人工模擬胃腸道模型在食源性致病菌耐受及致病機(jī)理中的應(yīng)用

王思琦，張昭寰，穆麗麗，劉海泉,2,3,4，潘迎捷,2,3，趙勇,2,3

1 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306

2 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306

3 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室 (上海)，上海 201306

4 上海海洋大學(xué) 食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海 201306

食源性致病菌引起的食品安全問題是全球性的焦點(diǎn)問題，也是亟待解決的科研難點(diǎn)問題[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織 (WHO) 研究報(bào)道，全世界每年共暴發(fā)6億起食品安全事件，其中28%是由食源性致病菌的污染所導(dǎo)致的[2]。常見食源性致病菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌及單增李斯特菌等，均能引起發(fā)燒、嘔吐、腹瀉、流產(chǎn)等癥狀，嚴(yán)重的可導(dǎo)致原發(fā)性敗血癥甚至致人死亡，對(duì)食品安全和公眾健康構(gòu)成了極大的威脅[3-4]。在人體胃腸道中對(duì)食源性致病菌的耐受性及致病機(jī)理進(jìn)行研究，有助于揭示其導(dǎo)致人體患病的根本原因，從源頭上遏制食源性致病菌的患病風(fēng)險(xiǎn)[5]。但是，由于現(xiàn)階段科研條件所限，且有悖道德倫理等方面的因素，往往難以對(duì)人體胃腸道直接進(jìn)行取樣研究[6]。因此，開發(fā)替代人體實(shí)驗(yàn)的人工模擬胃腸道模型，具有重要的科研價(jià)值和實(shí)際意義。

人工模擬胃腸道模型 (Stimulated gastrointestinal tract model) 是在實(shí)驗(yàn)室條件下，通過模擬人體消化過程中化學(xué)、物理及生物作用，進(jìn)行食源性致病菌的耐受性、致病機(jī)理、腸道菌群互作及疫苗開發(fā)等研究。一般來說，可將人工模擬胃腸道模型分為體外模型和體內(nèi)模型。體外模型指的是對(duì)人體消化液及胃腸道內(nèi)壁的蠕動(dòng)進(jìn)行模擬，如Wijnands等[7]使用體外靜態(tài)模型對(duì)沙門氏菌在模擬胃液中的存活進(jìn)行研究，Roussel等[8]則使用體外動(dòng)態(tài)模型對(duì)成年人及兒童胃腸道進(jìn)行模擬，并結(jié)合流式細(xì)胞儀探究了大腸桿菌在不同人群中致病力的區(qū)別；體內(nèi)模型通常依靠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行模擬，如Ritchie等[5]使用新西蘭幼兔對(duì)副溶血性弧菌的致病力及在小腸的定植作用進(jìn)行了研究，Mathur等[6]首次將人源化小腸上皮細(xì)胞的小鼠模型應(yīng)用于沙門氏菌疫苗的鑒定。人工模擬胃腸道模型的出現(xiàn)彌補(bǔ)了人體試驗(yàn)的不足，隨著此類模型的快速發(fā)展，已逐步應(yīng)用于各類食源性致病菌耐受及致病機(jī)理的研究，具有廣泛的應(yīng)用前景和巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

因此，本文針對(duì)食源性致病菌這一重點(diǎn)、難點(diǎn)問題，詳細(xì)綜述了人工模擬胃腸道模型在其耐受性及致病機(jī)理研究中的應(yīng)用，將現(xiàn)存的人工模擬胃腸道模型系統(tǒng)地劃分為4類：體外靜態(tài)模型、體外動(dòng)態(tài)模型、普通動(dòng)物模型及人源化動(dòng)物模型，對(duì)其概念和特性進(jìn)行了詳細(xì)的介紹，總結(jié)了其優(yōu)勢(shì)與不足，并提出了人工模擬胃腸道模型未來的研究方向，以期提供全面系統(tǒng)的信息，為食源性致病菌致病機(jī)理研究的進(jìn)一步發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 體外胃腸模型

人體胃腸道是一個(gè)非常復(fù)雜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，如圖 1所示，包括胃、小腸 (十二指腸、空腸、回腸) 及大腸 (橫結(jié)腸、升結(jié)腸、降結(jié)腸、盲腸)，還涉及胃腸道內(nèi)壁蠕動(dòng)以及胃酸、膽汁、蛋白酶的分泌等一系列物理化學(xué)的過程[9]。體外胃腸模型 (In-vitrogastro-intestinal system) 通常在實(shí)驗(yàn)室條件下，運(yùn)用相關(guān)設(shè)備結(jié)合人工添加的模擬消化液 (模擬胃液、模擬腸液等)，對(duì)胃腸道消化過程中物理和化學(xué)作用進(jìn)行模擬。目前，體外胃腸模型已被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、毒理學(xué)及營(yíng)養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域。相較于活體實(shí)驗(yàn)，體外胃腸模型能夠降低實(shí)驗(yàn)成本，具有較高的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，且不受到倫理道德的限制。本文根據(jù)體外模型能否模擬人體胃腸道蠕動(dòng)過程中的物理作用，將其分為體外靜態(tài)模型 (In-vitrostatic gastro-intestinal model) 和體外動(dòng)態(tài)模型 (In-vitrodynamic gastrointestinal model)，現(xiàn)綜述如下。

1.1 體外靜態(tài)胃腸模型

體外靜態(tài)胃腸模型對(duì)胃腸道消化液的化學(xué)成分進(jìn)行模擬，其并不涉及復(fù)雜物理及生物作用。如圖2所示，該模型將錐形瓶、離心管或燒杯等作為反應(yīng)器，通過添加模擬胃液、腸液、膽汁等[11-12]，在模擬人體正常體溫中 (37 ℃) 進(jìn)行反應(yīng)。該模型具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前使用最為廣泛的人工模擬胃腸道模型，可應(yīng)用于研究食源性致病菌的耐受性、毒力表達(dá)及對(duì)腸上皮細(xì)胞的作用等。

圖1 人體胃腸道模型示意圖(改自Blausen Medical [10])Fig. 1 A schematic diagram of the human gastro-intestinal tract model (adapted from Blausen Medical[10]).

圖2 體外靜態(tài)胃腸模型模擬示意圖Fig. 2 A schematic diagram of in-vitro static gastro-intestinal model simulation.

表1綜述了現(xiàn)階段體外靜態(tài)胃腸模型在食源性致病菌研究中的應(yīng)用情況，主要為探究致病菌在人體模擬消化中的耐受性。1995年，Arnold等[13]研究了純培養(yǎng)狀態(tài)下不同致病性的大腸桿菌在pH 1.5的模擬胃液中的存活能力，結(jié)果表明，較腸侵襲性、腸致病性大腸桿菌及痢疾志賀氏菌而言，腸出血性大腸桿菌具有更強(qiáng)的存活能力。1999年Roering等[14]用pH 1.5模擬胃液處理大腸桿菌 O157:H7、單增李斯特菌及鼠傷寒沙門氏菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)在模擬胃液中大腸桿菌具有較高的存活率。2008年 Tamplin[15]研究了牛肉中大腸桿菌在模擬胃液中的失活特性，證明了 pH值是造成大腸桿菌失活的主要因素。2007年 Bergholz等[16]探究了果肉基質(zhì)中耐四環(huán)素大腸桿菌的耐酸能力，發(fā)現(xiàn)耐四環(huán)素大腸桿菌在模擬胃液中耐酸能力高于標(biāo)準(zhǔn)菌株，耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)移程度是標(biāo)準(zhǔn)菌株的 2.3倍。此外，靜態(tài)模型還可與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，如2011年Wijnands等[7]將經(jīng)過模擬胃液和腸液處理的沙門氏菌加入含有Caco-2細(xì)胞的12孔板，在 5% CO2氣體狀態(tài)下，研究了該菌對(duì)人體細(xì)胞的黏附能力 (ATT) 和侵襲能力 (ITV)。

表1 體外靜態(tài)胃腸模型在食源性致病菌研究中的應(yīng)用Table 1 Applications of in-vitro static gastro-intestinal model on different foodborne pathogens

1.2 體外動(dòng)態(tài)胃腸模型

除細(xì)胞模型外，體外靜態(tài)模型還可結(jié)合流式細(xì)胞儀、微流控及生物芯片等前沿技術(shù)，對(duì)食源性致病菌在胃腸道模擬消化過程中生理生化的變化進(jìn)行研究。然而體外靜態(tài)模型難以模擬人體胃腸道消化過程中的動(dòng)態(tài)變化，如胃排空、胃蠕動(dòng)、pH值變化、酶以及消化液分泌等動(dòng)態(tài)過程，使得該模型在致病菌研究中仍存在一些不足[21]。為了克服這一缺點(diǎn)，研究人員開發(fā)了可模擬人體胃腸道蠕動(dòng)時(shí)物理作用的體外動(dòng)態(tài)胃腸模型?，F(xiàn)階段，該類模型主要有3種，分別是荷蘭應(yīng)用科學(xué)研究組織 Minekus和 Havenaar[22]構(gòu)建的 TIM 模型(TNO intestinal model)、比利時(shí)根特大學(xué)Molly等[23]構(gòu)建的 SHIME模型 (Simulator of the human intestinal microbial ecosystem) 及馬德里自治大學(xué)Barroso等[24]構(gòu)建的SIMGI模型 (Simulator of the gastro-intestinal tract)。

TIM 模型是由 Minekus和 Havenaar[22]研制的，最初用于藥物活性的動(dòng)態(tài)測(cè)試，是一種基于多單元計(jì)算機(jī)控制的體外消化模擬系統(tǒng)，也是目前在食源性致病菌研究中應(yīng)用最廣泛、使用頻次最高的體外動(dòng)態(tài)胃腸模型系統(tǒng)。TIM 模型可以分為兩個(gè)部分：TIM1可用于模擬人體的胃、十二指腸、空腸、回腸以及結(jié)腸 (圖3)[25]。TIM2模型可模擬人體大腸 (橫結(jié)腸、升結(jié)腸、降結(jié)腸、盲腸)，如圖4所示，并增加了模擬腸道微生物的功能[26]。

TIM系統(tǒng)可通過pH電極、溫度及液位傳感器等實(shí)現(xiàn)對(duì)模擬室的監(jiān)控，并通過計(jì)算機(jī)程序控制對(duì)體內(nèi)胃腸環(huán)境的穩(wěn)定模擬，也可對(duì)處理樣品隨時(shí)抽樣。2014年，Miszczycha等[27]將大腸桿菌O26:H11和大腸桿菌O157:H7接種于生牛乳，并將其發(fā)酵制作為奶酪，隨后用 TIM1系統(tǒng)研究奶酪中的大腸桿菌在模擬消化過程中的存活率變化。發(fā)現(xiàn)大腸桿菌 O26:H11存活率比大腸桿菌O157:H7高12倍，同種屬菌株間對(duì)模擬消化液的耐受性存在巨大差異。TIM系統(tǒng)還可通過回波平面磁共振成像和腸道菌群宏基因組測(cè)序，對(duì)孕婦、兒童及老人等不同人群胃腸道環(huán)境進(jìn)行精準(zhǔn)模擬[8]。2016年，Roussel等[8]利用TIM1系統(tǒng)對(duì)兒童和成年人胃腸道中大腸桿菌O157:H7的存活率和毒力基因表達(dá)變化進(jìn)行模擬。雖然在傳統(tǒng)平板涂布進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)的方法中，大腸桿菌 O157:H7的存活率在兩種模擬模型中沒有明顯差異，但通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞活性并結(jié)合毒力基因表達(dá)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7在兒童模型中的致病能力顯著高于成年人模型。

圖3 TI M 1系統(tǒng)示意圖 (改自Verwei等[25])Fig. 3 The TIM-1 system (adapted from Verwei et al[25]). A: stomach; B: the compartments are connected by peristaltic valves controlling the gastric emptying; C:duodenum; D and F: intestinal transit; E: jejunum; G:ileum; I: simulated gastric secretion; J: duodenal secretion; K1 and K2: jejunum and ileum secretion; L:pre-filter; M: hollow fiber semi-permeable membrane; N:filtrate collection for analyzing bioaccessible API from jejunum (N1) and ileum (N2); P: pH electrode; Q:pressure sensor; R: temperature sensor (in each compartment); S: liquid level sensor; T: inlet.

SHIME系統(tǒng)是由Molly等[23]開發(fā)的由計(jì)算機(jī)控制的五步反應(yīng)器模擬人體胃腸道微生物生態(tài)系統(tǒng) (圖5)。SHIME模型包括胃、小腸、升結(jié)腸、橫結(jié)腸及降結(jié)腸五個(gè)反應(yīng)器，反應(yīng)器為雙夾層的玻璃罐，有 pH電極、液位及溫度傳感器，并由蠕動(dòng)泵實(shí)現(xiàn)混合液的轉(zhuǎn)移。該系統(tǒng)常用于研究食物成分與人體內(nèi)常駐微生物群落的相互作用[8]。SIMGI系統(tǒng)與SHIME系統(tǒng)很相似，也具有小腸、升結(jié)腸、模擬罐、橫結(jié)腸、降結(jié)腸五個(gè)反應(yīng)器，微生物菌群結(jié)構(gòu)也與SHIME系統(tǒng)基本一致。不同的是，SIMGI系統(tǒng)的胃部模擬裝置并不是用雙夾層的玻璃罐，而是由兩個(gè)丙烯酸甲酯制成的透明塑料模塊組成，并且利用覆蓋著水的硅膠模對(duì)胃內(nèi)容物的蠕動(dòng)進(jìn)行模擬，這種反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)在于可以減少機(jī)械力對(duì)食源性致病菌的損傷，更加符合真實(shí)環(huán)境，但SIMGI系統(tǒng)造價(jià)昂貴，目前仍處于系統(tǒng)測(cè)試階段，尚未投入應(yīng)用[24]。

圖4 TIM 2 系統(tǒng)示意圖 (改自Rehman等[26])Fig. 4 The TIM-2 system(adapted from Rehman et al[26]). A: peristaltic compartments containing fecal matter; B: pH electrode; C: alkali pump; D: dialysis liquid circuit with hollow fibre membrane; E: level sensor; F: N2 gas inlet; G: sampling port; H: gas outlet; I:ileal efflux; J: temperature sensor.

圖5 SHIME (SIMGI)系統(tǒng)示意圖 (改自Molly等[23]和Barroso等[24])Fig. 5 A schematic diagram of SHIME(SIMGI)system(adapted from Molly et al[23] and Barroso et al[24]).

2 體內(nèi)胃腸模型

盡管體外模擬胃腸模型已廣泛應(yīng)用于致病菌耐受性的研究，但人體真實(shí)胃腸道具有復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)、微生物群落及機(jī)體免疫等生物學(xué)特性，導(dǎo)致體外模型在研究致病菌致病機(jī)理中存在一定的局限性，需要運(yùn)用更符合人體生命特性的模型進(jìn)行研究。體內(nèi)胃腸道模型 (In-vivogastro-intestinal model)，也可稱為動(dòng)物模型 (Animal model)，通常利用遺傳背景明確的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行模型的構(gòu)建，并可對(duì)其組織、器官及所攜帶的微生物進(jìn)行“人源化”的處理[28]。

常用動(dòng)物模型包括嚙齒目、兔形目、靈長(zhǎng)目及偶蹄目等。由于靈長(zhǎng)目、偶蹄目和奇蹄目存在培育時(shí)間較長(zhǎng)、培育環(huán)境要求嚴(yán)格等困難，實(shí)驗(yàn)室用的動(dòng)物模型多為嚙齒目 (小鼠、大鼠、豚鼠)和兔形目 (兔、鼠兔)。1906年，Donaldson博士在 Wistar研究所建立了第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，迄今所使用的大鼠模型50%都屬于Wistar品系[29]。本文根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的不同特性，分為普通動(dòng)物模型和人源化動(dòng)物模型分別進(jìn)行綜述。

2.1 普通動(dòng)物模型

普通動(dòng)物模型 (Conventional animal model)廣義上是指來源清晰、背景明確且不經(jīng)過任何“人源化”處理的動(dòng)物模型。表2主要綜述了普通動(dòng)物模型在食源性致病菌致病機(jī)理研究中的應(yīng)用。以副溶血性弧菌致病機(jī)理研究為例，2012年Ritchie等[5]運(yùn)用新西蘭幼兔構(gòu)建了副溶血性弧菌感染的動(dòng)物模型，清晰地重現(xiàn)了該菌侵襲動(dòng)物胃腸道的全過程：該菌首先吸附在腸上皮絨毛表面形成細(xì)胞簇，通過持續(xù)消耗腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物，并對(duì)腸上皮細(xì)胞進(jìn)行擠壓，促使腸上皮細(xì)胞解體，造成幼兔的腸道組織水腫而導(dǎo)致水樣腹瀉。并通過基因敲除實(shí)驗(yàn)，在幼兔模型中進(jìn)一步證明了三型分泌系統(tǒng)是副溶血性弧菌最為重要的產(chǎn)毒器官。同年，Whitaker等[30]利用C57BL/6小鼠模型對(duì)副溶血性弧菌 ToxRS操縱子的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，ToxRS操縱子的調(diào)控是副溶血性弧菌致病力的關(guān)鍵因素，toxRS敲除的菌株不能在小鼠腸道中定植。2014年，Livny等[31]再一次運(yùn)用新西蘭幼兔模型分析了感染時(shí)副溶血性弧菌的轉(zhuǎn)錄組，從全基因組表達(dá)的角度進(jìn)一步研究了該菌的致病機(jī)理。

表2 不同食源性致病菌在普通動(dòng)物模型中的應(yīng)用Table 2 The application of the conventional animal model in different foodborne pathogens

2.2 人源化動(dòng)物模型

盡管普通動(dòng)物模型被視為食源性致病菌研究的可靠工具，但此類動(dòng)物模型與真實(shí)的人體仍舊存在不小的差異。首先，與真實(shí)人體相比，小鼠等普通動(dòng)物的腸道菌群僅有 4%的相似性[36]；第二，由于物種間的差異性，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫反應(yīng)與人類差距較大，由普通動(dòng)物模型中得到的結(jié)論不能直接推論于人體免疫系統(tǒng)[33]。因此，研究人員對(duì)普通動(dòng)物模型進(jìn)行了“人源化”改造，開發(fā)出了相應(yīng)的人源化菌群動(dòng)物模型和人源化免疫系統(tǒng)動(dòng)物模型。

2.2.1 人源化菌群動(dòng)物模型

人源化菌群動(dòng)物模型 (Human flora-associated animal model，HFAAM)，指的是在無菌動(dòng)物體內(nèi)接種人類糞便或腸道內(nèi)容物的菌懸液，使人類腸道微生物在動(dòng)物的胃腸道內(nèi)定植，從而構(gòu)建的腸道菌群“人源化”模型[37]。人源化菌群動(dòng)物模型可用于研究食源性致病菌與宿主腸道菌群間的相互作用關(guān)系，從而揭示食源性致病菌的致病機(jī)理、在腸道內(nèi)的定植作用，并提供可靠的治療方案。如2008年Barman等[38]用沙門氏菌感染人源化菌群的Fvb小鼠模型，發(fā)現(xiàn)感染后的小鼠腸道細(xì)菌總數(shù)下降，菌群組成發(fā)生改變，食源性致病菌與腸道菌群存在相互作用關(guān)系，可通過腸道菌群的調(diào)整，對(duì)食源性致病菌引起的疾病進(jìn)行治療。2010年Faure等[39]運(yùn)用人源化菌群的C3H大鼠模型，研究了沙門氏菌 CTX-M 耐藥基因的轉(zhuǎn)移，結(jié)果表明這一抗性基因可從沙門氏菌轉(zhuǎn)移到腸道菌群，增加了耐藥基因擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。2014年Ali等[40]運(yùn)用人源化菌群的C57BL/6小鼠構(gòu)建了沙門氏菌感染模型，發(fā)現(xiàn)果糖-天冬酰胺復(fù)合物對(duì)沙門氏菌的腸道定植起關(guān)鍵作用。2016年 Bian等[41]運(yùn)用人源化菌群的 BALB/c小鼠構(gòu)建大腸桿菌感染模型，研究了瑞士乳桿菌KLDS 1.8701和嗜酸乳桿菌KLDS AD1對(duì)大腸桿菌的致病作用，發(fā)現(xiàn)這兩株菌可通過調(diào)整小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，緩解大腸桿菌導(dǎo)致的腹瀉癥狀。

目前，最常用的人源化菌群動(dòng)物模型構(gòu)建方法是將糞便菌懸液接種于小鼠腸道，但是這種方法存在一定的缺陷，即并非所有的菌群都成功定植于小鼠腸道內(nèi)部，研究表明約有20%的菌群會(huì)在定植過程中發(fā)生種水平的變化[42]，使獲得模型不能準(zhǔn)確反映人體腸道菌群的真實(shí)情況，這將成為未來需要解決的一個(gè)重要科學(xué)問題。

2.2.2 人源化免疫系統(tǒng)動(dòng)物模型

人源化免疫系統(tǒng)動(dòng)物模型(Humanized immune system animal model)，一般通過人工敲除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫細(xì)胞，或?qū)?shí)驗(yàn)動(dòng)物的相關(guān)免疫基因進(jìn)行靶向失活，以獲得免疫缺陷的動(dòng)物，之后通過移植人類細(xì)胞、組織、器官或者基因，使普通動(dòng)物具有人體免疫應(yīng)答反應(yīng)。圖6以重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征 (Severe combined immun deficiency，SCID)的小鼠模型為例，介紹4種不同人源化免疫系統(tǒng)小鼠模型的構(gòu)建途徑。

如圖6所示，Hu-PBL-SCID模型是由Mosier等[44]在1988年構(gòu)建，將人外周血白細(xì)胞 (Peripheral blood leukocytes，PBL) 通過腹腔或靜脈注射的方式，植入SCID小鼠體內(nèi)，進(jìn)行模型的構(gòu)建，主要用于人類成熟免疫細(xì)胞功能的研究。Hu-SRCSCID模型由Lapidot等[45]于1992年構(gòu)建，從骨髓、臍帶血、胎肝及外周血造血干細(xì)胞中獲取人源造血干細(xì)胞 (Hematopoietic stem cell，HSC)，再經(jīng)皮下或靜脈注射入新生 SCID小鼠、或靜脈注射入成年 SCID小鼠體內(nèi)所構(gòu)建的模型，造血干細(xì)胞能夠在小鼠體內(nèi)分化發(fā)育出造血系統(tǒng)的各系細(xì)胞，移植后可以重建免疫缺陷小鼠的造血系統(tǒng)，使其具有人源化的造血功能。2007年，Shultz等[46]在 SCID小鼠的腎包膜下植入人類胎肝和胸腺，構(gòu)建了SCID-Hu模型，可用于人類免疫缺陷病毒HIV-1的研究，但由于該模型缺乏人類造血和免疫干細(xì)胞，因此所模擬的免疫系統(tǒng)并不完整。BLT模型 (Bone marrow，liver，thymus)綜合了上述各類模型的優(yōu)勢(shì)，由Shultz等[46]于2007年構(gòu)建，將人類胎肝和胸腺植入SCID小鼠的腎包膜下，同時(shí)靜脈注射入同源的胎肝干細(xì)胞，使得小鼠不僅擁有完整的人源化免疫系統(tǒng)，而且具備健全的人源化造血功能，是現(xiàn)階段較為可靠的人源化免疫/造血系統(tǒng)小鼠模型，具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖6 四種人源化免疫系統(tǒng)小鼠模型及其獲得途徑 (改自Brehm等[43])Fig. 6 Four humanized immune system mice models (adapted from Brehm et al[43]).

2012年，哥倫比亞大學(xué)的 Mathur等[6]通過Hu-PBL-SCID建立了首個(gè)鼠傷寒沙門氏菌感染的小鼠模型，研究了 Toll樣受體 11 (TOLL-like receptor 11，TLR11) 的免疫功能。TLR11在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞表面表達(dá)，能特異地識(shí)別病原相關(guān)的分子模式，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[47]。該研究構(gòu)建了TLR11受體缺乏小鼠模型，經(jīng)沙門氏菌感染可知，受體缺乏小鼠出現(xiàn)了傷寒癥狀，而在TLR11受體不缺乏小鼠感染實(shí)驗(yàn)中，TLR11能夠在小鼠胃腸道上皮細(xì)胞中大量表達(dá)，以抵御沙門氏菌的侵襲。這一類模型建立的意義重大，口服感染的人源化模型可以清晰地重現(xiàn)食源性致病菌真實(shí)的致病過程 (從口腔進(jìn)入胃腸道)，對(duì)于其致病機(jī)理的研究具有顯著的優(yōu)勢(shì)[6]。

表3 四種人工模擬胃腸道模型在食源性致病菌研究中的優(yōu)勢(shì)、劣勢(shì)及適用領(lǐng)域Table 3 The advantages, disadvantages and applications of four simulated gastro-intestinal models in studies of foodborne pathogens

3 總結(jié)與展望

體內(nèi)、外胃腸道模型在食源性致病菌耐受性和致病性的研究中具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，表3系統(tǒng)地總結(jié)了各模型在食源性致病菌研究應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)、缺陷及應(yīng)用領(lǐng)域。其中，體外靜態(tài)模型具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于致病菌耐受性及致病力的研究；但是，此類模型無法模擬胃腸道消化的動(dòng)態(tài)過程，使其與真實(shí)的消化過程相去甚遠(yuǎn)。體外動(dòng)態(tài)模型在體外靜態(tài)模型的基礎(chǔ)之上，結(jié)合計(jì)算機(jī)和蠕動(dòng)泵等設(shè)備，彌補(bǔ)了這一缺陷，并可針對(duì)不同人群進(jìn)行“個(gè)性化”模擬；但是，其仍缺乏腸道菌群及腸道組織結(jié)構(gòu)等，難以對(duì)人體胃腸道的生物過程進(jìn)行模擬。較體外模型而言，在動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建的模型，不僅可對(duì)致病菌的耐受性及致病力進(jìn)行研究，還可進(jìn)一步研究其致病機(jī)理及疫苗的開發(fā)。普通動(dòng)物模型可以較為真實(shí)地重現(xiàn)致病菌感染的全過程，但是與真實(shí)人體相比，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的消化與免疫應(yīng)答等反應(yīng)仍存在一定程度上的差距。人源化動(dòng)物模型可對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胃腸道或免疫系統(tǒng)進(jìn)行“人源化”模擬，雖然構(gòu)建過程相對(duì)艱難，但是一旦成功構(gòu)建，該類模型在食源性致病菌致病機(jī)理及疫苗開發(fā)的研究中具有獨(dú)一無二的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，盡管經(jīng)過了近一個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，體內(nèi)外胃腸道模型仍存在一定程度上的缺陷，需要進(jìn)一步完善，使其更加符合研究的需求。因此，本文從以下4個(gè)方面對(duì)未來人工模擬胃腸道模型的研究方向進(jìn)行了展望。

1) 開發(fā)更符合真實(shí)情況的體外胃腸道模型。體外胃腸模型具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、可實(shí)時(shí)監(jiān)控等優(yōu)勢(shì)，而且與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相比，此類模型不涉及倫理譴責(zé)問題。在食源性致病菌研究中的應(yīng)用前景十分廣闊，具有不可取代的地位。但現(xiàn)行各類體外胃腸模型尚缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，如果不同研究中所采用的模擬消化液配方不盡相同，構(gòu)成模擬消化液酶類的來源也有所差異，例如人源酶、豬源酶及牛源酶等，甚至消化液的 pH值也不盡相同，導(dǎo)致所獲得的結(jié)果不能進(jìn)行很好的比較歸類，難以進(jìn)行系統(tǒng)性研究[17-20]。因此，后續(xù)研究應(yīng)對(duì)體外胃腸系統(tǒng)模擬條件作進(jìn)一步修正，使此類模型更符合真實(shí)的情況，還可針對(duì)不同的人群，建立特異人群的胃腸道模型，同時(shí)開發(fā)更加簡(jiǎn)便的裝置和更加仿真的模型，使其更好地應(yīng)用于食源性致病菌的研究。

2) 綜合運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建新型人源化動(dòng)物模型?，F(xiàn)階段，人源化動(dòng)物模型已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的研究，由于此類模型能夠較好地模擬人體的腸道菌群或免疫系統(tǒng)，有助于重現(xiàn)致病菌在致病過程中的具體變化，以進(jìn)行致病菌致病機(jī)理與疫苗開發(fā)等方面的研究。但是，目前將人源化菌群動(dòng)物模型和人源化免疫系統(tǒng)動(dòng)物模型相結(jié)合的研究還相對(duì)較少。后續(xù)研究應(yīng)運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)理論，結(jié)合不斷發(fā)展的組學(xué)技術(shù)，構(gòu)建一種“1+1”的新型人源化動(dòng)物模型，即在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)腸道菌群、組織器官的同步人源化研究，充分結(jié)合并發(fā)揮這兩類模型的優(yōu)勢(shì)，從而對(duì)食源性致病菌的致病機(jī)理進(jìn)行更全面系統(tǒng)的研究，為疾病研究及人類健康作出貢獻(xiàn)。

3) 食源性致病菌在模擬胃腸道中耐受異質(zhì)性研究。研究表明，食源性致病菌存在菌株異質(zhì)性，指的是同種屬的不同菌株之間存在生長(zhǎng)、耐受、致病力等方面的差異[48-53]。但是，目前食源性致病菌在體內(nèi)外模擬胃腸道模型中的研究往往局限于單一菌株，并不能很好地代表所有菌株耐受及致病性的總體情況。菌株異質(zhì)性的存在，會(huì)對(duì)體內(nèi)外模型中致病菌耐受性及致病機(jī)理的研究結(jié)果造成影響。因此，應(yīng)運(yùn)用體內(nèi)外模型研究大量菌株的耐受性和致病力，總結(jié)其耐受異質(zhì)性及致病異質(zhì)性的規(guī)律，全面揭示其潛在的致病機(jī)制。

4) 綜合運(yùn)用體內(nèi)外模擬胃腸道模型服務(wù)于食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是一種科學(xué)可靠的工具，可用于評(píng)估食源性致病菌的致病風(fēng)險(xiǎn)，有效地控制食源性致病菌的潛在危害[1,54]。然而，傳統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型通常將“入口概率”直接視為“致病概率”，忽略了致病菌進(jìn)入人體之后的命運(yùn)變化[55]。食源性致病菌在體內(nèi)外模擬胃腸道中耐受及致病機(jī)理的研究，正好能夠彌補(bǔ)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的這一不足，對(duì)提升風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的準(zhǔn)確性具有非常重要的意義。此外，目前國(guó)內(nèi)外微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中均在使用美國(guó) FDA所建立的劑量-反應(yīng)模型[56]，該模型不僅年代久遠(yuǎn)較為陳舊，而且不一定符合所有人種的身體情況，因此，可綜合運(yùn)用體內(nèi)外模擬胃腸道模型，研究更符合實(shí)際的情況“劑量-反應(yīng)”關(guān)系，以構(gòu)建更加全面系統(tǒng)的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系。

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