熒光碳量子點(diǎn)的制備與生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究進(jìn)展

郭振振，唐玉國，孟凡渝，李 力，楊大威

(中國科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所 生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215163)

1 引 言

近年來，碳基納米材料，如碳納米管[1-2]、石墨烯[3-5]、富勒烯[6-7]以及納米金剛石[8-9]備受人們的關(guān)注。然而，納米金剛石制備、分離方法難度大；石墨烯和碳納米管水溶性差，在可見光區(qū)域難以提供較強(qiáng)的熒光，這些都大大限制了它們的應(yīng)用。碳基量子點(diǎn)是一類新型零維碳基納米材料，主要包括石墨烯量子點(diǎn)和碳量子點(diǎn)兩類。截至目前，研究人員在碳量子點(diǎn)的合成及應(yīng)用方面做了許多工作并取得了重要進(jìn)展[10]。

石墨烯量子點(diǎn)擁有石墨烯晶格，通常具有10層以內(nèi)的石墨結(jié)構(gòu)[11]，是優(yōu)秀的電子供體和受體[12]，被廣泛應(yīng)用于光電檢測(cè)和太陽能電池。石墨烯量子點(diǎn)作為一種優(yōu)異的導(dǎo)電材料在電化學(xué)生物傳感器制造方面也有重要應(yīng)用；層數(shù)較少的石墨烯量子點(diǎn)具有類似碳量子點(diǎn)的熒光特性。此外，控制石墨烯的層數(shù)有助于石墨烯量子點(diǎn)向碳量子點(diǎn)轉(zhuǎn)變[13]。碳量子點(diǎn)是一類直徑小于10 nm的類球形碳納米顆粒。核磁共振測(cè)試結(jié)果證實(shí)：碳量子點(diǎn)的內(nèi)部主要由sp2雜化的碳原子組成，外部由sp3雜化的碳原子組成[14]。與宏觀黑色、難溶碳材料相比，碳量子點(diǎn)因表面富含豐富的親水基團(tuán)而具有良好的水溶性。碳量子點(diǎn)最吸引人的是它的熒光特性。此外，碳量子點(diǎn)與電子受體或供體發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移會(huì)導(dǎo)致熒光猝滅[15]。與商業(yè)染料和傳統(tǒng)半導(dǎo)體量子點(diǎn)[16]相比，碳量子點(diǎn)有許多優(yōu)點(diǎn)，例如：在可見光區(qū)域有較強(qiáng)的熒光，良好的水溶性，較低的毒性，耐光漂白，易于合成，表面容易修飾，等等。因此，碳量子點(diǎn)一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便成為明星納米材料，在生物傳感[17-18]、生物成像[19-21]、藥物傳遞[21-23]等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。

本文介紹了碳量子點(diǎn)的合成及性質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行了深入討論，概述了一些典型的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用案例。我們希望通過研究并了解其性能和機(jī)理，為將來潛在的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供參考。

2 碳量子點(diǎn)的合成

目前，碳量子點(diǎn)的合成方法眾多。研究人員仍在尋找簡單、廉價(jià)、尺寸可控、易于大規(guī)模制備高質(zhì)量碳量子點(diǎn)的方法。根據(jù)碳源到最終產(chǎn)物變化性質(zhì)的不同，合成方法可分為物理方法和化學(xué)方法。根據(jù)原料和產(chǎn)物的關(guān)系，可概括為自上而下法和自下而上法。

2.1 自上而下法

自上而下法制備碳量子點(diǎn)主要是指采用物理或化學(xué)手段把大塊碳材料切割成小的納米顆粒，如切割碳納米管、石墨棒、石墨烯、碳粉等。主要包括電化學(xué)法、化學(xué)氧化法、激光銷蝕法等方法。

2.1.1 電化學(xué)法

電化學(xué)法的優(yōu)點(diǎn)是成本低、易操作[24-27]。碳納米管和石墨是制備電極的理想材料[28-32]，因此常用作電化學(xué)法的碳源。Zhou等人[33]發(fā)明了一種將多壁碳納米管轉(zhuǎn)化為碳量子點(diǎn)的方法。將濃度為0.1 M的四丁基高氯酸銨的乙腈溶液經(jīng)脫氣處理后作為電解液，表面沉積碳納米管的碳紙制成工作電極，Pt絲為對(duì)電極，Ag/AgClO4為參比電極，施加一個(gè)循環(huán)電壓，溶液由無色逐漸變?yōu)辄S色，最終變?yōu)樯詈稚?，紫外燈照射后發(fā)出藍(lán)色熒光，表明碳量子點(diǎn)的形成。為了得到不經(jīng)任何分離過程而尺寸均一的碳量子點(diǎn)，Bao等人[34]發(fā)展了一種可調(diào)節(jié)系統(tǒng)用于電化學(xué)刻蝕碳纖維。通過簡單調(diào)節(jié)工作電極的電壓，便可得到無需純化，尺寸可控的碳量子點(diǎn)。另外，Shinde等人[35]也采用電化學(xué)方法合成了尺寸可控的碳量子點(diǎn)，在90 ℃、LiClO4的碳酸丙二酯溶液中，以多壁碳納米管為原料，電化學(xué)合成了尺寸為3、5、8.2 nm的碳量子點(diǎn)。這種方法是在無水環(huán)境中進(jìn)行，并且不需要任何分子封端劑，方法簡單，易于分離。

2.1.2 化學(xué)氧化法

化學(xué)氧化法在大規(guī)模制備目標(biāo)物中，是一種簡單、高效的方法。Sun等人[36]將干凈的頭發(fā)加入到濃H2SO4溶液中，分別在40、100、140 ℃情況下加熱24 h。溶液顏色由無色逐漸變?yōu)樽厣?，表明S和N共摻雜的碳量子點(diǎn)的形成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，S和N是以不同的形式束縛在納米粒子骨架中。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，納米粒子的平均直徑、量子產(chǎn)率、元素成分以及光學(xué)性質(zhì)也相應(yīng)地改變。Qiao等人[37]運(yùn)用直接化學(xué)氧化法制備了具有生物相容性的碳量子點(diǎn)。他們選取了3種具有代表性的商業(yè)活性炭(分別由煤塊、木頭、椰殼活化而成)作為碳源，經(jīng)過硝酸刻蝕，比較容易的得到了碳量子點(diǎn)。最后，氨終端的化合物被用于鈍化碳量子點(diǎn)。最終由3種碳源衍生的碳量子點(diǎn)具有相似的窄的尺寸分布，同時(shí)具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射。

2.1.3 激光銷蝕法

激光銷蝕法合成碳量子點(diǎn)主要是利用激光的高溫高壓對(duì)碳靶進(jìn)行刻蝕。Sun等人[38]通過熱處理石墨粉和水泥的混合物制備了碳靶，然后在氬氣水蒸氣氣氛、900 ℃和75 kPa條件下，通過激光刻蝕碳靶制備了沒有熒光的碳納米粒子。隨后在硝酸溶液中回流，再用聚乙二醇(PEG1500N)或者聚丙乙烯亞胺-聚乙烯亞胺(PPEI-EI)進(jìn)行鈍化，得到了尺寸約5 nm的具有強(qiáng)熒光性能的碳量子點(diǎn)。此外，Hu等人[39]創(chuàng)造性的開發(fā)了一種一步法激光銷蝕合成碳量子點(diǎn)的方法。他們運(yùn)用激光照射懸浮在有機(jī)溶劑中的石墨粉，碳量子點(diǎn)的形成與表面修飾過程同時(shí)完成，通過選擇合適的溶劑，合成了具有不同熒光特性的碳量子點(diǎn)，測(cè)試結(jié)果表明熒光來源于碳量子點(diǎn)表面的羧基配體。

2.2 自下而上法

自下而上法是把有機(jī)前驅(qū)體作為種子在一定條件下生長形成碳量子點(diǎn)。微波、直接加熱及超聲波是常見的能使分子能量聚集和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的能量來源方式。碳源的選擇多種多樣，葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、氨基酸甚至食物殘?jiān)勺鳛樘荚粗苽涮剂孔狱c(diǎn)。

2.2.1 微波輔助合成法

微波是一種具有較寬波長范圍的電磁波，從1 mm到1 m，被廣泛應(yīng)用到日常生活和科學(xué)研究中。與激光類似，微波可以提供較高的能量來破壞物質(zhì)的化學(xué)鍵。微波反應(yīng)是一種高效合成碳量子點(diǎn)的方法，可以大大縮短反應(yīng)時(shí)間。一般微波輔助合成包括碳源的熱解和表面功能化過程[40-41]。

Wang等人[42]以雞蛋殼薄膜灰為原料，首次通過微波輔助法合成了碳量子點(diǎn)(圖1)。雞蛋殼薄膜是一種富含蛋白質(zhì)的生活廢棄物，廉價(jià)易得。微波反應(yīng)時(shí)，雞蛋殼薄膜灰中的電子在切換電場(chǎng)下劇烈旋轉(zhuǎn)、振動(dòng)，許多微小的碎片脫落、聚集、生長成一定尺寸的顆粒。之后，在堿性高溫條件下，顆粒進(jìn)一步氧化、鈍化，最終得到性能優(yōu)異的碳量子點(diǎn)。這種方法成本低廉、資源節(jié)約、環(huán)境友好、利于推廣。

圖1 微波輔助合成CDs的示意圖[42] Fig.1 Schematic way of a microwave-assisted process to form carbon nanodots[42]

2.2.2 熱解法

熱解法常用于合成不同的半導(dǎo)體和磁性納米材料。研究表明，在高溫條件下通過熱解或者碳化含碳的前驅(qū)體同樣可以制備碳量子點(diǎn)。這種方法通常需要高濃度的堿或酸將含碳的前驅(qū)體裂解成納米級(jí)粒子。所用的碳源來源廣泛，西瓜皮、柚子皮、橘子汁、抗壞血酸和殼聚糖都可作為碳源。通過改變反應(yīng)參數(shù)，比如，反應(yīng)溫度、回流時(shí)間以及混合物的pH就可以達(dá)到優(yōu)化碳量子點(diǎn)光學(xué)性能的目的。

Wang等人[43]將碳的前驅(qū)體(如檸檬酸)注入熱的非配位溶劑十八烯中，合成了油溶性的碳量子點(diǎn)，量子產(chǎn)率高達(dá)53%，可以保持至少2個(gè)月穩(wěn)定不變。Liu等人[14]報(bào)道了一種利用蠟燭燃燒產(chǎn)生的煙灰制備碳量子點(diǎn)的方法。將燃燒得到的煙灰與氧化性酸(硝酸)反應(yīng)，使碳量子點(diǎn)表面引入-OH和-COOH基團(tuán)，顆粒分散性及水溶性得到改善，再經(jīng)離心、透析處理，得到了具有多色熒光發(fā)射的碳量子點(diǎn)。Zhu等人[44]以檸檬酸和乙二胺為原料，兩者先形成聚合物狀碳量子點(diǎn)，再經(jīng)碳化形成碳量子點(diǎn)。反應(yīng)包括離子化、脫水、聚合、碳化等過程。

2.2.3 超聲合成法

超聲可以使液體的內(nèi)部產(chǎn)生交替的高壓、低壓環(huán)境，這種空化作用具有較高的能量，既可以粉碎較大顆粒的碳源，又可以促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行。在一定頻率的超聲輻射下，有機(jī)分子經(jīng)過脫水、聚合、碳化，最終可得到碳量子點(diǎn)。2011年，Li等人[45]以葡萄糖為原料，超聲法一步合成碳量子點(diǎn)。Park等人[46]報(bào)道一種綠色大規(guī)模制備碳量子點(diǎn)的方法，以廢棄食物為原料、在室溫和40 kHz超聲。經(jīng)過脫水、聚合、碳化成核、核表面生長等過程，最終從100 kg廢棄食物中得到了120 g碳量子點(diǎn)。

2.2.4 其它方法

最近，Deng等人[47]用乙醇為原料，采用電化學(xué)法合成了碳量子點(diǎn)。與傳統(tǒng)的電化學(xué)法切割機(jī)理不同，這種方法得到的碳量子點(diǎn)更加無序，形狀更不規(guī)則，表明這完全是一種新的路線，其中的機(jī)理尚不清楚，仍需要進(jìn)一步探究。在堿性條件下，小分子醇類電化學(xué)法碳化合成的碳量子點(diǎn)具有較好的激發(fā)波長以及尺寸依賴性。Miao等人[48]在堿性環(huán)境下，以乙醇為碳源，采用電化學(xué)氧化法一步合成了性能優(yōu)異的碳量子點(diǎn)并成功用于Fe3+的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)原理如圖2所示。

圖2 電化學(xué)法合成碳量子點(diǎn)示意圖，灰星代表生成的碳量子點(diǎn)[48] Fig.2 Scheme of the electrochemical synthesis of carbon nanodots. Gray stars stand for the generated carbon nanodots[48]

2.3 表面修飾

熱解法、化學(xué)氧化法等方法制備的量子點(diǎn)一般沒有熒光或熒光量子產(chǎn)率很低，這就限制了碳量子點(diǎn)的進(jìn)一步應(yīng)用。為了獲得熒光穩(wěn)定及量子產(chǎn)率高的碳量子點(diǎn)，對(duì)其表面進(jìn)行修飾是非常必要的。表面修飾對(duì)碳量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)影響很大，是碳量子點(diǎn)實(shí)現(xiàn)功能化常用的手段。在修飾過程中，一些官能團(tuán)(氨基、羥基和羧基)被引入到碳量子點(diǎn)的表面，使其具有更好的水溶性以及化學(xué)活性。Sun等人[38]首次采用PEG1500N對(duì)無熒光的碳量子點(diǎn)進(jìn)行了修飾，修飾后熒光發(fā)射明顯，這主要是因?yàn)楸砻驸g化彌補(bǔ)了表面缺陷，使碳量子點(diǎn)表面能量陷阱的熒光發(fā)射趨于穩(wěn)定。之后，各種生物大分子或功能小分子被連接到碳量子點(diǎn)表面，以此提高分析檢測(cè)或生物成像的特異性。

3 物理化學(xué)性質(zhì)

碳量子點(diǎn)通常由C、H、N、O等元素組成。其中C、O因碳量子點(diǎn)含有豐富的羥基、羧基基團(tuán)而含量較高。這些基團(tuán)不僅使其具有良好的水溶性，而且為進(jìn)一步功能化提供了可能。表征碳量子點(diǎn)的手段很多，可以提供碳量子點(diǎn)的詳細(xì)信息。圖3是一步微波法合成的碳量子點(diǎn)的TEM、XRD、Raman光譜以及FTIR光譜數(shù)據(jù)[49]。從TEM圖可得到碳量子點(diǎn)的粒徑信息，尺寸約3 nm。XRD數(shù)據(jù)顯示有兩個(gè)寬峰，是高度無序碳原子的特征峰，與石墨的晶格間距相近。Raman光譜中，1 575 cm-1處的G帶是sp2雜化碳的平面振動(dòng)峰，1 365 cm-1處的D帶與sp3缺陷有關(guān)。ID/IG=0.86，表明碳量子點(diǎn)的石墨化程度很高。FTIR數(shù)據(jù)可以得到碳量子點(diǎn)表面官能團(tuán)信息。1 350～1 460 cm-1、1 600～1 770cm-1和3 100～3 500cm-1處的寬吸收帶分別歸屬于δ(CH2)、ν(C=O)和νκ(O-H)/ν(N-H)的振動(dòng)峰。

3.1 吸收及熒光性質(zhì)

碳量子點(diǎn)的發(fā)射峰窄而對(duì)稱，連續(xù)分布，重疊小，在可檢測(cè)到的光譜范圍內(nèi)同時(shí)使用多個(gè)探針，發(fā)射光譜也不會(huì)出現(xiàn)交疊，使生物分子的多組分分析檢測(cè)變得容易。而傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料的發(fā)射峰不僅寬，而且不對(duì)稱，拖尾嚴(yán)重，互相重疊嚴(yán)重，容易互相干擾，給分析檢測(cè)帶來困難。

碳量子點(diǎn)通常在紫外區(qū)域中有明顯的吸收峰，吸收帶260～320 nm。經(jīng)過表面鈍化后，吸收峰可能會(huì)紅移。激發(fā)波長依賴性或獨(dú)立性是碳量子點(diǎn)熒光發(fā)射最具吸引力的特性之一，這與核和表面態(tài)相關(guān)的發(fā)射有關(guān)[50]。到目前為止，碳量子點(diǎn)的熒光機(jī)理尚未完全清楚。Zhao等人[51]的研究表明碳量子點(diǎn)對(duì)激發(fā)波長依賴性的特點(diǎn)是由碳量子點(diǎn)尺寸不同造成的。在不同激發(fā)波長下，不同發(fā)射位點(diǎn)獲激而發(fā)射熒光，這也是碳量子點(diǎn)熒光發(fā)射具有波長依賴性的原因[52]。

圖3 碳量子點(diǎn)的(a)TEM圖，(b)XRD圖，(c)拉曼光譜，(d)紅外光譜圖[49] Fig.3 (a)TEM image, (b)XRD patterns, (c)Raman spectrum, and (d)FTIR spectrum of the carbon nanodots[49]

量子產(chǎn)率(QY)是表征物質(zhì)熒光性質(zhì)的重要參數(shù)[53]。據(jù)報(bào)道，裸的碳量子點(diǎn)顯示出多色熒光發(fā)射的特點(diǎn)。然而，這種碳量子點(diǎn)的QY通常非常低。為了提高QY，研究人員已嘗試了多種方法，例如：鈍化[54]，摻雜其它元素[55]等。Sun等人[38]利用氨封端的低聚物PEG(PEG1500N)或(聚丙酰亞乙基亞胺-共-乙烯亞胺)(PPEI-EI)對(duì)碳量子點(diǎn)進(jìn)行功能化。結(jié)果碳量子點(diǎn)發(fā)出明亮的熒光(QY：4%～10%)。一些小組[56-57]提出了用NaBH4處理碳量子點(diǎn)來提高QY的方法。另外，通過調(diào)整合成路線，發(fā)射光范圍可以實(shí)現(xiàn)從可見到近紅外(NIR)光譜范圍。NIR具有較強(qiáng)的組織穿透能力，因此，碳量子點(diǎn)的NIR熒光發(fā)射特別適合于生物樣品的成像。此外，碳量子點(diǎn)的熒光可以被電子受體或供體淬滅。光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移特性使碳量子點(diǎn)在能量轉(zhuǎn)換中有了新的應(yīng)用。

3.2 化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光

電化學(xué)發(fā)光(ECL)技術(shù)由于靈敏度高，設(shè)備簡單，線性范圍寬，廣泛用于量子點(diǎn)的研究。由于碳量子點(diǎn)的ECL行為與量子點(diǎn)的ECL類似，碳量子點(diǎn)的ECL發(fā)射應(yīng)用不斷增多。Ding小組[60]在堿性條件下，碳量子點(diǎn)表面上還原硝酸銀制備了銀-碳量子點(diǎn)復(fù)合材料。該復(fù)合材料可利用ECL發(fā)射作為輸出信號(hào)用于生物傳感。納米復(fù)合材料表面上的銀元素可以選擇性地與目標(biāo)S2-離子相互作用，從而極大地影響碳量子點(diǎn)的ECL性能。

3.3 上轉(zhuǎn)換光致發(fā)光(UCPL)

短波長光激發(fā)，發(fā)射出長波長的熒光，這種現(xiàn)象符合斯托克斯定律。而UCPL是指用長波長光激發(fā)，發(fā)射出的熒光波長較短，這種現(xiàn)象違反了斯托克斯定律，稱為反斯托克斯位移。這主要?dú)w因于多光子激發(fā)過程，在這個(gè)過程中，兩個(gè)或多個(gè)光子被同時(shí)吸收，導(dǎo)致發(fā)射出比激發(fā)波長更短的熒光。Li等人[24]以石墨棒為工作電極，電化學(xué)法制備出了碳量子點(diǎn)，當(dāng)激發(fā)波長為500～1 000 nm時(shí)，發(fā)射峰為325～425 nm，表現(xiàn)出明顯的上轉(zhuǎn)換熒光特性。Sun課題組[61]在制備碳量子點(diǎn)的過程中摻雜了氧化鋅和硫化鋅，獲得的碳量子點(diǎn)具有上轉(zhuǎn)換熒光特性，800 nm激發(fā)下，發(fā)射出綠色熒光。

3.4 類過氧化物酶活性

研究發(fā)現(xiàn)，碳量子點(diǎn)與鉑納米顆粒和Fe3O4納米顆粒類似，也具有類過氧化物酶活性[62]，在H2O2存在下可以用于催化氧化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。Shi等人[63]在比色傳感器中利用該特性產(chǎn)生的顏色變化檢測(cè)葡萄糖。

3.5 毒性

長期以來，許多研究小組對(duì)碳量子點(diǎn)的毒性進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)。Ray等人[64]使用MTT和臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定法評(píng)估碳量子點(diǎn)處理后的細(xì)胞活性。當(dāng)碳量子點(diǎn)濃度高達(dá)0.5 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率仍可達(dá)到75%，這表明毒性作用有限。Song等人[65]比較了未改性的CdTe量子點(diǎn)、金納米粒子以及碳量子點(diǎn)對(duì)生物系統(tǒng)(如細(xì)胞和綠色豆芽)的毒性效應(yīng)，結(jié)果表明，碳量子點(diǎn)是三者中毒性最小最具生物相容性的材料。

4 生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

4.1 生物傳感

碳量子點(diǎn)優(yōu)異的熒光性質(zhì)被廣泛用于各種目標(biāo)物的熒光分析檢測(cè)，如各種金屬離子、陰離子、葡萄糖、H2O2和生物大分子(如蛋白質(zhì))。

汞離子(Hg2+)是一種重金屬離子，會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染[66]。離子積聚在器官和組織中會(huì)導(dǎo)致多種疾病。Hou等人[67]以檸檬酸鈉和尿素為原料制備的碳量子點(diǎn)，可以對(duì)Hg2+選擇性淬滅，檢測(cè)限可達(dá)3.3 nM。錫離子(Sn2+)是另一種重金屬離子，也會(huì)對(duì)環(huán)境和人體造成危害。Yazid等人[68]報(bào)道了通過淬滅從西米淀粉脫水得到的碳量子點(diǎn)來檢測(cè)Sn2+的生物傳感器。Fe3+和碳量子點(diǎn)形成的復(fù)合物會(huì)導(dǎo)致較強(qiáng)的熒光猝滅，可以以此檢測(cè)Fe3+。Zhao等人[69]開發(fā)了另一種以碳量子點(diǎn)作為化學(xué)發(fā)光探針用于Fe3+檢測(cè)的生物傳感器。Fe3+作為氧化劑會(huì)使多胺功能化的碳量子點(diǎn)空穴增多，導(dǎo)致碳量子點(diǎn)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)顯著增強(qiáng)。

過氧化氫(H2O2)是參與細(xì)胞增殖，信號(hào)傳導(dǎo)，衰老和死亡的最穩(wěn)定的活性氧(ROS)之一[70-71]。然而，過量的H2O2會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。Liu等人[72]通過使用碳量子點(diǎn)催化的銀納米顆粒(AgNPs)實(shí)現(xiàn)了非酶檢測(cè)H2O2。研究發(fā)現(xiàn)，氮摻雜的碳量子點(diǎn)具有還原性，可催化還原Ag+形成復(fù)合材料，與普通AgNPs相比，其還原H2O2的催化活性更好。制備的納米復(fù)合材料可用于靈敏地檢測(cè)H2O2，檢測(cè)限達(dá)到了0.5 μM。

水溶性脂族伯胺主要由氨基酸和蛋白質(zhì)降解而來，廣泛存在于環(huán)境中。由于它們是辛辣的刺激性氣體，可能會(huì)對(duì)人體皮膚、眼睛等造成傷害。Lin小組[73]發(fā)現(xiàn)，碳量子點(diǎn)能夠極大提高過氧硫酸氫鉀-亞硫酸鈉-鹽酸(PSHA)反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。這種現(xiàn)象源于該系統(tǒng)的能量轉(zhuǎn)移和電子傳遞湮滅效應(yīng)，可用作脂族伯胺的檢測(cè)器(圖4)。

圖4 基于碳量子點(diǎn)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理圖[73] Fig.4 Possible CL reaction mechanisms enhanced by carbon nanodots[73]

圖5 碳量子點(diǎn)用于夾心式凝血酶檢測(cè)[77] Fig.5 Schematic representation of the sandwich-based thrombin detection using carbon nanodots[77]

適配體是一種以強(qiáng)親和力靶向不同分析物的單鏈DNA或RNA[74-76]。Xu等人[77]開發(fā)了一種用于凝血酶檢測(cè)的適體傳感器(圖5)。凝血酶是特異性絲氨酸內(nèi)切蛋白酶，是病理過程中的關(guān)鍵酶。它含有多個(gè)適配體結(jié)合位點(diǎn)。文中設(shè)計(jì)了兩種氨基修飾的凝血酶適體，分別在二氧化硅納米顆粒和碳量子點(diǎn)上進(jìn)行了改性。兩者都可以通過形成分子內(nèi)G-四鏈體來識(shí)別凝血酶。在0至100 nM有較好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為1 nM。

金納米顆粒(AuNPs)是一類應(yīng)用廣泛的貴金屬納米材料[78-82]，碳量子點(diǎn)和AuNPs之間會(huì)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，導(dǎo)致熒光猝滅。Qaddare等人[83]利用這一原理用于超靈敏檢測(cè)HIV。如圖6所示，在實(shí)驗(yàn)中，表面連有ssDNA探針的碳量子點(diǎn)與AuNPs發(fā)生FRET，熒光發(fā)生猝滅。當(dāng)加入目標(biāo)ssDNA后，AuNPs與探針ssDNA分離，AuNPs暴露出來，熒光得到恢復(fù)。

圖6 碳量子點(diǎn)用于DNA檢測(cè)。由組氨酸碳化得到的碳量子點(diǎn)被探針ssDNA包裹后加入AuNPs，發(fā)生熒光猝滅。目標(biāo)ssDNA存在時(shí)，熒光恢復(fù)[83] Fig.6 DNA detection of carbon nanodots/AuNPs. The PL of carbon nanodots, prepared upon the carbonization of histidine and further coated with probe ssDNA is quenched upon addition of AuNPs. The fluorescence can be recovered in the presence of target ssDNA[83]

4.2 生物成像

熒光顯微鏡的分辨率，靈敏度和通用性主要取決于熒光探針的性質(zhì)。因此，選擇合適的探針對(duì)于生物成像是十分重要的。碳量子點(diǎn)是理想的材料，有很多優(yōu)勢(shì)。首先，碳量子點(diǎn)具有低毒性和低副作用，適用于生物系統(tǒng)。第二，高穩(wěn)定性和明亮的熒光，在實(shí)驗(yàn)中只需要少量的碳量子點(diǎn)來產(chǎn)生信號(hào)。第三，優(yōu)良的水溶性，避免了對(duì)其復(fù)雜的表面改性。第四，具有近紅外發(fā)射特性，是深層組織樣品成像的理想材料。

Na等人[84]制備的碳量子點(diǎn)在450 nm處發(fā)出明亮的熒光，用于凝膠上的人血清蛋白成像。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后，用乙酸稀釋的碳量子點(diǎn)溶液直接孵育染色蛋白質(zhì)。該方法提供了簡單的染色步驟，背景干擾小，分辨率高，是一種可靠的蛋白成像方法。

Zhu等人[85]制備了雙光子“turn-on”熒光探針，用于活細(xì)胞和組織中的硫化氫成像。由于碳量子點(diǎn)具有大的雙光子吸收截面，因此，碳量子點(diǎn)被作為熒光團(tuán)。它們能夠被AE-TPEA-Cu2+復(fù)合物(AE-TPEA=N-(2-氨基乙基)-N，N，N′-三(吡啶-2-基甲基)乙烷-1,2-二胺)淬滅。然而，H2S和Cu2+之間的相互作用，從TPEA結(jié)合位點(diǎn)釋放出Cu2+，消除了淬滅效應(yīng)。檢測(cè)限低至0.7 μM，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞和組織中H2S的“turn-on”雙光子熒光成像。

Hsu等人[86]做了碳量子點(diǎn)用于LLC-PK1細(xì)胞成像的實(shí)驗(yàn)，觀察到了綠色熒光，發(fā)現(xiàn)碳量子點(diǎn)可能通過內(nèi)吞作用內(nèi)化到細(xì)胞中。同時(shí)，高的細(xì)胞存活率也證實(shí)了材料的低毒性。

為了進(jìn)一步減輕高濃度納米材料的細(xì)胞毒性，Chandra等人[87]將碳量子點(diǎn)嵌入在PEG基質(zhì)中以降低由納米材料產(chǎn)生的活性氧。此外，PEG鈍化過程并不影響碳量子點(diǎn)的尺寸，并且碳量子點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)也保持不變。孵育4 h并內(nèi)吞入細(xì)胞后，可以觀察到來自細(xì)胞質(zhì)的強(qiáng)熒光。

目前，研究人員在目標(biāo)成像方面已經(jīng)做了許多工作。Song等人[88]將葉酸與碳量子點(diǎn)結(jié)合，用于區(qū)分葉酸-受體-陽性癌細(xì)胞與正常細(xì)胞。碳量子點(diǎn)的受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用提供了更準(zhǔn)確和更具選擇性的癌癥診斷方法。

在最近的研究中，兩親性的碳量子點(diǎn)被應(yīng)用到多色細(xì)胞成像中[89]。長鏈烴修飾的碳量子點(diǎn)摻入脂質(zhì)囊泡，隨后通過內(nèi)吞途徑進(jìn)行細(xì)胞。圖7描繪了共聚焦熒光顯微成像，證明CDs成功地內(nèi)化到細(xì)胞中，它們均勻的分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等細(xì)胞環(huán)境中。

圖7 兩親性碳量子點(diǎn)應(yīng)用于細(xì)胞成像。(a)是中國倉鼠卵巢上皮細(xì)胞明場(chǎng)圖，(b)、(c)、(d)分別是405、488、561 nm激發(fā)下的共聚焦熒光顯微成像圖[89] Fig.7 Amphiphilic carbon nanodots employed in cell imaging. Bright-feld image(a) and confocal fluorescence microscopy images of epithelial Chinese hamster ovary(CHO) cells incubated with amphiphilic C-dots. The confocal fluorescence microscopy images were recorded at excitation of 405 nm(b), 488 nm(c) and 561 nm(d)[89]

4.3 藥物遞送

目前，碳量子點(diǎn)作為裝載和釋放藥物的多功能載體的應(yīng)用已有一些報(bào)道[90-91]。優(yōu)點(diǎn)：快速的細(xì)胞攝取、優(yōu)異的生物相容性、明亮的熒光、高的化學(xué)穩(wěn)定性和對(duì)藥物活性的較小影響。

He等人[92]成功將碳量子點(diǎn)封裝在金屬-有機(jī)骨架的亞類沸石咪唑化合物框架中，通過改變碳量子點(diǎn)和前體的濃度來優(yōu)化納米復(fù)合材料的熒光性能和尺寸，然后將其作為pH響應(yīng)藥物5-氟尿嘧啶的載體，運(yùn)載到癌細(xì)胞。在中性和酸性環(huán)境中可觀察到不同的釋放效率。該藥物的藥理活性也被證明是令人滿意的，同時(shí)表明了碳量子點(diǎn)這種納米材料在生物醫(yī)學(xué)傳遞平臺(tái)中的潛在用途。

Tang等人[93]開發(fā)了基于FRET的碳量子點(diǎn)藥物遞送系統(tǒng)。碳量子點(diǎn)作為FRET的供體，同時(shí)也攜帶藥物。由于供體與受體之間的距離顯著影響FRET信號(hào)，因此可以實(shí)時(shí)靈敏地監(jiān)測(cè)碳量子點(diǎn)中阿霉素等藥物的釋放情況[94]。此外，65～300 μm深度的腫瘤組織的雙光子成像結(jié)果顯示，此藥物傳遞系統(tǒng)有望提高成像的靈敏度和治療效果。

最近，Gao等人[95]報(bào)道了聚乙烯亞胺修飾的碳量子點(diǎn)(P-CD)與透明質(zhì)酸共軛的阿霉素(HA-Dox)通過靜電自組裝形成P-CDs/HA-Dox復(fù)合物用于質(zhì)酸酶的檢測(cè)、自身靶向成像和藥物遞送。如圖8所示，在生理環(huán)境中表現(xiàn)為弱發(fā)射。通過利用透明質(zhì)酸對(duì)CD44受體(一種細(xì)胞膜糖蛋白)的高親和力在許多癌細(xì)胞過表達(dá)，P-CD / HA-Dox能夠靶向滲入癌細(xì)胞，隨后被透明質(zhì)酸酶激活。結(jié)果，HA-Dox被消化成許多小片段，導(dǎo)致Dox的釋放，從而恢復(fù)P-CD的熒光。

圖8 PEI-CDs / HA-Dox的形成和用于靶向癌細(xì)胞成像和藥物遞送的納米探針的示意圖[95] Fig.8 Schematic illustration of the formation of PEI-CDs/HA-Dox, and the nanoprobe used for targeted cancer cell imaging and drug delivery[95]

5 總結(jié)與展望

在這篇綜述中，我們回顧了碳量子點(diǎn)的最新研究進(jìn)展，重點(diǎn)是其合成、功能化、光學(xué)性能和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。目前，研究人員已經(jīng)做了很多努力，并取得了一定進(jìn)展。各種溫和的合成方法廣泛應(yīng)用于碳量子點(diǎn)的制備中。然而，合成具有精確原子結(jié)構(gòu)的碳量子點(diǎn)仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。精確的原子結(jié)構(gòu)有助于明確碳量子點(diǎn)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)之間的關(guān)系以及熒光產(chǎn)生的機(jī)理并對(duì)下一步的應(yīng)用產(chǎn)生指導(dǎo)意義。此外，文獻(xiàn)報(bào)道的多是發(fā)射藍(lán)色及綠色熒光的碳量子點(diǎn)，對(duì)單純發(fā)射紅色熒光的報(bào)道相對(duì)較少且量子產(chǎn)率普遍不高。而長波長的熒光不僅具有更強(qiáng)的組織穿透能力，還可減少來自自體熒光的干擾，更有利于生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。因此，合成高量子產(chǎn)率的紅色熒光、近紅外一區(qū)甚至近紅外二區(qū)的碳量子點(diǎn)將是未來研究的一個(gè)方向。另外，碳量子點(diǎn)的低毒性得到了許多實(shí)驗(yàn)的證明，但是對(duì)碳量子點(diǎn)的降解和累積的抗性可能導(dǎo)致的代謝紊亂研究不足。因此，體內(nèi)應(yīng)用可能需要更深入的研究。最后，合成中的形成機(jī)理和關(guān)鍵因素尚未完全了解，尺寸均一、性能可控的碳量子點(diǎn)的制備還需進(jìn)一步探索。對(duì)碳量子點(diǎn)性能的研究以及對(duì)新的合成和表面改性方法的開發(fā)可以擴(kuò)大碳量子點(diǎn)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其中在生物傳感，生物成像，藥物傳遞和治療方面的意義重大。

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