光纖生物傳感器在HER3抗體藥物定量檢測中的應(yīng)用

史健松，于源華，王美嬌，吳再輝，石 鑫，張 昊，宮 平，嵇曉強(qiáng)*

(1.長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130022；2.長春理工大學(xué) 光電信息學(xué)院，吉林 長春 130114)

1 引 言

生物分子相互作用研究是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重大問題之一[1]。生物分子的親和性檢測是指通過實(shí)時(shí)監(jiān)測其相互作用過程，獲得分子間是否發(fā)生作用，作用強(qiáng)度等信息，得到分子間相互作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并進(jìn)行定性及定量的分析，是一種在分子水平闡明生物分子之間或分子與其他物質(zhì)間相互作用本質(zhì)，揭示微觀生命活動(dòng)規(guī)律的重要方法。該方法具有檢測時(shí)間短，測量準(zhǔn)確、精度高、成本低廉等特點(diǎn)，對(duì)生物醫(yī)學(xué)標(biāo)記物、核酸、蛋白質(zhì)、病毒、細(xì)菌及毒素的檢測、藥物作用機(jī)理的研究、臨床用藥篩選等方面有著廣泛的應(yīng)用[2-4]，是目前檢測領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。

目前，生物分子親和性動(dòng)態(tài)檢測技術(shù)主要有表面等離子體共振技術(shù)(SPR)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)和光干涉生物傳感檢測技術(shù)(RIfS)等新型檢測方法[5]。其中表面等離子體共振技術(shù)(SPR)是一種光學(xué)物理現(xiàn)象。當(dāng)一束偏振光在一定的角度范圍內(nèi)入射到棱鏡端面，在棱鏡與金屬薄膜(Au或Ag)的界面將產(chǎn)生表面等離子波。當(dāng)入射光波的傳播常數(shù)與表面等離子波的傳播常數(shù)相匹配時(shí)，引起金屬膜內(nèi)自由電子產(chǎn)生共振，即表面等離子共振。分析時(shí)，先在傳感芯片表面固定一層生物分子識(shí)別膜，然后將待測樣品流過芯片表面，若樣品中有能夠與芯片表面的生物分子識(shí)別膜相互作用的分子，會(huì)引起金膜表面折射率變化，最終導(dǎo)致SPR角度變化，通過檢測SPR角度變化，獲得被分析物的濃度、親和力、動(dòng)力學(xué)常數(shù)和特異性等信息；FRET是一種高效的光學(xué)“分子尺”，是指能量從一種受激發(fā)的熒光基團(tuán)以非輻射的方式轉(zhuǎn)移到另一種熒光基團(tuán)的物理現(xiàn)象。在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸檢測等方面有廣泛的應(yīng)用，為在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)研究提供了便利[6]；但上述兩種技術(shù)對(duì)溫度、樣品組成等干擾因素非常敏感，同時(shí)設(shè)備包括很多光學(xué)和機(jī)械部分以及液路系統(tǒng)，導(dǎo)致體積大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使得系統(tǒng)優(yōu)化和商業(yè)化很難實(shí)現(xiàn)。

目前，國內(nèi)基于光纖傳感器的生物親和性檢測設(shè)備研究屬于空白，相關(guān)產(chǎn)品未見報(bào)導(dǎo)，且國外設(shè)備一般設(shè)備昂貴。本文根據(jù)反射膜厚度的改變對(duì)干涉光強(qiáng)度的影響，設(shè)計(jì)了自聚焦透鏡與光纖探針耦合的光學(xué)傳輸系統(tǒng)，搭建了光干涉生物親和性傳感檢測系統(tǒng)，自主研發(fā)了可實(shí)現(xiàn)生物分子間親和性檢測的新型裝置。

2 光干涉生物親和性檢測原理

本文所述基于光干涉原理的RIfS技術(shù)，基于生物薄膜干涉技術(shù)，在光纖制成的生物傳感器底端覆蓋生物分子相容層，形成生物膜層。當(dāng)分析物結(jié)合傳感器底端偶聯(lián)的配體時(shí)，生物膜層厚度增加，反射光干涉光譜曲線產(chǎn)生可測量的漂移，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測光纖探針表面由生物分子間相互作用引起的生物分子膜厚度的改變。采用微型光纖光譜儀捕獲可見光范圍內(nèi)的干涉光譜曲線，通過建立干涉光譜偏移量與生物分子膜厚度變化量間的量化關(guān)系，實(shí)現(xiàn)生物分子間相互作用過程的靈敏、快速、高通量實(shí)時(shí)監(jiān)測，獲得生物分子的有無、濃度及動(dòng)力學(xué)參數(shù)等生物學(xué)信息。與其它熒光標(biāo)記或非標(biāo)記生物分子親和性檢測技術(shù)相比較，避免了熒光基團(tuán)標(biāo)記容易導(dǎo)致生物分子活性下降，倏逝場技術(shù)的熱穩(wěn)定性差，微流控系統(tǒng)管路容易堵塞及通量低等缺點(diǎn)[7-8]。

該系統(tǒng)由光學(xué)系統(tǒng)、電控系統(tǒng)、信號(hào)處理系統(tǒng)組成，其中光學(xué)系統(tǒng)中光纖探針后端與“Y”型光纖連接，“Y”型光纖一端接可見光光源，一端接光電倍增管；將光纖探針侵入到待檢測樣本中，當(dāng)固定在探針端面的生物膜層特異性分子與被檢測分子發(fā)生相互作用時(shí)，能夠引起端面生物膜層厚度的改變，當(dāng)具有一定帶寬的可見光入射到光纖探針端面時(shí)，根據(jù)薄膜干涉的簡化模型和光線反射折射特性，圖1給出了光干涉生物親和性傳感檢測原理圖中，入射光線I在光纖探針端面分成兩個(gè)部分，一部分入射光在界面n0上反射，另一部分透過界面n0，在界面n1反射，然后在投射面n0射出。

圖1 光干涉生物親和性傳感檢測原理 Fig.1 Bioaffinity sensing detection principle based on the light interference

當(dāng)光纖探針端面發(fā)生生物分子結(jié)合反應(yīng)時(shí)，由于生物分子折射率與干涉層折射率相近，相當(dāng)于干涉層厚度增加，入射光在光纖探針端面分別產(chǎn)生兩束反射光Ⅰ和Ⅲ，由此產(chǎn)生的干涉光譜曲線較生物分子反應(yīng)前向波長增加方向偏移；同理，當(dāng)生物分子發(fā)生解離反應(yīng)時(shí)，干涉光譜曲線向波長減小方向偏移。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測生物分子間相互作用的干涉光譜曲線，獲得曲線的實(shí)時(shí)偏移量，從而能夠計(jì)算光纖探針端面生物分子膜層厚度相對(duì)變化量，并實(shí)現(xiàn)生物分子的有無、濃度及相互作用動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定[9-10]。

由上述光干涉生物親和性檢測原理可知，干涉光譜曲線極值點(diǎn)越尖銳，光譜儀捕獲生物分子反應(yīng)前、后干涉光譜極值點(diǎn)處的波長值越精確，計(jì)算獲得的生物分子膜層相對(duì)厚度越精確。

本文基于光干涉生物親和性檢測原理，采用光纖生物傳感器實(shí)現(xiàn)分子互作檢測。該方法首先由光學(xué)傳輸單元、光纖探針、微型光纖光譜儀實(shí)時(shí)監(jiān)測生物分子相互作用干涉光譜，然后對(duì)干涉光譜噪聲信號(hào)進(jìn)行處理，接下來對(duì)光纖探針端面的生物分子膜層厚度進(jìn)行計(jì)算，最終實(shí)現(xiàn)生物分子間是否發(fā)生相互作用、相互作用特異性與親和性、生物分子的定性與定量等信息的快速測定。

3 光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)

基于光纖生物傳感器的光干涉生物親和性檢測系統(tǒng)的光學(xué)部分主要由微型光纖光譜儀、光源、“Y”型分叉光纖、光纖探針等組成。全波段鹵鎢燈作為光源；用“Y”型分叉光纖將光源、光纖探針與微型光纖光譜儀連接起來，組成光學(xué)傳輸單元；光纖探針表面由TiO2+SiO2+生物分子層3部分構(gòu)成，是實(shí)現(xiàn)生物分子間相互作用并產(chǎn)生光干涉現(xiàn)象的重要單元，如圖2所示。

圖2 光學(xué)系統(tǒng)及光纖探針示意圖 Fig.2 Schematic diagram of optical system and optical fiber probe

其中，“Y”型分叉光纖與光纖探針連接(圖3所示)，實(shí)現(xiàn)光源與干涉光的光學(xué)傳輸，其光耦合效率直接決定了系統(tǒng)的測試性能?！癥”型分叉光纖與光源及微型光纖光譜儀間的連接部分為不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)螺紋接口，匹配良好。但與光纖探針連接時(shí)，由于光纖探針接口采用注塑工藝加工，光纖探針為一次性使用，因此入射光在與光纖探針連接端面容易發(fā)生反射和散射等雜散光干擾，不同光纖探針與Y型傳輸光纖連接時(shí)，人為裝調(diào)會(huì)產(chǎn)生偏心和傾斜等問題，從而降低光學(xué)傳輸系統(tǒng)的光耦合效率，降低檢測系統(tǒng)穩(wěn)定性。

圖3 “Y”型光纖和光纖探針連接示意圖 Fig.3 Connection schematic diagram of “Y” type optical fiber and optical fiber probe

為了減小雜散光干擾，提高光耦合效率，提高檢測系統(tǒng)性能，本文提出了自聚焦透鏡與石英光纖探針耦合的光學(xué)傳輸系統(tǒng)。

自聚焦透鏡又稱為梯度變折射率透鏡，是指其折射率分布是沿徑向漸變的柱狀光學(xué)透鏡，具有數(shù)值孔徑大、直徑小、焦距短、平端面、聚焦好的特點(diǎn)，與普通透鏡的區(qū)別在于，能夠使沿軸向傳輸?shù)墓猱a(chǎn)生折射，并使折射率的分布沿徑向逐漸減小，實(shí)現(xiàn)出射光線被平滑且連續(xù)的匯聚到一點(diǎn)[11]。圖4是普通透鏡和自聚焦透鏡的光軌跡示意圖。

圖4 普通透鏡和自聚焦透鏡光路 Fig.4 Optical paths of ordinary lens and self-focusing lens

石英光纖探針為全反射光傳輸方式，光傳輸效率高。采用ZEMAX光學(xué)設(shè)計(jì)軟件對(duì)自聚焦透鏡與石英光纖探針耦合結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)與光耦合效率模擬，結(jié)果如圖5所示，半徑為10 mm正光焦度、厚度為1 mm的K9自聚焦透鏡與直徑為21 mm的石英光纖耦合結(jié)構(gòu)，可大大提高光耦合效率，相對(duì)照度能夠達(dá)到1.0，實(shí)現(xiàn)了對(duì)光源的充分利用。

圖5 自聚焦透鏡與石英光纖耦合結(jié)構(gòu)光路效率仿真圖 Fig.5 Simulation block diagram of optical path efficiency of the self-focusing lens and quartz optical fiber probe coupling structure

圖6 自聚焦透鏡與石英光纖探針耦合結(jié)構(gòu)給定偏心0.02 mm公差后的光斑足跡圖 Fig.6 Spot footprint of the self-focusing lens and quartz optical fiber probe coupling structure given eccentricity 0.02 mm

圖7 自聚焦透鏡與石英光纖探針耦合結(jié)構(gòu)給定傾斜0.1°公差后的光斑足跡圖 Fig.7 Spot footprint of the self-focusing lens and quartz optical fiber probe coupling structure given tilt 0.1 degrees of tolerance

設(shè)計(jì)過程中在“Y”型分叉光纖與光纖探針間加工一個(gè)斷面，加入自聚焦透鏡，研究耦合的偏心與傾斜對(duì)系統(tǒng)光傳輸性能的影響。仿真結(jié)果如圖5所示，“Y”型分叉光纖與一次性石英光纖探針連接時(shí)，中間耦合自聚焦透鏡，能夠最大限度放寬石英光纖與Y型分叉光纖連接的偏心與傾斜公差，偏心公差應(yīng)小于0.02 mm，傾斜公差可小于0.1°，兩種情況下的光斑足跡圖如圖6、7所示。出射光的光斑足跡圖仍分布均勻，保證光源的高耦合效率，避免人為裝調(diào)等因素對(duì)光傳輸系統(tǒng)耦合效率及檢測系統(tǒng)穩(wěn)定性的影響。

4 基于改進(jìn)EMD的光譜信號(hào)去噪方法

在生物分子間相互作用的干涉光譜信號(hào)采集過程中，檢測系統(tǒng)內(nèi)部和外部都存在噪聲源，使得實(shí)際采集的原始干涉光譜信號(hào)曲線存在嚴(yán)重的系統(tǒng)高頻噪聲干擾。這些高頻噪聲主要來源于環(huán)境雜散光噪聲、分光光度計(jì)內(nèi)線陣CCD和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)電路的電噪聲，基本屬于隨機(jī)噪聲。在后續(xù)數(shù)據(jù)處理部分假設(shè)直接分析干涉信號(hào)的光譜信息，會(huì)出現(xiàn)相對(duì)較大的誤差。因此，需要根據(jù)噪聲特點(diǎn)，采取相應(yīng)的處理方法，盡可能簡單地剔除噪聲干擾，改善數(shù)據(jù)的平滑程度，從而提高信號(hào)的信噪比。目前常用的信號(hào)去噪方法主要有小波變換信號(hào)去噪法以及經(jīng)驗(yàn)?zāi)B(tài)分解(EMD)法，采用小波分析等傳統(tǒng)濾波方法對(duì)干涉光譜信號(hào)進(jìn)行處理，會(huì)出現(xiàn)較大的干涉光譜極值點(diǎn)偏移問題；經(jīng)驗(yàn)?zāi)B(tài)分解(EMD)方法是處理非線性、非平穩(wěn)信號(hào)的時(shí)頻分析方法。該方法可以在未知任何先驗(yàn)知識(shí)的情況下，依據(jù)輸入信號(hào)自身的特點(diǎn)，自適應(yīng)的將信號(hào)分解成若干個(gè)本征模態(tài)函數(shù)(Intrinsic Mode Function,IMF)之和[12-13]。EMD被認(rèn)為是對(duì)以線性和平穩(wěn)假設(shè)為基礎(chǔ)的傅立葉分析和小波變換等傳統(tǒng)時(shí)頻分析方法的重大突破。采用經(jīng)驗(yàn)?zāi)B(tài)分解(EMD)方法進(jìn)行干涉光譜信號(hào)處理，不需要預(yù)先設(shè)置任何參數(shù)，具有完全數(shù)據(jù)自主驅(qū)動(dòng)的特點(diǎn)，適合于分析非線性、非平穩(wěn)信號(hào)序列，具有很高的信噪比[14～16]。但在高頻分量中存在低頻混疊的問題，因此本文采用一種EMD干涉光譜信號(hào)處理的改進(jìn)方法，即針對(duì)干涉光譜信號(hào)的高頻噪聲特點(diǎn)，對(duì)一次EMD干涉光譜信號(hào)處理后的高頻IMF分量做二次EMD處理，以彌補(bǔ)一次EMD處理重構(gòu)后信號(hào)的相位微漂移，實(shí)現(xiàn)更精細(xì)尺度下的頻率成分分析，提高干涉光譜數(shù)據(jù)極值點(diǎn)的提取精度，該算法步驟如圖8所示。

圖8 干涉光譜信號(hào)二次EMD改進(jìn)方法處理流程圖 Fig.8 Flowchart of improved method of two times EMD for interference spectrum signal

圖9 原始干涉光譜經(jīng)EMD改進(jìn)方法分析處理后的各階分量 Fig.9 Each order components of original interference spectrum processed by the improved EMD method

圖10 含有噪聲的原始干涉光譜曲線 Fig.10 Original spectral curve with noise interference

對(duì)第一次EMD處理后舍棄的高頻分量進(jìn)行二次EMD篩選，結(jié)果如圖9所示，其中3階以后的分量變化平緩，再利用相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)法，對(duì)相關(guān)系數(shù)較小的分量進(jìn)行重構(gòu)，獲得近似的直流分量。將獲得的直流分量與第一次EMD處理所重構(gòu)的分量相加，獲得干涉光譜信號(hào)的濾波結(jié)果，從物理概念來看，兩次EMD處理結(jié)果可以有效的保持原干涉光譜信號(hào)的低頻分量，充分利用EMD的多分辨率分解，對(duì)高頻噪聲實(shí)現(xiàn)有效去除，保證干涉光譜信號(hào)相位處理后的一致性。

兩次EMD濾波處理結(jié)果如圖11所示，是對(duì)單次處理的相位微調(diào)并進(jìn)行局部放大，與其它小波分析、中值濾波與Savitzky-Golay平滑濾波等傳統(tǒng)光譜濾波方法相比較，干涉光譜信號(hào)的EMD改進(jìn)分析方法可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)性，不需輸入其它參數(shù)，完全是數(shù)據(jù)自主驅(qū)動(dòng)，在相位的保持上也優(yōu)于傳統(tǒng)濾波方法。

圖11 EMD改進(jìn)方法去噪結(jié)果 Fig.11 Denoising results of improved EMD method(a) and the partial enlargement result(b)

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

本文采用上述搭建的光干涉生物親和性傳感檢測系統(tǒng)(如圖12所示)，建立了金納米粒子信號(hào)放大HER3-IgG1抗體藥定量檢測新方法。HER家族是跨膜酪氨酸激酶受體(RTK)，是細(xì)胞增殖、分化、存活、移動(dòng)等重要調(diào)節(jié)者，與多種人類癌癥的形成與發(fā)展有關(guān)，在乳腺癌病人中HER3陽性患者占41.8%，針對(duì)HER3靶標(biāo)的抗體藥物研發(fā)成為熱點(diǎn)。

圖12 生物親和性檢測系統(tǒng) Fig.12 Photo of bioaffinity detection system

圖13 HER3-IgG1定量檢測結(jié)合反應(yīng)曲線 Fig.13 Quantitative detection with reaction curves of HER3-IgG1

圖14 HER3-IgG1定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.14 Standard curve of quantitative detection of HER3-IgG1

實(shí)驗(yàn)將光纖探針表面固定Biotin-HER3抗原，然后與人源化HER3-IgG1抗體藥進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，響應(yīng)值與抗體藥濃度呈正相關(guān)。檢測系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測相互作用過程如圖13所示，其中a～i是光纖探針檢測29.440～0.115 μg/mL濃度范圍內(nèi)倍比稀釋HER3-IgG1，經(jīng)Mc Ab-Au信號(hào)放大后的反應(yīng)曲線；j是固定有Biotin-HER3抗原的光纖探針置于20%兔血清中，經(jīng)同濃度Mc Ab-Au信號(hào)放大的空白對(duì)照反應(yīng)曲線。各濃度均重復(fù)3次測定，HER3-IgG1定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖14所示，在0.115～29.440 μg/mL濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線符合Logistic曲線擬合，相關(guān)系數(shù)R2=0.997，檢測時(shí)間17 min?？瞻讓?duì)照組重復(fù)3次檢測的SD(n=3)為0.132，檢測限(LOD)為空白對(duì)照3倍SD對(duì)應(yīng)的HER3-IgG1濃度，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為0.082 6 μg/mL；定量限(LOQ)為空白對(duì)照10倍SD對(duì)應(yīng)的HER3-IgG1濃度，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為0.267 μg/mL。

其中，檢測限指樣品中的待測物質(zhì)能夠被檢測出的最低濃度，也就是能測出該物質(zhì)的最低濃度；定量限指樣品中待測物質(zhì)能夠被測定的最低濃度，即能夠準(zhǔn)確定量檢測出該物質(zhì)的最低濃度；SD表示對(duì)空白進(jìn)行測定，其測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，是一種量度數(shù)據(jù)分布的分散程度的標(biāo)準(zhǔn)，用以衡量數(shù)據(jù)值偏離算數(shù)平均值的程度，標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，檢測值偏離平均值就越少，反之就越多。

6 結(jié) 論

本文根據(jù)光干涉生物親和性傳感檢測系統(tǒng)的原理分析，以ZEMAX光學(xué)設(shè)計(jì)軟件為前提，設(shè)計(jì)了自聚焦透鏡與光纖探針耦合的光干涉生物親和性傳感檢測光學(xué)傳輸系統(tǒng)，有效提高光源耦合效率，降低人為裝調(diào)帶入的偏心與傾斜問題對(duì)系統(tǒng)穩(wěn)定性的影響；然后采用一種EMD干涉光譜信號(hào)處理改進(jìn)方法去除干涉光譜信號(hào)的噪聲干擾，提高信號(hào)采集精度。采用搭建的光干涉生物親和性傳感檢測系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了HER3抗原與HER3-IgG1抗體藥特異性相互作用過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測，引入金納米粒子偶聯(lián)第二抗體信號(hào)放大效應(yīng)，建立了HER3-IgG1抗體藥的定量檢測新方法，利用所搭建的光干涉生物親和性檢測系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)HER3-IgG1抗體藥物含量的定量檢測新方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明系統(tǒng)檢測限能達(dá)到0.082 6 μg/mL，能夠應(yīng)用于藥代動(dòng)力學(xué)的研究中。

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