光交聯(lián)技術(shù)的生物應(yīng)用研究進展

孫 瑞，高銀佳，史海斌

(蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部放射醫(yī)學(xué)與防護學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)與輻射防護國家重點實驗室 江蘇省高校放射醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州 215123)

1 引 言

光化學(xué)反應(yīng)又稱光化作用，一般是指物質(zhì)在可見光或紫外線照射下，物質(zhì)分子吸收光子后所引發(fā)的化學(xué)反應(yīng)。目前能激活物質(zhì)分子的光源種類繁多，如紅外光、可見光、紫外光、激光等。紫外光一般對光化學(xué)反應(yīng)最為有效；紅外光由于能量低，只能引起分子化學(xué)鍵的振動擾動，很難引發(fā)化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生；而可見光常常被用作光化學(xué)反應(yīng)的引發(fā)劑，通常是以光敏劑作為媒介，間接地將光能轉(zhuǎn)移到一些可見光不敏感的反應(yīng)中去，進而引起光化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生?？傊?，光介導(dǎo)的化學(xué)反應(yīng)具有操作簡單、反應(yīng)速度快、副產(chǎn)物少等優(yōu)點，符合綠色化學(xué)的要求，受到光化學(xué)研究者們的廣泛青睞[1]。

光交聯(lián)是光化學(xué)反應(yīng)中目前應(yīng)用最為廣泛的一種反應(yīng)。光交聯(lián)反應(yīng)(也稱作光親和標(biāo)記，Photoaffinity labeling,PAL)是指將合成的光敏小分子化合物作為工具探針，在特定波長的光照射下，產(chǎn)生高活性的中間體，與其受體活性部位形成特異性的不可逆共價鍵結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)。早在1962年，Westheimer等人[2]首先提出光親和標(biāo)記技術(shù)，至今該技術(shù)已取得令人矚目的發(fā)展[3-5]。由于光交聯(lián)反應(yīng)具有速度快、條件簡單、適合于原位反應(yīng)等優(yōu)點，最早主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾和藥物靶標(biāo)蛋白甄別。之后，光交聯(lián)反應(yīng)逐漸被應(yīng)用于研究蛋白與小分子、生物大分子、蛋白或受體間的相互作用。目前該技術(shù)已經(jīng)成為生物化學(xué)家和分子生物學(xué)家研究生物體系中空間相鄰組分及生物大分子間相互作用的一個重要工具。近年來，隨著光學(xué)技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，光交聯(lián)技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于化學(xué)、生物、材料和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[6-11]。

2 光交聯(lián)反應(yīng)基團及其作用機制

常見的光交聯(lián)基團根據(jù)其在光照射下生成活性中間體的不同，大致分為四類：氮賓(Nitrenes)類、卡賓(Carbenes)類、碳正離子(Carbocations)和自由基(Radicals)類(如圖1)[12]。目前應(yīng)用最為廣泛的光交聯(lián)基團有苯甲酮、疊氮苯和3-三氟甲基-3-苯基二吖丙啶(3-trifluoromethyl-3-phenyldiazir ine，TFMD)。通常理想的光交聯(lián)基團應(yīng)具備以下幾個特征：(1)具有一定的化學(xué)穩(wěn)定性，耐受普通的化學(xué)反應(yīng)；(2)在自然光中具有合理的穩(wěn)定性；(3)黑暗中穩(wěn)定，在不對樣品造成損傷(>300 nm)的紫外光照下很容易光解；(4)光解后的活性中間體既能與親核的X-H(X=N,S,O)官能團反應(yīng)，也能與C-H官能團反應(yīng)；(5)光解中間體與受體作用得到的產(chǎn)物應(yīng)該比較穩(wěn)定，能夠耐受分離、純化和分析等操作。

圖1 光交聯(lián)反應(yīng)基團分類[12]Fig.1 Commonly used photolabeling reactive species[12]

2.1 氮賓(Nitrenes)類

芳香疊氮化合物是最常見的產(chǎn)生氮賓(Nitrenes)類前體的化合物，也是較常用的光交聯(lián)基團。它的光化學(xué)反應(yīng)機理為：分子在外來光照射下，芳環(huán)上的疊氮基團會首先形成單線激發(fā)態(tài)，然后釋放出氮氣生成氮賓。氮賓可以是單線態(tài)的中間體，也可以經(jīng)系間竄越形成三線態(tài)中間體。單線態(tài)氮賓可以對C-H鍵或者X-H鍵(X = O, N, S)進行插入反應(yīng)形成共價鍵結(jié)合的產(chǎn)物，也可以重排為1-氮雜-2-4-6-環(huán)庚四烯(didehydrozaepine)或者通過系間竄越形成三線態(tài)中間體。三線態(tài)中間體以自由基形式吸收質(zhì)子氫生成氨基化合物或形成偶聯(lián)產(chǎn)物[13]。因此，單線態(tài)氮賓具有親電子活性，是發(fā)揮交聯(lián)作用的主要形式。但是，單線態(tài)氮賓只能夠穩(wěn)定存在約100 μs，隨后將迅速重排生成比較穩(wěn)定的烯亞胺，這種烯亞胺分子的反應(yīng)活性較弱，只能與親核性官能團反應(yīng)(如O-H、N-H、S-H等)[14]。如果活性位點部分沒有親核性官能團，那就可能遷移到離活性位點較遠區(qū)域交聯(lián)，產(chǎn)生非特異性交聯(lián)。

2.2 卡賓(Carbenes)類

卡賓類分為重氮化合物和雙吖丙啶類化合物。重氮化合物與疊氮化合物類似，在紫外光的照射下，重氮基團釋放一個N2分子，形成卡賓中間體，隨后進攻鄰近的C-H鍵，生成一個新的共價鍵。該卡賓中間體也會進行Wolff重排，形成烯酮，烯酮再與親核試劑反應(yīng)，產(chǎn)生非特異性交聯(lián)。雙吖丙啶基團在黑暗中具有良好的穩(wěn)定性，同時具有較好的光交聯(lián)活性。其反應(yīng)機理：在350 nm或365 nm紫外光的照射下，雙吖丙啶基團首先發(fā)生共價鍵斷裂，釋放出一分子N2，隨后鍵電子重排，形成活性的卡賓中間體，插入到鄰近的C-H鍵或者其他雜原子與H的共價鍵中，生成新的共價鍵。這里形成的卡賓中間體半衰期一般在ns級，交聯(lián)反應(yīng)非常迅速[15]。

2.3 碳正離子(Carbocations)

除了氮賓類和卡賓類基團外，碳正離子也是具有高活性的光交聯(lián)基團[16]。芳香重氮鹽化合物就是常用的碳正離子前體。首先，芳香重氮鹽化合物在紫外光照射下，釋放N2形成高活性的芳香正離子中間體，隨后插入到鄰近的C-H鍵或者其他雜原子與H的共價鍵中，形成新的共價鍵。由于芳香重氮鹽化合物上重氮的吸電子性使其在通常條件下非常不穩(wěn)定，一些研究中通過在芳香環(huán)上引入供電子基團來改善化合物的穩(wěn)定性[17]。

2.4 自由基(Radicals)類

自由基是光交聯(lián)反應(yīng)中另一類非常重要的高活性中間體。苯甲酮類化合物是生成自由基的一類常用的、高效的光交聯(lián)反應(yīng)化合物。在紫外光的照射下，苯甲酮基團能夠產(chǎn)生活性三線態(tài)雙自由基，自由基分子不發(fā)生重排反應(yīng)，會與周圍的C-H鍵發(fā)生反應(yīng)。如果其周圍沒有適當(dāng)?shù)腃-H鍵存在，雙自由基能夠穩(wěn)定存在120 μs，最后回復(fù)到初始狀態(tài)，等待再次被激活[18]。此外，苯甲酮產(chǎn)生的活性三線態(tài)雙自由基在質(zhì)子性溶劑中穩(wěn)定[19]，幾乎不與水反應(yīng)，其標(biāo)記效率較高，對于光交聯(lián)標(biāo)記實驗非常有用。

3 應(yīng) 用

3.1 藥物靶標(biāo)鑒別

圖2 光交聯(lián)探針標(biāo)記蛋白質(zhì)示意圖 Fig.2 Schematic diagram of protein labeling by photo-crosslinking probes

蛋白質(zhì)是細胞功能的主要執(zhí)行者，藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)過程大多歸結(jié)為篩選與藥物分子相互作用的蛋白質(zhì)，并以此為線索對相關(guān)的信號通路進行分析。此外，正常生理代謝的中間體或細胞內(nèi)的其它生物大分子也可能是藥物潛在的作用靶標(biāo)，可能參與了藥物的代謝過程或應(yīng)急信號的傳導(dǎo)。因此，從廣義上講，藥物靶標(biāo)不僅包括直接與藥物作用的蛋白質(zhì)，還包括藥物分子引發(fā)的細胞內(nèi)信號響應(yīng)分子[20]，這些藥物分子靶標(biāo)的甄別不但有利于臨床觀察藥物代謝過程，而且也為相關(guān)疾病治療開拓出廣闊的研究空間。近年來，光交聯(lián)分子探針捕獲目標(biāo)蛋白方法在藥物靶標(biāo)甄別和信號通路研究方面得到不斷發(fā)展[21-22]，在很多重大疾病相關(guān)的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。通常是將小分子藥物與光交聯(lián)基團連接，或者直接通過一定長度的連接劑固定到樹脂基質(zhì)上構(gòu)成具有純化標(biāo)簽的探針。該光交聯(lián)探針一般包含活性部位、光交聯(lián)基團、連接部位及報告基團。最常見的光交聯(lián)基團有苯甲酮、疊氮苯和3-三氟甲基-3-苯基二吖丙啶等。常用的報告基團也可稱為標(biāo)簽(tag)如熒光素(fluorescence)和生物素(Biotin)等。熒光素由于其高靈敏性，可用于定量檢測標(biāo)記蛋白，生物素可以用來富集、純化或鑒別被標(biāo)記蛋白，該方法可稱為一步標(biāo)記法(如圖2)。近年來，無報告基團光交聯(lián)分子探針被報道用于藥物靶標(biāo)的兩步標(biāo)記[23]。報告基團(熒光素或生物素)是在探針分子共價標(biāo)記了靶蛋白之后，通過點擊化環(huán)加成反應(yīng)連接到分子探針上(如圖2)，這樣可以使光交聯(lián)分子探針盡可能的小，有利于保持分子探針對靶蛋白的標(biāo)記能力和生物活性[24]。

光交聯(lián)技術(shù)作為一種高效的工具被廣泛地應(yīng)用于藥物靶標(biāo)甄別。1994年，Schwanstecher等[25]以降糖藥物氯磺環(huán)己脲(Glibenclamide)為模板化合物，設(shè)計合成了一種光交聯(lián)分子探針3a(如圖3)，通過光標(biāo)記實驗，發(fā)現(xiàn)其受體是一個38 kD大小的蛋白，且還與一個160～175 kD的蛋白緊密作用。依替米貝(Ezetimibe)是一種有效的膽固醇吸收抑制劑，主要用來降低膽固醇。Frick等人[26]基于依替米貝結(jié)構(gòu)母體，設(shè)計和合成了含生物素報告基團的光交聯(lián)分子探針3b。通過光標(biāo)記和質(zhì)譜鑒定實驗，發(fā)現(xiàn)受體蛋白是一個145 kD的膜蛋白。通過對蛋白進行提純、測序和克隆，進一步研究了其對腸道膽固醇的吸收機制。此外，SIRT2屬于Sirtuins蛋白-依賴NAD+的去乙?；讣易澹洚惓５拿富钚耘c很多疾病如癌癥和神經(jīng)退行性疾病息息相關(guān)[27]。Seifert等[28]構(gòu)建了一種光敏感的SIR2抑制劑衍生物3c，通過光交聯(lián)反應(yīng)研究了其與SIRT2的結(jié)合位點，利用質(zhì)譜技術(shù)分析確定了被標(biāo)記的多肽片段I175-K210序列，運用MS-MS技術(shù)對多肽片段進一步確認，同時證實其標(biāo)記的是H-187氨基酸殘基。

圖3 3種光交聯(lián)分子探針:3a[25]、3b[26]和3c[28] Fig.3 Three kinds of photo-crosslinking probes:3a[25], 3b[26]and 3c[28]

近年來，Yao課題組利用光交聯(lián)技術(shù)在藥物篩選和靶標(biāo)蛋白甄別方面開展了大量的開創(chuàng)性研究工作。Liu等人[29]設(shè)計和合成了一系列Plasmepsins (PMs)特異性識別和結(jié)合的小分子熒光探針。通過光交聯(lián)技術(shù)，他們利用該探針不但能夠?qū)Ms進行體外特異性標(biāo)記，而且還可以在瘧原蟲體內(nèi)篩選PMs的高效抑制劑，發(fā)現(xiàn)了一個對PM-I、PM-II、PM-IV和HAP均顯示出較好抑制作用的抑制劑G16。該策略首次實現(xiàn)了瘧原蟲內(nèi)PMs抑制劑的快速、高效篩選，為抗瘧疾藥物研發(fā)提供了重要的篩選手段(如圖4)。在阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease，AD)治療藥物篩選和靶點分析方面，Shi等人[30]策略性設(shè)計并合成了198個γ-分泌酶小分子抑制劑，利用微陣列技術(shù)對這些化合物進行了快速篩選，發(fā)現(xiàn)數(shù)個γ-分泌酶抑制劑。經(jīng)過對抑制劑F5和F24的結(jié)構(gòu)進一步改造成為光交聯(lián)型分子探針，成功開展了中國倉鼠卵巢細胞裂解液中γ-分泌酶的標(biāo)記和鑒別。此外，2012年，Shi等人[31-32]通過對白血病藥物達沙替尼(Dasatinib)和星形孢菌素(Staurosporine)藥物主體進行策略性修飾，構(gòu)建了包含光交聯(lián)劑和末端炔烴的分子探針DA-1、DA-2和STS-1(如圖5)。利用光交聯(lián)技術(shù)和點擊化學(xué)反應(yīng)開展了細胞內(nèi)藥物靶標(biāo)蛋白的成像、分離與鑒別研究。一些傳統(tǒng)手段無法鑒別到的新激酶靶標(biāo)蛋白被首次鑒別為該些藥物的潛在靶標(biāo)，為臨床藥物的毒副作用研究及新藥研發(fā)提供了重要的參考手段。然而，前述探針由于尺寸較大，一定程度上影響靶標(biāo)蛋白與探針的相互作用。Yao課題組最近研發(fā)了一系列集光交聯(lián)基團與生物正交基團于一體的小型光交聯(lián)劑，利用光交聯(lián)技術(shù)和生物正交反應(yīng)開展了大量抑制劑-蛋白和蛋白-蛋白間相互作用研究，大大提高了藥物靶標(biāo)蛋白甄別的準(zhǔn)確性(如圖6)[33-35]。

圖4 (a)光交聯(lián)分子探針G的分子結(jié)構(gòu)；(b)篩選分析和確定G15和G16的IC50值；(c)寄生感染血紅細胞與抑制劑G15和G16共孵育后細胞成像圖片[29] Fig.4 (a)Structure of the probe G. (b)In situ screening assay and determination of the IC50 values of G15 and G16. (c)Representative images of parasite-infected RBCs treated with G15 and G16[29]

圖5 (a)利用光交聯(lián)分子探針研究達沙替尼和星形孢菌素的靶標(biāo)蛋白示意圖；(b)光交聯(lián)分子探針DA-1和DA-2的分子結(jié)構(gòu)[31]；(c)光交聯(lián)分子探針STS-1的分子結(jié)構(gòu)[32] Fig.5 (a)Overall strategy of proteome profiling of potential cellular targets of dasatinib and staurosporine using photo-crosslinking probes. Structure of the probe(b) DA-1,DA-2[31] and (c)STS-1[32]

圖6 利用光交聯(lián)技術(shù)和生物正交反應(yīng)標(biāo)記蛋白質(zhì)示意圖[33-35] Fig.6 Photo-crosslinking probe labeling strategies using photo-crosslinkers and bioorthogonal handles[33-35]

3.2 生物分子標(biāo)記

光交聯(lián)技術(shù)應(yīng)用于生物大分子之間的相互作用研究已近50年，被認為是目前最有效且多樣化的技術(shù)之一。由于光交聯(lián)反應(yīng)迅速，條件簡單，適合于原位反應(yīng)等特點，已經(jīng)成為生物化學(xué)家和分子生物學(xué)家研究生物體系中空間鄰近組分及生物大分子之間相互作用的重要工具。利用生物體自身的生物合成作用有效地將具備光交聯(lián)活性的底物類似物同化到生物大分子中，從而研究生物大分子之間的作用模式和作用機制。目前報道的底物類似物主要包括氨基酸、糖類和核苷等類似物[36-38]，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

Kohler課題組應(yīng)用光交聯(lián)糖類似物在聚糖介導(dǎo)作用機制方面開展了大量研究。他們用雙吖丙啶基團對N-乙酰氨基甘露糖(ManNAc)和唾液酸的C5位進行修飾，合成得到相應(yīng)的光交聯(lián)糖類化合物ManNDAz和SiaDAz[39](如圖7)。這兩種光交聯(lián)糖類似物都能被細胞正常吸收，對細胞表面的糖蛋白進行標(biāo)記，獲得具備光交聯(lián)活性的糖蛋白。當(dāng)這些具有光交聯(lián)活性的糖蛋白與其他生物大分子相互作用后，經(jīng)紫外光照射，即可將相互作用的生物大分子捕獲。此外，他們還應(yīng)用SiaDAz成功地對神經(jīng)節(jié)苷脂1(Ganglioside1,GM1)上的唾液酸殘基進行了標(biāo)記[40]。GM1能夠在包內(nèi)識別并結(jié)合霍亂毒素B亞基(Cholera toxin B subunit,CTxB)，在紫外光照射下，捕獲GM1-CTxB復(fù)合物。

圖7 3種光交聯(lián)底物類似物:ManNDAz,SiaDAz[39]和pBpa[41] Fig.7 Three types of photo-crosslinking substrate analogue:ManNDAz, SiaDAz[39] and pBpa[41]

光交聯(lián)苯丙氨酸類似物也可用于蛋白質(zhì)間相互作用的界面研究。Yu等人[41]利用生物自身合成作用，將光交聯(lián)苯丙氨酸類似物pBpa(如圖7)引入到大腸桿菌蛋白位移酶亞基(SecA)中，以研究它的二聚化現(xiàn)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SecA N端的2-11位氨基酸、263位的苯丙氨酸、794位的酪氨酸以及805位的精氨酸均位于二聚體的界面上。

圖8 光交聯(lián)分子探針DiZSek標(biāo)記策略[43] Fig.8 Scheme of bait and prey protein via DiZSek[43]

Chen課題組基于光交聯(lián)基團雙吖丙啶，相繼開發(fā)了三代用于鑒定活細胞內(nèi)蛋白-蛋白相互作用的光交聯(lián)探針。2011年，他們開發(fā)了第一代光交聯(lián)探針DiZPK，并用其鑒定了極酸環(huán)境下大腸桿菌抗酸伴侶蛋白HdeA的“客戶”蛋白[42]。由于第一代光交聯(lián)探針的下游處理步驟采用了傳統(tǒng)的“親和”純化方法，不可避免地引入了非特異性吸附蛋白和非直接相互作用的蛋白，另外，利用DiZPK獲得的交聯(lián)肽段難以通過傳統(tǒng)的質(zhì)譜分析方法進行解析，常常會丟失蛋白質(zhì)相互作用的界面信息。2014年，他們開發(fā)出第二代可切割的光交聯(lián)探針DiZSeK[43]。該探針在光交聯(lián)后實現(xiàn)底物蛋白與誘餌蛋白的分離(如圖8)，在一定程度上降低了鑒定背景。但該探針仍無法解決交聯(lián)肽段和交聯(lián)位點的鑒定問題。2016年，他們又開發(fā)了一種基因編碼并具有“質(zhì)譜標(biāo)簽”轉(zhuǎn)移功能的第三代光交聯(lián)探針DiZHSeC[44]。該探針不僅可以實現(xiàn)交聯(lián)后底物蛋白與誘餌蛋白的分離，同時通過“質(zhì)譜標(biāo)簽”，可以很容易地在質(zhì)譜結(jié)果中區(qū)分底物與非特異性吸附以及非直接相互作用的多肽片段。此外，通過使用常規(guī)的質(zhì)譜分析軟件對交聯(lián)位點進行鑒定，很容易獲得蛋白質(zhì)相互作用界面的信息。

光交聯(lián)技術(shù)也為鑒定一些難以俘獲的受體提供了一個方便可行的解決方案。Yan等人[45]通過在乙型肝炎病毒包膜蛋白的前導(dǎo)肽中引入帶有光交聯(lián)基團diazirine的亮氨酸，經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)和純化后，發(fā)現(xiàn)鈉-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運多肽能夠與該段前導(dǎo)肽發(fā)生相互作用。后續(xù)的研究也進一步證實了鈉-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運多肽是乙型肝炎病毒與丁型肝炎病毒的功能性受體。光交聯(lián)技術(shù)也被用于研究DNA/RNA-蛋白質(zhì)及核酸分子間的相互作用。He課題組以光交聯(lián)基團雙吖丙啶為基礎(chǔ)，構(gòu)建了一系列針對DNA鑒定的探針(如圖9(a))。他們將這些探針應(yīng)用在DNA結(jié)合蛋白EcoDam(E. coli DNA adenine methyltransferase)和一種由207個氨基酸組成的DNA修復(fù)蛋白酶(Human O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase,hAGT)上，光交聯(lián)后，通過SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)這些DNA探針具有良好的交聯(lián)反應(yīng)效率，可以很好地應(yīng)用于DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用研究，尤其適合于有一定位阻的底物[46]。該方法對DNA/RNA-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建研究和鑒定有著重要的意義。在DNA-DNA相互作用研究方面，他們使用光交聯(lián)基團3-三氟甲基-3-苯基二吖丙啶，設(shè)計合成了光交聯(lián)核苷類似物DBN(如圖9(b))。通過寡核苷酸固相合成法，將光交聯(lián)核苷類似物引入到相應(yīng)的DNA序列中，隨后與單鏈DNA鏈間配對后紫外光照射，形成光交聯(lián)產(chǎn)物，經(jīng)過PAGE提純和MALDI-TOF MS的鑒定，發(fā)現(xiàn)光交聯(lián)核苷類似物與胞嘧啶(Cytosine，C)配對交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)率最高[47]。同樣策略，Nakamoto和Ueno使用類似光交聯(lián)核苷類似物，構(gòu)建了micro-RNA探針，通過micro-RNA堿基互補配對的方式，在紫外光照射下，可以識別捕獲潛在的靶基因[48]?？梢?，光交聯(lián)核苷類似物的設(shè)計為研究核酸分子間的相互作用提供了技術(shù)支持，對研究DNA/RNA參與的剪切、運轉(zhuǎn)、編輯、包內(nèi)定位及翻譯調(diào)控等過程具有重大意義。

圖9 (a)光交聯(lián)DNA分子探針構(gòu)建及其蛋白標(biāo)記[46]； (b)光交聯(lián)核苷類似物DBN標(biāo)記[47] Fig.9 (a)Development of DNA probe with diazirine and the diazirine-modified DNA to bind proreins[46]; (b)Diazirine-based nucleoside analogue(DBN, B) can form a DNA interstrand cross-link upon UV irradiation[47]

3.3 材料修飾與功能化

隨著材料科學(xué)的飛速發(fā)展，光交聯(lián)反應(yīng)由于具有簡單、方便、環(huán)境友好等特點，近年來被廣泛地應(yīng)用于材料的表面修飾與功能化研究。無機納米材料具有獨特的表面性質(zhì)，要提高其穩(wěn)定性，一般需要對納米顆粒表面進行修飾，同時納米顆粒表面修飾還能賦予材料新的特殊功能。

2004年，Yan課題組利用全氟疊氮苯光交聯(lián)基團，在硅片表面通過N-H/C-H插入反應(yīng)修飾上了聚合物薄膜，增加了硅片的韌性、可加工性、介電性等性能[49]。2006年，他們在此基礎(chǔ)上，通過進一步控制硅片表面全氟疊氮苯光交聯(lián)基團的數(shù)量和表面修飾聚合物的種類，研究了其對硅片表面性質(zhì)產(chǎn)生的不同影響，為其它材料光交聯(lián)表面修飾提供了新的思路與參考[50]。2011年，該課題組設(shè)計并制備了一系列不同脂肪鏈修飾的全氟疊氮苯光交聯(lián)化合物，并用之對石墨稀進行了表面修飾，獲得了不同表面性能的石墨烯，使其具有更為廣泛的用途[51]。2015年，他們將二氧化硅納米顆粒和金納米顆粒表面先引入全氟疊氮苯光交聯(lián)基團，然后與石墨烯進行光交聯(lián)作用，分別形成石墨烯/二氧化硅和石墨烯/金的復(fù)合材料, 發(fā)展了制備復(fù)合材料的一種新的便捷方法[52]。

圖10 (a)利用3-三氟甲基-3-苯基二吖丙啶功能化修飾碳納米管[54]和(b)金剛石[55]；(c)光交聯(lián)磷鹽分子構(gòu)建疏水性涂料[56] Fig.10 (a)Functionalization of carbon nanotubes[54] and (b)micro-diamond using 3-trifluoromethyl-3-phenyldiazirine[55]; (c)diazirine modified specific phosphonium salts to prepare robust hydrophobic coatings[56]

Workentin課題組將光交聯(lián)基團3-三氟甲基-3-苯基二吖丙啶引入到金納米顆粒表面[53]，通過光交聯(lián)反應(yīng)，對金納米顆粒進行了簡單、快速的表面修飾。利用相同的方法，還對碳納米管和金剛石進行了表面光交聯(lián)修飾，制備了碳納米管/金和金剛石/金復(fù)合材料(如圖10(a)和10(b))[54-55]。2012年，他們將3-三氟甲基-3-苯基二吖丙啶與氟化鹽結(jié)合，設(shè)計了一個新的疏水性光交聯(lián)分子，利用光交聯(lián)反應(yīng)，將之共價鍵修飾到棉布和紙的表面，大大改善了棉布和紙的疏水性(如圖10(c))[56]。2015年，他們將3-三氟甲基-3-苯基二吖丙啶與端基為巰基的三甘醇結(jié)合，設(shè)計并合成了兩親性的光交聯(lián)分子，利用巰基的置換反應(yīng)，將兩親性的光交聯(lián)分子引入到金納米顆粒上，構(gòu)建了可以在水相和有機相進行金納米顆粒表面修飾的模板[57]，通過在水相或者有機相對金納米顆粒表面修飾不同的化合物，來改善金納米顆粒在催化、生物、傳感器等領(lǐng)域的應(yīng)用。

2017年，Shi課題組首次在異硫氰酸熒光素分子上引入光交聯(lián)基團雙吖丙啶，構(gòu)建了一個發(fā)綠色熒光的光交聯(lián)探針。將該探針與粒徑約為80 nm的二氧化硅納米顆粒混合，經(jīng)紫外光(365 nm)照射，快速制備得到了發(fā)綠光的二氧化硅納米顆粒(見圖11)[58]。該熒光二氧化硅納米顆粒具有良好的熒光穩(wěn)定性，不但能夠用于小鼠乳腺癌細胞成像，而且可以示蹤二氧化硅納米顆粒在小鼠乳腺癌細胞內(nèi)的內(nèi)吞行為。該策略為快速、便捷制備發(fā)光納米顆?；蚣{米功能化提供了一種有效的新手段。

圖11 光交聯(lián)熒光分子探針標(biāo)記二氧化硅納米顆粒[58] Fig.1 Schematic illustration of light-triggered fluorescent labeling of silica nanoparticles[58]

圖12 (a)光誘導(dǎo)金納米顆粒自組裝；(b)老鼠腫瘤部位光聲成像及對應(yīng)光聲信號值；(c)光熱治療圖片[62] Fig.12 (a)Schematic illustration of light-triggered assembly of gold nanoparticles; (b)photoacustic imaging and quantifed photoacustic signal and (c)photothermal therapy of the tumorous sites of mice[62]

3.4 腫瘤診療研究

光熱治療作為一種局部高溫?zé)釟⑺滥[瘤細胞的新療法，與傳統(tǒng)治療手段相比具有微創(chuàng)、副作用小、輔助殺菌等優(yōu)勢[59]。目前金納米材料是最具臨床應(yīng)用潛力的材料之一[60-61]。研究發(fā)現(xiàn)納米顆粒一般主要通過EPR(Enhanced Permeability and Retention)效應(yīng)在腫瘤部位富集，即使修飾了靶向分子或配體，其腫瘤富集效果仍然不佳，原因主要有：第一，納米顆粒容易被網(wǎng)狀上皮系統(tǒng)俘獲；第二，納米顆粒在體內(nèi)被快速代謝或清除出腫瘤。因此，實現(xiàn)納米材料在腫瘤部位高效聚集，是提高腫瘤診療效果的主要途徑之一。Shi課題組最近報道了一種光介導(dǎo)金納米顆粒在體可控聚集技術(shù)[62]。通過將光交聯(lián)基團雙吖丙啶(Diazirine)修飾于金納米顆粒(～20.5 nm)表面，在405 nm激光的照射下，金納米顆?？梢栽谀[瘤部位發(fā)生光交聯(lián)自組裝，同時，由于聚集后的金納米顆粒尺寸較大，極大地延長了金納米顆粒在腫瘤部位的滯留時間(如圖12)。由于聚集后的金納米顆粒在近紅外區(qū)域表現(xiàn)出較強的吸收，利用該特性成功地開展了腫瘤的光聲成像與光熱治療研究，為提高腫瘤診療效果提供了一個新的策略和手段。Coyne等人[63]通過在抗腫瘤藥物表柔比星上引入光交聯(lián)基團雙吖吡啶，在紫外光照射下，將藥物與乳腺癌HER2抗體(Human epidermal growth factor receptor-2)共價鍵交聯(lián)，改善了表柔比星載體的生物相容性、血藥濃度維持時間及腫瘤靶向效果，進一步提高了藥物的治療效果。

4 結(jié)束語

光交聯(lián)技術(shù)由于其簡便、快捷、高效和時空可控等優(yōu)勢目前被廣泛地應(yīng)用于藥物篩選、靶標(biāo)蛋白甄別和生物大分子間作用等研究。隨著納米材料和技術(shù)的飛速發(fā)展，光交聯(lián)技術(shù)近年來從分子生物學(xué)領(lǐng)域逐漸拓展到了納米材料和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。然而，由于目前光交聯(lián)反應(yīng)源主要以紫外光為主，其穿透力淺，組織損害等問題一定程度上限制了該技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的深入應(yīng)用。如何克服前述問題，使用近紅外或遠紅外觸發(fā)交聯(lián)反應(yīng)將是一種新的思路，但由于目前對近紅外或遠紅外光敏感的化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)報道較少，發(fā)掘該類化學(xué)反應(yīng)對于合成化學(xué)家將是一大挑戰(zhàn)?？傊嘈挪痪玫膶砉饨宦?lián)技術(shù)一定會在化學(xué)、生物、材料和醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域有著更為廣泛的應(yīng)用前景。

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