人多能干細胞向紅細胞的誘導分化

王思樂，王寧，蔡元星，王華巖

西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院 陜西省干細胞工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100

人誘導性多能干細胞 (hiPS細胞) 具有多向分化和自我更新的潛能，它是將外源多能轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc導入成體細胞，經(jīng)過體細胞重編程獲得的[1-2]。iPS細胞具有分化為內(nèi)、中、外三個胚層細胞和各種組織、器官的能力，可以用于構(gòu)建臨床疾病的體外細胞模型，研究相關(guān)病理損傷細胞的發(fā)病機制和治療方法[3-5]。基于hiPS細胞的擴繁增殖潛能和體外分化能力，可以利用hiPS經(jīng)體外誘導分化為造血干細胞，然后再進一步向紅細胞系方向特異誘導分化，最終獲得成熟紅細胞，為血液病的臨床治療提供了基本原理和技術(shù)手段。另外，人間充質(zhì)干細胞 (hMSC細胞) 除了具有體外增殖和多向分化能力外，還具有免疫原性低的特點[6-7]，因此，常被用于再生醫(yī)學的研究，例如將hMSC作為實驗材料，使其特異分化為軟骨等組織中的細胞，來修復機體損傷的部分[8-10]。

紅細胞的體內(nèi)發(fā)育起始于胚胎時期的卵黃囊血島組織，最初產(chǎn)生內(nèi)皮細胞。隨后在主動脈-性腺-中腎區(qū) (AGM) 產(chǎn)生造血祖細胞，隨著胎兒肝臟的形成，卵黃囊和 AGM 區(qū)的血細胞轉(zhuǎn)移至胎兒肝臟，造血祖細胞 (HSC細胞) 在此產(chǎn)生和發(fā)育。胎兒出生后，只在骨髓產(chǎn)生的造血祖細胞和造血干細胞繼續(xù)分化為成熟的紅細胞、白細胞等多種細胞系[11]。體外誘導紅細胞也是利用hiPS模擬體內(nèi)發(fā)育階段將其先誘導為造血祖細胞，再使其分化為紅細胞[12-14]；或直接利用HSC細胞誘導分化為成熟紅細胞[15-16]。目前，體外誘導產(chǎn)生紅細胞的方法主要有類胚體 (EB) 法和共培養(yǎng)法兩種方式。采用類胚體誘導分化的技術(shù)方法，是利用人胚胎干細胞 (hES細胞) 或 hiPS，通過懸浮培養(yǎng)形成EB，然后EB再在特異誘導因子或與基質(zhì)細胞 (如鼠源BM 細胞S17和OP9，內(nèi)皮細胞 C166等) 共培養(yǎng)的條件下[17-19]，使其分化為成熟紅細胞。但是，這種 EB法的誘導體系通常涉及3–4個誘導階段，操作步驟過于繁瑣，且所需成本較高。而產(chǎn)生的紅細胞不能確保完全脫核，帶核的紅細胞可能存在基因突變等危險，并且誘導體系中含有胎牛血清、基質(zhì)細胞等動物源性物質(zhì)的干擾，所以還不能用于臨床輸血[17-26]。共培養(yǎng)方法首先利用hES或hiPS與基質(zhì)細胞貼壁培養(yǎng)，形成造血細胞和內(nèi)皮細胞的前體細胞 (即hemangioblasts)，然后將誘導獲得的hemangioblasts向紅細胞方向誘導，最后將獲得的紅細胞收集，與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)從而提升紅細胞的脫核率[17,26]。由于這些體外紅細胞的誘導技術(shù)在不同程度上使用了胎牛血清FBS和飼養(yǎng)層共培養(yǎng)細胞等動物源性物質(zhì)，因此，臨床應用價值有限。另外，最終獲得的紅細胞只有極少部分能夠成為完全成熟的紅細胞，產(chǎn)量低。與上述方法不同，本研究采用兩步誘導法，先利用多能干細胞誘導得到 CD31和CD34陽性表達的細胞群，再將獲得的CD31+和 CD34+的細胞群通過半懸浮培養(yǎng)的方式誘導分化為成熟紅細胞。

本研究中特別選用了 hUCMSCRh-A細胞進行兩步法誘導，其目的在于最終誘導獲得的紅細胞將不攜帶Rh抗原，為體外大量制造Rh陰性的“萬能血”提供技術(shù)探索。本研究采用獨特的紅細胞兩步誘導法，與之前報道的方法相比，操作更為簡便，成本較低，不涉及胎牛血清和飼養(yǎng)層細胞等動物源物質(zhì)的干擾，可以大量制備成熟紅細胞，且產(chǎn)出效率較以往的體系有明顯提升。這一新的技術(shù)方法有助于推進人紅細胞的體外誘導研究和體外大量制備及其臨床應用。

1 材料與方法

1.1 材料

人iPS細胞 (hiPSCs) 購自斯丹賽有限公司，Rh陰性A型人臍帶間充質(zhì)干細胞 (hUCMSCRh-A)由西安市九州醫(yī)藥科技園有限公司提供，人全血細胞由西北農(nóng)林科技大學校醫(yī)院提供。

1.2 試劑和耗材

總 RNA提取試劑盒購自天根生化科技公司；DNA marker來自BioLabs公司 (美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、細胞消化液 (Cell Dissociation Buffer, CDB，13151014)、AlbuMAX?Ⅰ富脂牛血清白蛋白 (BSA，1116392)、胰酶 (Trypsin，1809364)、非必需氨基酸(Nonessential amino acid，NEAA，1703183) 和 L-谷氨酸 (GlutaMAX，L-Gln，1848033) 均購自 Gibco公司 (美國)；DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium，AB10101516)、α-MEM (Alpha Minimum essential medium，AB212879)、胎牛血清 (Fetal bovine serum，F(xiàn)BS，1P1506) 購自Hyclone公司；人 bFGF (Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF，100-18B)、BMP4 (Bone morphogenetic protein 4，120-05)、VEGF (Vascular endothelial growth factor，100-20)、Flt3 ligand (Fms-related tyrosine kinase 3 ligand，300-19)、EPO (Erythropoietin，100-64) 購自PeproTech公司；SCF (Recombinant human stem cell factor，255-SC-010/CF) 購自R&D system公司；Y27632 (ROCK 抑制劑，562822)、Matrigel膠(354234)、CD31 (5090933)、CD34 (28476)、CD44(37383)、CD45 (28444)、CD71 (05021207) 流式抗體均購自BD公司 (美國)；mTeSRTM1培養(yǎng)基 (85850)和造血干細胞培養(yǎng)基 (09600) 購自 Stemcell公司(加拿大)；Stemline Ⅱ 造血培養(yǎng)基 (S0192)、β-巰基乙醇 (2-Mercaptoethanol，β-ME，SHBD0359V)、甲基纖維素 (Methyl cellulose，MC，V900506) 購自Sigma (美國)；IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium，1732829) 等購自Invitrogen (美國)；PCR Mix購自西安 Tsingke公司；PCR引物由西安Tsingke公司合成 (表1)。

表1 引物信息表Table 1 Primers used in this study

誘導實驗中涉及如下培養(yǎng)液：BVF培養(yǎng)液(Stemline Ⅱ造血培養(yǎng)基，50 ng/mL BMP4，50 ng/mL VEGF，50 ng/mL bFGF)、BGM培養(yǎng)液 (造血干細胞培養(yǎng)基，50 μg/mL VEGF，25 μg/mL Flt3 ligand，8 μg/mL bFGF)、BGME 培養(yǎng)液 (BGM 培養(yǎng)液，3 units/mL EPO)、SSE培養(yǎng)液 (Stemline Ⅱ 造血培養(yǎng)基，50 ng/mL SCF，3 unit/mL EPO)、SSEMC培養(yǎng)液 (SSE培養(yǎng)液，0.5% MC)、SSE34培養(yǎng)液(StemPro-34 SCF培養(yǎng)基，50 ng/mL SCF，3 unit/mL EPO)、SE34培養(yǎng)液 (StemPro-34 SCF培養(yǎng)基，3 unit/mL EPO)。

1.3 細胞培養(yǎng)

將凍存的 hUCMSCRh-A細胞培養(yǎng)在 α-MEM中，并添加15% FBS、1% NEAA、1% GlutaMAX和0.1 mmol/L β-ME。待細胞密度長至80%左右，用0.05%胰酶消化傳代，將擴增的細胞采用細胞凍存技術(shù)冷凍保存。hiPSC細胞采用mTeSRTM1培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)皿用Matrigel膠預先處理好，培養(yǎng) 6–7 d用細胞消化液消化傳代。hUCMSCRh-A和hiPSC細胞均培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的恒溫箱中。

1.4 總RNA提取、PCR和熒光定量RT-PCR

當細胞密度達到90%左右，將細胞消化離心，并向收集的沉淀中加入 RZ細胞裂解液。隨后按照總RNA提取試劑盒提取RNA，并檢測OD值。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA。用 CD29、CD31、CD34、CD45、CD90等特異引物 (表 1)，按照 PCR Mix說明書進行PCR，程序為：96 ℃ 2 min；96 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶大小。熒光定量RT-PCR根據(jù)設(shè)計的 qβ-globin、qγ-globin、qε-globin引物，按照熒光定量試劑盒說明書進行RT-PCR擴增程序，并用2–ΔΔCt法計算表達變化倍數(shù)。

1.5 hUCMSCRh-A和hiPSC細胞的誘導分化

將干細胞誘導分化為 BRC細胞主要經(jīng)過兩個階段的誘導分化過程 (圖1)。第一階段的誘導實驗采用 BVF培養(yǎng)液，將人多能干細胞誘導分化為 CD31+和 CD34+的陽性細胞群。采用hUCMSCRh-A細胞進行誘導時，選取培養(yǎng)至第5代的細胞并調(diào)整其密度為 8×104–10×104個/mL，將其接入直徑35 mm的細胞培養(yǎng)皿。然后第2天換BVF培養(yǎng)液，記為誘導第0天。誘導期間2 d換液1次，當細胞長到80%左右，用Accutase消化傳代。此階段持續(xù)誘導至第10天。采用hiPSC細胞進行誘導時，調(diào)整細胞密度為3×104–4×104個/mL。接入預先鋪好四型膠原直徑為100 mm的細胞培養(yǎng)皿中，并添加終濃度為10 μmol/L的Y27632。第2天換BVF培養(yǎng)液，記為誘導第0天。2 d換液1次，并持續(xù)誘導至第6天。通過上述方法，誘導 hUCMSCRh-A和 hiPSC細胞分化，可獲得CD31+和CD34+的細胞群。

圖1 誘導分化流程圖Fig. 1 Scheme of two stages of cell differentiation.

1.6 誘導紅細胞

第二階段的誘導過程為將含有 CD31+和CD34+陽性細胞的細胞群通過半懸浮培養(yǎng)，誘導分化為成熟紅細胞。首先，將第一步誘導獲得的CD31+和CD34+的細胞群用Accutase消化后收集，細胞計數(shù)后用 Stemline Ⅱ培養(yǎng)基重懸，每1×105–1.5×105個細胞 (<0.1 mL) 與 2.5–3 mL BGM培養(yǎng)液混勻。使用16號針頭的注射器將細胞混合物加入到低吸附的6孔板培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的恒溫箱中，記為第二階段誘導的第0天。誘導至第6天，添加2 mL BGME培養(yǎng)液。并持續(xù)誘導至第9天，添加與培養(yǎng)皿中液體等體積的BGME培養(yǎng)液。當誘導至第14天，將培養(yǎng)皿內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至直徑100 mm的低吸附培養(yǎng)皿中，加入與現(xiàn)有培養(yǎng)基液體積等量的SSE培養(yǎng)液。隨后誘導至第17天，加入現(xiàn)有體積一半的SSEMC培養(yǎng)液，每2–3 d加液1次，再繼續(xù)孵育7 d。接下來，使用含0.5% BSA的IMDM培養(yǎng)液，在誘導第24天用IMDM培養(yǎng)液稀釋培養(yǎng)皿中的液體。用5倍于培養(yǎng)皿液體的IMDM培養(yǎng)液，在2 000 r/min、15 min的條件下離心并收集細胞。隨后用IMDM培養(yǎng)液重懸細胞，接入組織培養(yǎng)瓶中過夜培養(yǎng)。然后在誘導的第25天離心并收集組織培養(yǎng)瓶中的細胞，使用SSE34培養(yǎng)液重懸細胞，2 d換液 1次并持續(xù)誘導至第 31天。最后換為SE34培養(yǎng)液，持續(xù)誘導至第36天，可獲得成熟紅細胞。將獲得的成熟紅細胞轉(zhuǎn)移至細胞離心管，自然沉降后有肉眼可見的細胞紅色沉淀。

1.7 流式細胞儀檢測

當培養(yǎng)皿中的細胞長至 90%-100%，使用Accutase消化細胞，并進行細胞計數(shù)。用 FACS緩沖液 (3% FBS，97% PBS) 重懸細胞沉淀，并清洗 2次。隨后調(diào)整細胞密度為 2×105–3×105個/管，并向每管加入20 μL抗體和80 μL FACS緩沖液，遮光置于冰上染色 30 min。之后每管加入 1 mL FACS緩沖液，離心洗去抗體。最后用500 μL FACS緩沖液重懸，準備上機檢測。

1.8 吉姆薩染色

用移液管吸取10–20 μL待檢溶液滴在載玻片上，均勻涂布。室溫下陰干后，用固定液固定涂片10 min。隨后將涂片置姬姆薩工作液中，染色30 min。染色完成后，涂片立即用蒸餾水洗脫。最后用甘油壓片，指甲油封固，置于顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計學分析

吉姆薩染色后的誘導紅細胞和人紅細胞，分別統(tǒng)計其紅細胞和脫核紅細胞的總數(shù)，并經(jīng)過t-test檢驗差異是否具有統(tǒng)計學意義。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 人UCMSCRh-A細胞的培養(yǎng)和鑒定

hUCMSCRh-A細胞體外培養(yǎng)，細胞傳代至第10代后，通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞形態(tài)沒有明顯改變，呈現(xiàn)較短的梭狀形態(tài)，大小為十幾微米，體外培養(yǎng)期間并沒有出現(xiàn)細胞衰老和分化的現(xiàn)象(圖2A)。待hUCMSCRh-A長滿時收樣做PCR檢測。利用 RCR檢測 hUCMSCRh-A相關(guān)標記基因的表達，通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，hUCMSCRh-A細胞表達CD29、CD90和CD117基因，不表達造血相關(guān)的基因，如基因CD31、CD34和CD45(圖2B)。隨后，采用細胞流式儀檢測hUCMSCRh-A蛋白水平的表達。收取hUCMSCRh-A細胞，制備成單細胞懸液用于細胞流式儀的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD44陽性的hUCMSCRh-A細胞占98%，CD71陽性的 hUCMSCRh-A細胞占 81.4%；而 CD31、CD34和 CD45陽性的 hUCMSCRh-A細胞最高只有0.2% (圖2C)。上述結(jié)果表明hUCMSCRh-A細胞表達間充質(zhì)干細胞的相關(guān)標記CD29、CD44、CD90等，不表達CD31、CD34等造血干細胞相關(guān)標記。

圖2 hUCMSCRh-A細胞的培養(yǎng)和鑒定Fig. 2 Culture and evaluation of hUCMSCRh-A. (A) Morphology of hUCMSCRh-A. (B) PCR analysis of cell surface markers in hUCMSCRh-A. (C) Flow cytometry analysis of cell surface markers in hUCMSCRh-A.

2.2 多能干細胞向 CD31+和 CD34+的細胞群分化

采用體外培養(yǎng)至第5代的hUCMSCRh-A細胞，進行第一階段的誘導分化實驗。細胞在分化過程中，第2天誘導的形態(tài)無明顯差異；第4天時，細胞已基本長滿，需要進行細胞傳代。到第6天時，可發(fā)現(xiàn)部分細胞變?yōu)樯扉L的梭形；繼續(xù)誘導至第8天時，細胞長滿。傳代后長至第10天，可以清楚地觀察到細胞的大小較第0天有明顯的改變，細胞全部變?yōu)檩^長的梭形 (圖 3A)。在誘導過程中，每2 d取樣1次，持續(xù)至第18天。通過RT-PCR檢測，可以看出 hUCMSCRh-A細胞分化后，細胞在第8天開始有CD31和CD34基因的表達，且表達量在第10天達到最大值，而之后這些基因的表達水平逐漸降低。并且，hUCMSCRh-A細胞持續(xù)表達CD29、CD90、CD117，不表達CD45(圖3B)。因此，我們采用誘導至第10天和第14天的細胞，流式細胞儀檢測 CD31和CD34的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導第10天時，帶CD31標記的細胞比率為 5.3%，CD34標記的細胞比率為22.7% (圖 3C)。而第 14天時，帶 CD31標記的細胞比率下降至 1.22%，CD34標記的細胞比率降至5.57% (圖3D)。上述結(jié)果顯示，經(jīng)過第一階段的誘導，hUCMSCRh-A細胞能夠分化成為CD31+和CD34+的細胞群，并表達造血干細胞相關(guān)的標記。

人iPS細胞進行第一階段的誘導分化實驗，在誘導過程中，細胞的形態(tài)變化非常明顯。從誘導的第0–2天，細胞克隆逐漸長大，且克隆數(shù)目明顯增多。至第 4天時細胞克隆已長成片狀，細胞邊緣開始分化為多邊形的上皮樣。第6天時克隆已扁平，細胞大部分都成為上皮樣形態(tài)，且更為致密 (圖 4A)。將誘導至第 6天的細胞收樣，制備單細胞懸液并用流式細胞儀檢測。結(jié)果顯示，帶有CD31標記的細胞比率為31.2%，帶有CD34標記的細胞比率為 8.2% (圖 4B)。通過體外貼壁誘導階段，人iPS細胞可分化為CD31+和CD34+的細胞群。

2.3 CD31+和 CD34+的細胞群向紅細胞誘導分化

將第一階段貼壁誘導獲得的CD31+和CD34+的陽性細胞群消化離心，再經(jīng)過36 d的半懸浮誘導培養(yǎng)，使其分化為成熟紅細胞。首先，將獲得的成熟紅細胞取樣，利用吉姆薩染色的方法，通過顯微鏡觀察，可以發(fā)現(xiàn)細胞呈現(xiàn)紅色，且有完全粉紅色無細胞核的紅細胞。而誘導分化所獲得的紅細胞，通過計數(shù)統(tǒng)計，直徑在7–8 μm之間的脫核紅細胞比例可達87.09% (P<0.05)，說明其形態(tài)與正常人紅細胞相比差異較小，大小也與正常人紅細胞相近 (圖 5A)。為了檢測紅細胞中成熟β-globin的表達水平，我們采用熒光定量RT-PCR進行檢測。結(jié)果顯示，誘導的紅細胞中3種球蛋白 (成熟期的β-globin、胎兒期的γ-globin和胚胎期的ε-globin) 的表達比例分別是20%、74%和6%(圖5B)，其中β-globin的表達量占整體globin的20%，說明誘導的成熟紅細胞具備攜氧能力。最后，將誘導的紅細胞收集到細胞離心管中，自然靜置沉降2 h后，肉眼可看見紅細胞沉淀，且與人全血靜置后的沉淀顏色相似。細胞計數(shù)得到4.2×107hiPSC/mL，與起始時 3×104–4×104hiPSC/mL的細胞數(shù)相比，誘導產(chǎn)生的紅細胞數(shù)量是起始iPS細胞量的1 050–1 400倍，同時也是第一階段CD31+和 CD34+細胞群 (1×105–1.5×105個) 的 280–420 倍(圖 5C，5D)。

圖3 hUCMSCRh-A細胞誘導分化為CD31+和CD34+的細胞群Fig. 3 Differentiation of hUCMSCRh-A into CD31+ and CD34+ cells. (A) Morphology of induced hUCMSCRh-A cells in different time points. (B) RT-PCR analysis of cell surface markers from induced hUCMSCRh-A cells. (C, D) Flow cytometry analysis of CD31+ and CD34+ cells derived from hUCMSCRh-A cells.

圖4 hiPS細胞誘導分化為CD31+和CD34+的細胞群Fig. 4 Differentiation of hiPS into CD31+ and CD34+ cells. (A) Morphology of induced hiPS in different time points.(B) Flow cytometry analysis of CD31+ and CD34+ cells.

圖5 CD31+和CD34+的細胞群分化為紅細胞Fig. 5 Differentiation of CD31+ and CD34+ cells into RBC. (A) Giemsa staining of induced RBC. NC: negative control. (B) qRT-PCR analysis of globin expression in induced RBCs. (C) Static settlement of induced RBCs. (D) Static settlement of human whole blood.

3 討論

目前，急性白血病、慢性白血病、骨髓增生異常綜合癥等各種血液疾病的治療方法主要依賴于臨床輸血，而當務(wù)之急是體外大量制備成熟的紅細胞[20-21]。人iPS因其強大的分化和增殖能力，我們選取其作為研究模型，可按照我們優(yōu)化的誘導體系將其向紅細胞分化。而這種方法的實現(xiàn)，提供了臍帶間充質(zhì)干細胞向紅細胞分化的一種手段，我們采用 Rh陰性的臍帶間充質(zhì)干細胞為研究對象，其誘導出的細胞是不含 Rh抗體的，為實現(xiàn) Rh陰性的 O型“萬能血”提供了可能。以往體外紅細胞誘導通過 EB或共培養(yǎng)的體系，但是這兩種方法的操作復雜，誘導效率低，且由于體系中含有動物源性物質(zhì)，所以制備的紅細胞無法用于臨床的輸血應急。本文的兩步法誘導紅細胞(圖 1)，將人 iPS細胞和人 UCMSCRh-A細胞，在無動物源性物質(zhì)干擾的條件下，省去了第一階段的 EB懸浮和與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)步驟，經(jīng)過貼壁誘導，使其分化為CD31+和CD34+的細胞群；然后利用收集的CD31+和CD34+的細胞群，經(jīng)第二步半懸浮體系的誘導，在不與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)的條件下使其最終分化為成熟的紅細胞。這種方法相比以往的紅細胞誘導體系，省去了多階段培養(yǎng)的繁瑣步驟，還降低了實驗成本。其中采用的無血清、無飼養(yǎng)層細胞等無動物源性物質(zhì)的培養(yǎng)體系，排除了其他物質(zhì)的干擾，產(chǎn)生的成熟紅細胞可用于臨床輸血研究。在第一階段的誘導過程中，與人iPS細胞相比，人UCMSCRh-A細胞的誘導時間更長。人iPS細胞的第一階段誘導需要6 d的持續(xù)誘導，而人UCMSCRh-A細胞則需要至少10 d的持續(xù)誘導，才能獲得較理想的CD31+和CD34+的細胞群。除此之外，由人iPS細胞分化的細胞，更傾向于表達CD31；相反，人UCMSCRh-A分化的細胞更傾向于表達 CD34。并且，兩種細胞在BVF培養(yǎng)液中的增殖速度都較分化前更快。然而，CD31+和 CD34+的細胞群的誘導效率還有待提高，可通過磁珠分選的方法富集CD31+和CD34+的細胞群，從而為后續(xù)誘導提供更多的種子細胞。在第二階段血紅蛋白的檢測中，由于血紅蛋白是由4條球蛋白鏈組成的四級結(jié)構(gòu)，每一條鏈中均有一個疏水結(jié)構(gòu)，可結(jié)合一個血紅素并攜帶一分子氧。在胚胎期血紅蛋白主要由兩條α鏈和兩條γ鏈組成 (α2γ2)，在胎兒期主要由 α2ε2組成，在成熟期主要由α2β2組成[14,27]。我們分別檢測了胚胎期的ε-globin、胎兒期的γ-globin和成熟期的β-globin來驗證誘導的紅細胞是否進入了成熟階段。人iPS細胞來源廣泛，增殖能力強，是體外誘導成熟紅細胞重要的細胞來源；而人UCMSCRh-A細胞，由于其不攜帶 Rh抗原，所以誘導獲得的成熟紅細胞也是 Rh陰性。若將本實驗的誘導體系應用到人UCMSCRh-O細胞，則可大量誘導出不含 Rh-O抗體的紅細胞，實現(xiàn)體外制備“萬能血”的技術(shù)方法，這對于臨床輸血的研究有著重大的意義。

本研究在無動物源性物質(zhì)干擾的前提下，以獨特的兩步法，成功將人 iPS細胞和人UCMSCRh-A細胞特異誘導為成熟紅細胞。本方法的誘導效率相比 EB法和共培養(yǎng)法的效率有所提高[12,16-22,24-26]，由人iPS細胞誘導的紅細胞中成熟紅細胞標志性的β-globin表達由之前的16%提升至 20%[16,26]，但由人 MSC細胞誘導獲得的紅細胞效率并不高，說明本方法的第二階段并不適用于人MSC細胞。通過吉姆薩染色法可以觀察到，誘導的成熟紅細胞形態(tài)及大小與正常人紅細胞相似，并有紅細胞去核的現(xiàn)象。但誘導的成熟紅細胞，相比人全血的紅細胞數(shù)量較少，并且誘導紅細胞的脫核效率可通過與人間充質(zhì)細胞等基質(zhì)細胞共培養(yǎng)來提高[17,25-26]。綜上所述，我們的研究成果為優(yōu)化人體外誘導紅細胞提供了技術(shù)改進，為進一步研究臨床輸血的應用打下了基礎(chǔ)。

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