7-8]。人大隱靜脈與胚胎組織、骨髓相比相對容易獲取[9]，若能將提取的干細胞用于自體移植，不但可以避免排斥反應減少并發(fā)癥，而且這將為疾病的臨床治療提供新的思路和前景。

目前血管壁細胞的提取方法主要有組織塊貼壁法和酶消化法[3,10-11]，組織塊貼壁法操作簡單，但培養(yǎng)時間較長，而酶消化法在消化完成后可以獲取較多數(shù)量的細胞，但需要嚴格掌握膠原酶濃度及消化時間，技術要求更高。用這兩種方法得到的血管壁細胞形態(tài)及活性等方面是否有差異仍需進一步研究。因此，本研究旨在相同的條件下，針對大隱靜脈血管壁干細胞提取方法進行研究，以期待高效獲得優(yōu)質(zhì)的原代培養(yǎng)干細胞，為其后續(xù)相關研究提供支持，為臨床探尋靜脈疾病的治療方法提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗中的大隱靜脈來源于重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院血管外科，為血管搭橋手術術后剩余的正常大隱靜脈，符合倫理學會要求，患者知情同意。

1.2 試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基 (Lonza公司)；胎牛血清(FBS，Gibco公司)；Ⅱ型膠原酶 (Sigma公司)；臺盼藍染液 (碧云天公司)；堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子 (EGF)、ITS、白細胞抑制因子 (LIF) 購于 R&D公司；兔單克隆 CD34、CD31、VEGF2、SMA抗體，小鼠單克隆 CD117抗體，購于Abcam公司；羊抗兔-FITC 488羊抗鼠-DyLight 549熒光二抗購于Abbkine公司；基質(zhì)膠購于Corning公司。

1.3 原代血管壁細胞的分離培養(yǎng)方法

1.3.1 大隱靜脈的獲取及處理

取血管搭橋手術后剩余的大隱靜脈，用含有雙抗的PBS沖洗5-6次，去除血管外脂肪組織并洗凈殘留血液。將血管均分為兩段，置于培養(yǎng)皿中并加入培養(yǎng)基充分浸潤血管，用無菌眼科剪分別將兩段血管剪碎成0.2 cm3。

1.3.2 組織貼壁法

將其中一份按照組織塊貼壁法均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，放入5% CO2、37 ℃恒溫孵育箱。1.5 h后取出培養(yǎng)瓶，加入2 mL完全培養(yǎng)基(含 10% FBS、鏈霉素+青霉素 100 U/mL、10 ng/mL bFGF、10 ng/mL EGF、0.2% ITS、0.1% LIF)，緩慢放回孵箱，以防組織塊漂浮，7 d后于倒置顯微鏡下觀察并換液。

1.3.3 酶消化法

將另一份組織塊置于50 mL無菌離心管中，加入20 mL 0.1% Ⅱ型膠原酶，于37 ℃水浴鍋中消化6-7 h，其中每半小時搖動5 min，使組織塊與膠原酶充分混合。待組織塊基本消化后，加入等體積的完全培養(yǎng)基終止消化，并用細胞篩過濾，收集濾液，離心后制成細胞懸液，孵育箱中培養(yǎng)。72 h后于倒置顯微鏡下觀察并換液。

1.4 觀察項目及檢測指標

1.4.1 Ⅱ型膠原酶最適消化濃度和時間

分別采用 0.05%、0.10%、0.15%的Ⅱ型膠原酶各消化 4-5、6-7、8-9 h，計數(shù)每個實驗濃度和時間點獲得的細胞數(shù)，進行統(tǒng)計分析。

1.4.2 細胞形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡下觀察兩種方法提取的血管壁細胞生長情況，如細胞形態(tài)、生長狀況、是否貼壁、細胞數(shù)量等。

1.4.3 細胞存活率

用臺盼藍染色液對不同提取方法獲得的P3代細胞進行染色，將細胞懸液與 0.4%臺盼藍溶液按9∶1 (體積比) 混勻，室溫放置3-5 min，于倒置顯微鏡下觀察并計算細胞活率，死細胞著淺藍色并膨大，無光澤，活細胞不著色并保持正常形態(tài)，有光澤。細胞活率 (%) =活細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100。

1.4.4 流式細胞術分選血管壁干細胞

收集細胞懸液，使細胞濃度為1×107個/mL，加入10% BSA，常溫下封閉20 min后重懸細胞，加入CD34-FITC和CD117-APC抗體，于4 ℃避光孵育45 min后加入培養(yǎng)基再次重懸細胞，行流式細胞術分選血管壁干細胞。采用flow-Jo軟件分析。

1.4.5 細胞免疫熒光染色

在無菌蓋玻片上滴加細胞懸液，待細胞完全貼壁后棄去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定10 min后用10%山羊血清37 ℃封閉30 min，加入CD34和CD117一抗，4 ℃過夜。次日，于37 ℃避光孵育二抗，1 h后加入DAPI染核，抗熒光淬滅劑封片。于倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像，計數(shù)雙陽性干細胞比例并分析。

1.4.6 細胞陽性率鑒定

收集細胞懸液，使細胞濃度為1×105個/mL，加入 CD31-FITC/VEGF2-FITC/SMA-FITC，于4 ℃避光孵育 30 min后加入培養(yǎng)基再次重懸細胞，行流式細胞術分選血管壁干細胞，采用flow-Jo軟件分析。

1.4.7 管腔形成實驗

96孔板提前預冷，冰上操作，每孔加入50 μL基質(zhì)膠，避免產(chǎn)生氣泡，于 37 ℃孵育箱中放置45 min。收集細胞懸液，使細胞濃度為2×105個/mL，每孔加入100 μL細胞懸液，37 ℃孵育箱孵育，分別于3 h和6 h采圖。

1.4.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 12.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差±s) 表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學顯著性。

2 結果與分析

2.1 Ⅱ型膠原酶最適消化濃度和時間

分別采用 0.05%、0.10%、0.15%的Ⅱ型膠原酶各消化 4-5、6-7、8-9 h，將收獲的細胞數(shù)量進行兩因素方差分析，結果顯示采用 0.10%的Ⅱ型膠原酶消化6-7 h為最適消化濃度和時間，差異有統(tǒng)計學意義 (圖1)。

圖1 Ⅱ型膠原酶消化濃度和時間分析Fig. 1 Number of vascular cells obtained at different concentrations of collagenase Ⅱ and different digestion times. The results showed that the yield was highest when digested with 0.10% collagenase Ⅱ for 6-7 hours.**P<0.01.

2.2 細胞形態(tài)學觀察

在倒置顯微鏡下觀察，組織塊貼壁法7 d后有少量細胞爬出，形態(tài)多呈梭形、三角形，未形成集落樣生長。14 d時，細胞數(shù)量增多，出現(xiàn)纖維樣細胞，胞體小，呈細絲狀。P1代細胞有部分聚集現(xiàn)象，但數(shù)量少，細胞體積較小，形態(tài)良好。當傳至 P3代時出現(xiàn)纖維化老化等現(xiàn)象(圖 2 A–D)。采用酶消化法獲得的血管壁細胞48 h后貼壁，伸出偽足，細胞形態(tài)多為梭形、三角形、不規(guī)則形，呈集落樣分布。7 d后細胞完全展開，集落增大變多，細胞排列緊密，形態(tài)佳。P1代細胞集落被吹散，但仍可見到細胞聚集現(xiàn)象，單個細胞形態(tài)良好。P3代時細胞仍可見聚集生長現(xiàn)象，纖維化細胞明顯少于組織塊法(圖 2 E–H)。

2.3 細胞存活率

臺盼藍染色結果顯示，組織塊法細胞存活率為 (91.7±1.2)%，酶消化法為 (97.2±0.65)%，對兩個結果進行獨立樣本t檢驗，P=0.005，差異有統(tǒng)計學意義 (圖3)。

圖2 倒置顯微鏡下血管壁細胞形態(tài)Fig. 2 Morphology of GSV cells under inverted microscope. Panels A–D show cells obtained by tissue attachment method at day 7, at day 14, at passage 1 (P1)and at passage 3 (P3). Panels E–H show cells isolated by enzymatic digestion at 48 h, at day 7, at P1 and at P3.Scale bars=100 μm.

圖3 組織塊法和酶消化法對細胞存活率的比較Fig. 3 Comparison of survival rates of cells derived from tissue attachment and enzymatic digestion.**P<0.01.

2.4 流式分選大隱靜脈干細胞

流式分選結果表明兩種血管壁細胞提取法均可獲得CD34、CD117雙陽性干細胞，其中組織塊獲得干細胞的陽性率為 (0.16±0.05)%，酶消化法為 (0.44±0.07)% (圖 4A，B)。對兩組分選結果進行獨立樣本t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005，圖4C)，說明采用酶消化法可獲得更多CD34+CD117+雙陽性干細胞，且實驗周期短。

圖4 組織塊法 (A) 和酶消化法 (B) 得到的P3代細胞進行流式分選 (將分選結果進行獨立樣本t檢驗)Fig. 4 Flow sorting of P3 cell derived from tissue attachment (A) and enzymatic digestion (B), respectively. Storing results of the two groups were assessed with independent t-test, **P<0.01 (C).

2.5 細胞免疫熒光染色

流式分選后獲得雙陽性干細胞，培養(yǎng)1周后進行CD34 (綠光)、CD117 (紅光) 免疫熒光染色(圖5A)，隨機選取5個視野計算陽性率，其中組織塊獲得干細胞的陽性率為 (89.41±2.06)%，酶消化法為 (94.03±1.83)%，結果進行獨立樣本t檢驗，P=0.04，差異有統(tǒng)計學意義 (圖5B)。

2.6 細胞陽性率鑒定

流式細胞儀檢測分選出的干細胞中 CD31、VEGF2、SMA 含量分別為 (0.12±0.01)%、(0.19±0.02)%、(0.45±0.01)%，結果進行獨立樣本t檢驗，P>0.05。與陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義(圖6)，排除成熟內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞存在的可能性。

2.7 成管實驗

37 ℃孵育箱孵育3 h后有部分干細胞匯合，但未形成完整管腔，(圖 7A)，6 h后管腔完全形成，(圖7B)，說明大隱靜脈分選出的干細胞具有向內(nèi)皮細胞分化形成管腔的潛能。

圖5 流式分選7 d后CD34、CD117染色 (A) 并將兩組陽性率進行比較 (B)Fig. 5 Double positive cells cultured for 7 days after flow sorting were subjected to immunofluorescent staining for CD34 (FITC 488; green) and CD117 (DyLight 549; red). (A) Scale bars=100 μm. (B) Graph was shown as ±s compared with control, *P<0.05.

3 討論

人類及動物的血管壁中主要存在4種具有分化和增殖能力的干細胞，即間充質(zhì)干細胞、周細胞、內(nèi)皮祖細胞、平滑肌祖細胞[12-13]。迄今為止對于這些血管壁祖細胞尚未明確定論，單純用Sca-1、CD34高表達不足以描述，因為這些祖細胞間細胞表面標記物存在重疊范圍，這反過來又使得定義特定的子集很難[14]?？蒲袌F隊在該領域經(jīng)過不斷探索發(fā)現(xiàn)了許多具有意義的研究結果。但總的來說，對于血管壁干細胞的研究目前還處于早期階段。Havelka等[15]和 Majesky等[16]認為內(nèi)皮祖細胞最初來源于骨髓和外周血，然而真正的血管壁干細胞是來源于血管壁之中。成體干細胞主要參與組織的再生修復，而骨髓間充質(zhì)干細胞來源于發(fā)育早期的中胚層，具有多項分化潛能、造血支持以及促進干細胞植入、免疫調(diào)控和自我復制等特點[17]。干細胞的獲取及多向分化潛能是目前醫(yī)學研究的熱點，如何獲得一種來源穩(wěn)定的多能干細胞成為再生醫(yī)學的主要研究方向[18]。研究表明，成體干細胞 (SSC) 與骨髓間充質(zhì)干細胞在免疫表型、生長動力學、特異性轉錄調(diào)控、端粒酶活性等方面差異無統(tǒng)計學意義[19]。Campagnolo 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，人大隱靜脈血管外膜中存在一種可高度增殖并表達間充質(zhì)干細胞標記物Sox2的CD34+CD31-成體干細胞，其具有克隆和多項分化潛能，在體外可誘導分化為多種細胞，如成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞、肌細胞和神經(jīng)元細胞。干細胞的多項分化潛能使其在再生醫(yī)學、體外疾病模擬、藥物篩選等方面具有廣闊的應用前景。干細胞技術近年來取得了很大進展，特別是多能干細胞的出現(xiàn)，使干細胞領域發(fā)生了巨大的變化[20]。

圖6 流式分選的干細胞進行CD31、VEGF2、SMA陽性率鑒定 (A)，并與陰性對照進行統(tǒng)計分析 (B)Fig. 6 Identification of positive rates of CD31, VEGF2 and SMA by Stem cells sorting by flow cytometry (A). (B)Graph shown as ±s compared with control, P>0.05.

圖7 細胞接種后分別于3 h (A)、6 h (B) 觀察管腔形成情況Fig. 7 Tube formation was observed under inverse microscope after seeded into 96-well plates for 3 hours (A) and 6 hours (B). Scale bars=100 μm.

本研究選用人大隱靜脈作為血管壁干細胞來源，將血管搭橋手術后剩余的正常大隱靜脈用于實驗研究，可獲得豐富的血管壁干細胞，并且自體移植干細胞治療缺血性疾病與異體移植相比更加安全、有效。另一方面靶向阻斷病理性血管干細胞可抑制血管生成與腫瘤生長[21]。組織塊貼壁法獲取血管壁干細胞雖然可行，但在研究應用中發(fā)現(xiàn)一些不足，如干細胞收獲率不理想，培養(yǎng)時間過長，直接影響細胞的生長狀態(tài)，不但延緩了實驗進度，而且浪費了科研經(jīng)費。近年來，酶消化法獲取血管壁干細胞的方法增多，但消化酶的作用時間和消化強度尚無明確定論[3,6,11]，故本研究通過對膠原酶濃度和消化時間進行反復摸索，分別用 0.05%、0.10%、0.15%的Ⅱ型膠原酶消化4-5、6-7、8-9 h，發(fā)現(xiàn)消化酶濃度過高或消化時間過長會導致大量細胞破裂，喪失貼壁能力，而消化酶濃度過低或消化時間過短又影響細胞獲取率。通過不斷的技術改進，最終確定0.1%的Ⅱ型膠原酶消化6-7 h可最大數(shù)量獲取血管壁細胞，細胞活性好。與組織塊法相比，酶消化法提取的血管壁細胞48 h后已有部分細胞貼壁，實驗周期短，獲得的細胞數(shù)量多呈明顯的集落樣生長。但在細胞存活率方面經(jīng)統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)酶消化法優(yōu)勢并不十分明顯，可能因統(tǒng)計次數(shù)較少和組內(nèi)差異較小等原因引起，在后續(xù)試驗中應增加實驗次數(shù)以及加入其他方面的比較，如流式細胞儀測量法、CCK-8法、MTT法、LDH釋放法等[22]。

綜上所述，對于人大隱靜脈干細胞培養(yǎng)采用酶消化法效果相對較好。分選出的干細胞進行管腔形成實驗證實其具有向內(nèi)皮分化的潛能[23]。本研究團隊進一步證實，將人大隱靜脈分選出的CD34、CD117雙陽性干細胞移植到裸鼠結扎的下腔靜脈外膜，在某些細胞因子的誘導下這些干細胞可以遷徙進入血栓，促進血栓的溶解[24]。血管的形成是生命發(fā)展的基礎，失調(diào)可能導致疾病甚至死亡，這將成為一個潛在的治療靶點。干細胞的獲取和擴大培養(yǎng)還可用于組織再生，甚至與組織來源無關的胚層起源研究，但存在一些關鍵問題，如這些細胞在體外具有多向分化潛能，而目前尚未證實其在體內(nèi)是否具有相似性。細胞系絕大部分還未能滿足臨床要求而限制了其臨床應用[25]?？傊鼙谧婕毎谘苡虾脱苌芍邪l(fā)揮重要作用。精確不同祖細胞群的定義和特征及其在生理和病理條件下功能效應研究將會推動具有臨床潛力的細胞療法的發(fā)展，用于治療動脈粥樣硬化和其他心血管疾病。

REFERENCES

[1]Aguilar-Gallardo C, Simon C. Cells, stem cells, and cancer stem cells. Semin Reproduct Med, 2013, 31(1):5–13.

[2]Askarov MB, Onischenko NA. Multipotent mesenchymal stromal cells of autologous bone marrow stimulate neoangiogenesis, restore microcirculation, and promote healing of indolent ulcers of the stomach. Bull Experim Biol Med, 2008, 146(4): 512–516.

[3]Invernici G, Emanueli C, Madeddu P, et al. Human fetal aorta contains vascular progenitor cells capable of inducing vasculogenesis, angiogenesis, and myogenesisin vitroand in a murine model of peripheral ischemia.Am J Pathol, 2007, 170(6): 1879–1892.

[4]Li XQ, Meng QY, Wu HR. Effects of bone marrowderived endothelial progenitor cell transplantation on vein microenvironment in a rat model of chronic thrombosis. Chin Med J, 2007, 120(24): 2245–2249.

[5]Chen YK, Jiang XM, Gong JP. Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor enhanced the resolution of venous thrombi. J Vascul Surg, 2008, 47(5):1058–1065.

[6]Campagnolo P, Cesselli D, Al Haj Zen A, et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation, 2010, 121(15): 1735–1745.

[7]Chen YK, Wong MM, Campagnolo P, et al. Adventitial stem cells in vein grafts display multilineage potential that contributes to neointimal formation. Arterioscl,Thromb, Vascul Biol, 2013, 33(8): 1844–1851.

[8]Wong MM, Chen YK, Margariti A, et al. Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-alpha-mediated nuclear factorkappa B activation. Arterioscl, Thrombo, Vascul Biol,2014, 34(3): 635–643.

[9]Kirchhoffer DG, Dierickx K. Human dignity and human tissue: a meaningful ethical relationship? J Med Eth,2011, 37(9): 552–556.

[10]Hu YH, Zhang ZY, Torsney E, et al. Abundant progenitor cells in the adventitia contribute to atherosclerosis of vein grafts in ApoE-deficient mice. J Clin Investigat, 2004, 113(9): 1258–1265.

[11]Zengin E, Chalajour F, Gehling UM, et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development, 2006, 133(8): 1543–1551.

[12]Lu WS, Li XR. Vascular stem/progenitor cells: functions and signaling pathways. Cellul Mol Life Sci, 2018,75(5): 859–869.

[13]Psaltis PJ, Simari RD. Vascular wall progenitor cells in health and disease. Circulat Res, 2015, 116(8):1392–1412.

[14]Bobryshev YV, Orekhov AN, Chistiakov DA. Vascular stem/progenitor cells: current status of the problem. Cell Tissue Res, 2015, 362(1): 1–7.

[15]Havelka GE, Kibbe MR. The vascular adventitia: its role in the arterial injury response. Vasc Endovascr Surg,2011, 45(5): 381–390.

[16]Majesky MW, Dong XR, Hoglund V, et al. The adventitia: a dynamic interface containing resident progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2011,31(7): 1530–1539.

[17]Fadini GP, Madeddu P, Waltenberger J, et al. Vascular stem and progenitor cells in diabetic complications. Exp Diabetes Res, 2012, 2012: 580343.

[18]Tabar V, Studer L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nat Rev Genet, 2014, 15(2): 82–92.

[19]Beltrami AP, Cesselli D, Bergamin N, et al. Multipotent cells can be generatedin vitrofrom several adult human organs (heart, liver, and bone marrow). Blood, 2007,110(9): 3438–3446.

[20]Wang LB, Zhu H, Hao J, et al. Progress in stem cells and regenerative medicine. Chin J Biotech, 2015, 31(6):871–879 (in Chinese).王立賓, 祝賀, 郝捷, 等. 干細胞與再生醫(yī)學研究進展. 生物工程學報, 2015, 31(6): 871–879.

[21]Watt SM, Athanassopoulos A, Harris AL, et al. Human endothelial stem/progenitor cells, angiogenic factors and vascular repair. JR Soc Interface, 2010, 7(S6): S731–S751.

[22]Li L, Yang YH, Wang S, et al. Comparison of cellular activity detection methods. J Biol, 2011, 28(1): 87–90,93 (in Chinese).李磊, 楊雨晗, 王雙, 等. 細胞活性檢測方法之比較.生物學雜志, 2011, 28(1): 87–90, 93.

[23]Shi MX, Li WJ, Li BZ, et al. Comparison of cellular activity detection methods. Chin J Biotech, 2009, 25(5):754–760 (in Chinese).史明霞, 李維佳, 李炳宗, 等. 人羊膜來源成體干細胞的多向分化潛能. 生物工程學報, 2009, 25(5):754–760.

[24]Ma Z, Chen YK. Establishment of inferior vena cava thrombosis model in nude mice. Med J Chin People’s Lib Army, 2016, 41(11): 883–886 (in Chinese).馬振, 陳以寬. 裸鼠下腔靜脈血栓模型的構建. 解放軍醫(yī)學雜志, 2016, 41(11): 883–886.

[25]Jonlin EC. Differing standards for the NIH stem cell registry and FDA approval render most federally funded h ESC lines unsuitable for clinical use. Cell Stem Cell,2014, 14(2): 139–140.