應(yīng)用于生物醫(yī)療領(lǐng)域的碳納米點(diǎn)及其復(fù)合物

王曉筠，李 波，陳 力，李 迪，曲松楠，李志民*

(1.吉林大學(xué) 口腔醫(yī)院，吉林 長春130021; 2.吉林大學(xué) 第二醫(yī)院，吉林 長春130000；3.中國科學(xué)院 長春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所，吉林 長春 130033)

1 引 言

碳納米點(diǎn)作為新興的碳納米材料，以其優(yōu)異的化學(xué)、物理性能成為納米材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1-3]。碳納米點(diǎn)(石墨烯量子點(diǎn))是零維納米材料，其尺寸通常小于10 nm，通過自上而下或自下而上的方法合成，中心為碳核結(jié)構(gòu)，表面具有氨基、羧基等多種官能團(tuán)，水溶性好，易于化學(xué)修飾。碳納米點(diǎn)具有高效熒光發(fā)射特性，包括依賴激發(fā)波長的熒光發(fā)射特性、發(fā)射波長在藍(lán)光至近紅外區(qū)域連續(xù)可調(diào)、高熒光量子效率、以及良好的光穩(wěn)定性等。同時(shí)，碳納米點(diǎn)具有高效的光生電荷分離和轉(zhuǎn)移特性，通過其豐富的表面反應(yīng)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)與其它功能材料的有效復(fù)合，并為碳納米點(diǎn)復(fù)合物實(shí)現(xiàn)新的性能。

由于具備制備成本低、尺寸小、低毒、生物相容性高、水溶性好、易修飾、光物理性質(zhì)獨(dú)特等諸多優(yōu)點(diǎn)，碳納米點(diǎn)在生物醫(yī)療領(lǐng)域展現(xiàn)了獨(dú)有的優(yōu)勢和應(yīng)用前景[4-7]。目前，隨著碳納米點(diǎn)合成方法的完善，吸收、發(fā)射光譜范圍的拓寬，以及熒光量子效率的提高，碳納米點(diǎn)及其復(fù)合物已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于熒光成像、生物傳感、載藥、基因傳遞以及腫瘤治療中，并取得了引人矚目的研究進(jìn)展。其中，碳納米點(diǎn)的熒光成像特性是其傳感、藥物示蹤、診斷等應(yīng)用的基礎(chǔ)，目前已被廣泛報(bào)道和總結(jié)[8-14]。進(jìn)一步，以碳納米點(diǎn)的化學(xué)、物理特性為基礎(chǔ)開發(fā)應(yīng)用于腫瘤等重大疾病診斷和治療的碳納米點(diǎn)生物醫(yī)療試劑，是碳納米材料和納米醫(yī)療領(lǐng)域的重要研究方向。本文將關(guān)注應(yīng)用于診斷治療領(lǐng)域的碳納米點(diǎn)及其復(fù)合物的設(shè)計(jì)、構(gòu)建及性能研究，對已報(bào)道的基于碳納米點(diǎn)的診斷治療試劑在生物醫(yī)療領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)和討論。

2 碳納米點(diǎn)的化學(xué)、物理特性

2.1 碳納米點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和組成

碳納米點(diǎn)(石墨烯量子點(diǎn))為碳基、石墨化的納米粒子，尺寸通常小于10 nm，中心為納米尺度下不同程度氧化的石墨結(jié)構(gòu)，表面帶有羧基等官能團(tuán)。碳納米點(diǎn)由sp2和sp3雜化的碳原子、橋連及端基氧原子、氫原子、雜原子(氮、硫、硒、磷、硼等摻雜原子)以及缺陷組成。大部分報(bào)道的碳納米點(diǎn)都可以從高分辨透射電子顯微鏡照片中觀測到局域清晰的由碳原子組成的晶格，分別為石墨的平面內(nèi)堆積(晶格間距0.18～0.24 nm)和層間堆積(晶格間距約0.334 nm)，證明了碳納米點(diǎn)的石墨化結(jié)構(gòu)[15]。除C、O、H外，通過原料選擇和化學(xué)摻雜手段，碳納米點(diǎn)內(nèi)核和表面官能團(tuán)中可以實(shí)現(xiàn)N、S、Se、P、B等主族元素的摻雜，并改變碳納米點(diǎn)的物理、化學(xué)性質(zhì)。

2.2 碳納米點(diǎn)的合成方法

表1 碳納米點(diǎn)合成方法及特點(diǎn)總結(jié)

碳納米點(diǎn)原料來源十分廣泛，合成方法簡單多樣，主要分為自上而下和自下而上兩類(表1)。自上而下法是利用物理方法(弧光放電、激光燒蝕、超聲)、電化學(xué)剝離法、化學(xué)法(強(qiáng)酸氧化、水熱、溶劑熱)等打破石墨類(碳納米管、氧化石墨烯、石墨烯等)材料的碳骨架獲得小尺寸碳核并將活性氧基團(tuán)(環(huán)氧基、羰基等)接入碳核的內(nèi)部和表面。由于大量表面缺陷的存在，大部分自上而下方法獲得的碳納米點(diǎn)熒光量子效率較低(<10%)，通過表面修飾有機(jī)小分子或低聚物可以提高碳納米點(diǎn)的熒光量子效率。2004年，Scrivens等人通過制備電泳純化單壁碳納米管時(shí)首次獲得熒光碳納米粒子[16]。2006年，Sun利用激光燒蝕石墨粉制備碳納米點(diǎn)，并在碳納米點(diǎn)表面共價(jià)接枝聚乙二醇(PEG1500N)進(jìn)行表面鈍化，獲得了激發(fā)波長依賴的藍(lán)光至紅光發(fā)射的碳納米點(diǎn)，熒光量子效率4%～10%[17]。與自上而下法相反，自下而上法是通過有機(jī)小分子逐步合成或熱解碳化完成聚合、成核、尺寸生長過程合成碳納米點(diǎn)。自下而上法原料來源極為廣泛，利用富碳的有機(jī)酸、有機(jī)胺、氨基酸、有機(jī)多羥基化合物、聚合物、天然原料等通過溶液化學(xué)合成、水熱、溶劑熱、微波、表面等離子體等多種合成方法均可制備出具有相似或不同結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的碳納米點(diǎn)。檸檬酸含碳量高，碳化溫度低，易與有機(jī)胺類化合物脫水聚合形成六圓環(huán)結(jié)構(gòu)，為自下而上法合成碳納米點(diǎn)最常用的有機(jī)碳源。Yang等人用水熱法將檸檬酸和乙二胺聚合碳化合成了碳納米點(diǎn)，產(chǎn)率為58%[18]。我們首次以檸檬酸和尿素為碳源用微波法(750 W,4～5 min)合成了具有高生物相容性的綠光發(fā)射碳納米點(diǎn)[19]，并在檸檬酸和尿素的原料體系中通過能帶調(diào)控手段獲得藍(lán)光和橙紅光發(fā)射的碳納米點(diǎn)[20-21](圖1)。 此外，碳納米點(diǎn)的尺寸和形貌可以通過控制合成條件和選擇模板進(jìn)行調(diào)控[22-23]。

圖1 (a)以檸檬酸和尿素為原料通過脫水和進(jìn)一步碳化合成碳納米點(diǎn)的示意圖。通過調(diào)節(jié)碳基內(nèi)核的共軛程度所獲得的藍(lán)光、綠光、紅光發(fā)射的碳納米點(diǎn)的吸收(b)和發(fā)射(c)光譜[20-21] Fig.1 (a)A schematic illustration for the formation of carbon nanodots from citric acid and urea through dehydration and following carbonization. The absorption(b) and emission(c) spectra of blue, green and orange emissive carbon nanodots obtained by tuning the conjugation degree of carbon-based cores[20-21]

到目前為止，大部分直接制備的碳納米點(diǎn)為多種尺寸碳納米點(diǎn)的混合物，獲得單一尺寸分布的碳納米點(diǎn)需要進(jìn)一步提純。常用的提純方法包括離心、透析、超濾、凝膠電泳、柱層析、高效液相色譜法等，我們以檸檬酸和氨水為原料用微波法(650 W,5～6 min)制備碳納米點(diǎn)，通過離心法分離獲得了小尺寸(1～7 nm)藍(lán)光發(fā)射和大尺寸(10～60 nm)綠光發(fā)射的碳納米點(diǎn)，并通過離心分離抑制小尺寸碳納米點(diǎn)向大尺寸碳納米點(diǎn)的能量轉(zhuǎn)移，使得藍(lán)光發(fā)射的碳納米點(diǎn)熒光量子效率提高到39%[24]。Xiong等人以尿素和對苯二胺為原料在水熱條件下(160 ℃,10 h)一步合成碳納米點(diǎn)，通過柱層析分離獲得藍(lán)光至紅光發(fā)射的系列碳納米點(diǎn)單色發(fā)光組分，發(fā)射光譜的不同是由各碳納米點(diǎn)組分表面官能團(tuán)的氧含量不同造成的[25]。除了制備和提純之外，碳納米點(diǎn)豐富的表面官能團(tuán)使得碳納米點(diǎn)的表面修飾簡單易行，并為碳納米點(diǎn)獲得新的特性和復(fù)合物的制備提供條件。碳納米點(diǎn)的表面活性官能團(tuán)主要為羧基和氨基，其修飾可通過靜電相互作用、氫鍵以及共價(jià)鍵實(shí)現(xiàn)。我們利用氫鍵和可能的靜電相互作用構(gòu)筑了具有可見-近紅外吸收的碳納米點(diǎn)聚集體(超碳納米點(diǎn))[20]。在共價(jià)修飾過程中，通過酰胺化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)碳納米點(diǎn)的表面修飾是最為常見的方法。Sun等人將表面富羧基的碳納米點(diǎn)在二氯亞砜中反應(yīng)形成酰氯，進(jìn)而進(jìn)攻表面鈍化劑端位胺基形成酰胺，實(shí)現(xiàn)PEG、乙二胺(EDA)等對碳納米點(diǎn)的表面鈍化[17,26]。Yang等人利用碳二亞胺法(EDC/NHS反應(yīng))活化碳納米點(diǎn)表面羧基形成NHS酯，進(jìn)一步與含胺基的gIgG抗體形成酰胺[27]。Sun等人利用EDC/NHS反應(yīng)活化奧沙利鉑的羧基，與表面富胺基的碳納米點(diǎn)形成酰胺構(gòu)筑復(fù)合物[28]。另外，碳納米點(diǎn)表面氨基的烷基化反應(yīng)[29-30]、與異硫氰酸酯、二硫化碳等反應(yīng)均可實(shí)現(xiàn)碳納米點(diǎn)的表面修飾[31]。

2.3 碳納米點(diǎn)的光物理性質(zhì)

區(qū)別于石墨烯等傳統(tǒng)的碳納米材料，碳納米點(diǎn)良好的發(fā)光特性成為其最具代表性的特點(diǎn)之一。碳納米點(diǎn)的吸收主要集中于紫外區(qū)，其帶邊拖尾延長至可見-近紅外區(qū)。高能紫外吸收(～260 nm)來源于sp2雜化平面的π-π*躍遷，略低帶隙的吸收(～300 nm)能量從高到低依次來源于平面間π-π*躍遷和n-π*躍遷[32]，另外，元素?fù)诫s、表面官能團(tuán)、表面鈍化等都會(huì)影響碳納米點(diǎn)的吸收光譜。在紫外波段激發(fā)下，很多碳納米點(diǎn)的主要發(fā)射峰位于藍(lán)光區(qū)，大部分研究者認(rèn)為是由于n-π*躍遷引起的發(fā)光[33]。隨著激發(fā)波長紅移，很多碳納米點(diǎn)的發(fā)射峰表現(xiàn)出激發(fā)波長依賴的特性，發(fā)生紅移，這是碳納米點(diǎn)獨(dú)特的光物理特性之一。目前，由于碳納米點(diǎn)的個(gè)體多樣性和未探明的精確結(jié)構(gòu)，其發(fā)光機(jī)制尚不明確，除尺寸效應(yīng)外，大量研究證明表面態(tài)對碳納米點(diǎn)發(fā)光特性的影響十分重要。Lin等人利用檸檬酸在甲酰胺中溶劑熱反應(yīng)合成了具有激發(fā)波長依賴特性的全色發(fā)光碳納米點(diǎn)，且長波長區(qū)發(fā)射強(qiáng)度未發(fā)生明顯降低，并證明碳納米點(diǎn)內(nèi)部具有多重發(fā)光中心[34]。對于部分發(fā)光具有激發(fā)波長依賴特性的碳納米點(diǎn)，可以通過化學(xué)分離獲得具有單一發(fā)射波長的多個(gè)發(fā)光單元，發(fā)光單元具有不同的尺寸或組成特性[25,35-36]。目前，通過原料體系的選擇以及合成方法的調(diào)控，具有非激發(fā)波長依賴發(fā)光特性的碳納米點(diǎn)已被廣泛報(bào)道，通過能級和表面態(tài)的調(diào)控，這些碳納米點(diǎn)的發(fā)光峰位可覆蓋藍(lán)光-近紅外區(qū)域，且熒光量子效率在全光譜區(qū)都可以超過10%[21,37]。碳納米點(diǎn)豐富的表面官能團(tuán)決定其具有豐富的表面電子和空穴，在復(fù)合體系中可以作為電子給體或受體實(shí)現(xiàn)電荷轉(zhuǎn)移，發(fā)生熒光淬滅，這種特性也是碳納米點(diǎn)應(yīng)用在生物傳感、催化等領(lǐng)域的基礎(chǔ)[38]。另外，碳納米點(diǎn)的長余輝發(fā)光、上轉(zhuǎn)化發(fā)光、多光子發(fā)光等光物理特性也是碳納米點(diǎn)在生物醫(yī)療應(yīng)用的基礎(chǔ)[39-42]。

3 碳納米點(diǎn)診斷治療試劑

生物醫(yī)學(xué)成像是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中最高效準(zhǔn)確的疾病診斷手段。碳納米點(diǎn)的光物理(吸收、發(fā)射)特性使得基于碳納米點(diǎn)的生物醫(yī)學(xué)成像成為可能。目前的研究已經(jīng)證明碳納米點(diǎn)作為高效熒光探針的應(yīng)用潛力，并在體外細(xì)胞成像的基礎(chǔ)上發(fā)展到活體成像研究，在獲得生物信息的同時(shí)，為腫瘤等疾病的診斷提供了可能。除了傳統(tǒng)的熒光成像，碳納米點(diǎn)的近紅外吸收、光熱效應(yīng)、光敏化特性使得其在光聲成像、光熱治療、光動(dòng)力治療等新型成像和治療技術(shù)中得到了有效的應(yīng)用。近年來，基于碳納米點(diǎn)的診斷、治療及一體化診療試劑已被有效開發(fā)并得到迅速發(fā)展。

Gao等人利用加熱碳化甘氨酸獲得了可選擇性聚集于腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的碳納米點(diǎn)，并在活體實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)了腦膠質(zhì)瘤的非入侵式成像[43]。Sun等人隨后報(bào)道了以D-葡萄糖和L-天冬氨酸為原料熱解合成發(fā)光碳納米點(diǎn)CD-Asp。由于激發(fā)波長依賴的發(fā)射特性，CD-Asp可分別實(shí)現(xiàn)藍(lán)光、綠光和紅光區(qū)的發(fā)射。相對于正常細(xì)胞，CD-Asp對腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞具有自靶向特性，可自由穿過血腦屏障精確靶向到腦膠質(zhì)瘤組織，通過活體成像實(shí)現(xiàn)腦癌診斷[44]。除了傳統(tǒng)的熒光成像，碳納米點(diǎn)光聲成像已被報(bào)道并應(yīng)用于疾病早期診斷。Pan等人用以蜂蜜為原料用微波法制備了有機(jī)大分子表面鈍化的碳納米點(diǎn)(OCN)，并以其為造影劑實(shí)現(xiàn)了前哨淋巴結(jié)的快速光聲成像，即在前爪注射2 min后實(shí)現(xiàn)了51倍造影增強(qiáng)，可清晰的觀察到前哨淋巴結(jié)。這種碳納米點(diǎn)具有近紅外吸收、小尺寸(7 nm)、快速淋巴管傳輸和快速清除特性，應(yīng)用于光聲成像技術(shù)，為外科手術(shù)實(shí)時(shí)快速發(fā)現(xiàn)并切除前哨淋巴結(jié)提供了簡便條件并有效降低成本(圖2)[45]。

圖2 左：動(dòng)態(tài)光散射測定的OCN新配置水分散液的數(shù)均粒徑和滴涂在鎳網(wǎng)上的無水態(tài)OCN的TEM圖像。右：裸鼠前哨淋巴結(jié)的無損實(shí)時(shí)活體光聲成像：激發(fā)光652 nm。右上：OCN剛注射后(2 min)采集獲得的光聲圖像。右下：注射后210 min，圖像對比度嚴(yán)重減弱[45] Fig.2 Left: Number-averaged particle diameter from dynamic light scattering of as-synthesized OCN dispersed(0.2 M) in fresh water and anhydrous state TEM image drop-deposited on a nickel grid. Right: Non-invasive real-time in vivo PA imaging of SLN in a nude mouse: the laser was tuned to a wavelength of 650 nm. PA image acquired immediately (2 min) after the OCN injection(upper). The contrast is much weaker after 210 min post-injection(lower)[45]

圖3 在不同位置皮下注射GQDs后鼠明場(a)和紅光(b)成像。激發(fā)波長為502～540 nm，熒光采集通道為695～775 nm。(c)經(jīng)過各種處理后1天、9天、17天、25天鼠的照片。(PDT：GQDs+光照；C1：只注射GQDs；C2:只光照。)(d)經(jīng)過各種處理后時(shí)間依賴腫瘤生長曲線(n=5)，每組P<0.05[46](彩圖見電子版) Fig.3 (a)Bright-field image and (b)red-fluorescence image after subcutaneous injection of GQDs in different areas. The excitation wavelength was 502-540 nm, and the collected fluorescence channel was 695 775 nm. (c)Photographs of mice after various treatments on the 1st, 9th, 17th and 25th day(PDT:GQDs+light irradiation; C1:GQDs only; C2:light irradiation only.) (d)Time-dependent tumour growth curves(n=5) after different treatments. P<0.05 for each group[46](color figures are available in electro-version)

在通過成像性質(zhì)進(jìn)行疾病診斷同時(shí)，碳納米點(diǎn)在光動(dòng)力、光熱治療等納米醫(yī)療技術(shù)中也得到了有效的應(yīng)用。很多碳納米點(diǎn)診斷、治療一體化試劑已被報(bào)道。2014年，Wang等人報(bào)道了以聚噻吩衍生物為原料水熱法合成石墨烯量子點(diǎn)(GQD)，該石墨烯量子點(diǎn)具有紫外-可見-近紅外區(qū)寬吸收和深紅光發(fā)射(λmax=680 nm)，以及高單線態(tài)氧(1O2)產(chǎn)率(～1.3)，并作為成像和光動(dòng)力治療一體化試劑進(jìn)行了體外細(xì)胞和動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)，在白光照射下實(shí)現(xiàn)了小鼠皮下腫瘤的光動(dòng)力治療(圖3)[46]。隨后，Wang等人以苯丙酸取代的噻吩聚合物為原料水熱法合成碳納米點(diǎn)，其吸收由可見延伸至近紅外區(qū)，發(fā)射峰位在640 nm，熒光量子效率2.3%。該碳納米點(diǎn)具有近紅外光熱轉(zhuǎn)換特性，在671 nm近紅外光激發(fā)下光熱轉(zhuǎn)換效率達(dá)到38.5%。由于具有紅光發(fā)射和近紅外光熱轉(zhuǎn)換特性，該碳納米點(diǎn)作為紅光成像、近紅外光聲成像和光熱治療一體化試劑應(yīng)用于癌癥診斷和治療。在細(xì)胞和活體試驗(yàn)中，靜脈注射碳納米點(diǎn)通過實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(EPR)聚集于腫瘤(HeLa tumor)部位，通過熒光和光聲成像可以實(shí)現(xiàn)碳納米點(diǎn)示蹤。注射8 h后，在671 nm激光照射(2 W/cm2)下實(shí)現(xiàn)了腫瘤的光熱治療，并未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用和生物體內(nèi)毒性[47]。綜合上述工作，Wang等人后續(xù)以苯甲酸取代的噻吩聚合物為原料合成了可見-近紅外寬吸收和紅光發(fā)射的碳納米點(diǎn)。該碳納米點(diǎn)在635 nm激光照射下可同時(shí)產(chǎn)生1O2和熱能，1O2產(chǎn)率為27%，光熱轉(zhuǎn)換效率為36.2%，實(shí)現(xiàn)紅光激發(fā)下成像引導(dǎo)的光動(dòng)力-光熱同步腫瘤診斷和治療[48]。由于碳納米點(diǎn)的主要吸收峰位于紫外-可見區(qū)，少數(shù)延伸至近紅外區(qū)，致使碳納米點(diǎn)在近紅外區(qū)的應(yīng)用受到限制，由于近紅外光利用率低，碳納米點(diǎn)在光聲成像、光熱、光動(dòng)力治療的實(shí)際應(yīng)用中，多選取可見或600～700 nm的紅光-近紅外激發(fā)光，且光功率密度偏高(>2 W/cm2)，該條件在組織穿透深度、激光安全范圍以及光源來源方面都存在局限。針對這一問題，我們等利用尿素和檸檬酸通過水熱反應(yīng)合成了表面電荷分布不均勻的小尺寸碳納米點(diǎn)CND，并通過可能的靜電相互作用和氫鍵形成超碳納米點(diǎn)組裝體supra-CND，在supra-CND中，相鄰CND通過空間交疊形成表面能級間電子躍遷，使得supra-CND在紅光-近紅外區(qū)產(chǎn)生強(qiáng)吸收峰(470～1 000 nm)，最大吸收峰位700 nm。supra-CND具有良好的近紅外光熱轉(zhuǎn)換性能，在732 nm處質(zhì)量消光系數(shù)為18.61 g-1·cm-1，808 nm激光照射下光熱轉(zhuǎn)換效率達(dá)到53.2%。supra-CND具有良好的水溶性和低細(xì)胞毒性，是極具潛力的近紅外光熱治療試劑(圖4)[20]。Xie等人以花菁染料CyOH與PEG800為原料溶劑熱合成具有近紅外吸收和發(fā)射的水溶性碳納米點(diǎn)CyCD，光熱轉(zhuǎn)換效率為38.7%。CyCD可在HepG2細(xì)胞和CT26腫瘤荷瘤小鼠活體實(shí)現(xiàn)近紅外熒光成像以及CT26腫瘤近紅外光熱治療[49]。

圖4 (a)CNDs(左)和supra-CNDs(右)的溶液(上)和固體粉末(下)的光學(xué)照片；(b)CNDs和supra-CNDs的吸收光譜(紫外最大吸收處歸一化)；(c)不同濃度supra-CND水分散液在808 nm激光輻照(1 W/cm2)下與純水對照的光熱轉(zhuǎn)換曲線[20] Fig.4 (a)Optical images of CNDs(left) and supra-CNDs(right) in the solutions(upper) and the solid states(lower); (b)The absorption spectra (normalized at the absorption maxima in UV region) of CNDs and supra-CNDs; (c)Photothermal profile of supra-CND aqueous dispersions with different concentrations under 808 nm laser irradiation(1 W/cm2) in contrast to pure water[20]

除了腫瘤的成像和治療外，Qu等人通過在強(qiáng)酸中微波消解氧化石墨烯的方法獲得石墨烯量子點(diǎn)，并利用石墨烯量子點(diǎn)催化分解雙氧水生成具有更強(qiáng)抗菌活性的·OH，提高雙氧水的抗菌能力，有效降低雙氧水在傷口殺菌時(shí)所需濃度，并利用該石墨烯量子點(diǎn)制備了“邦迪”，在小鼠活體試驗(yàn)中，在低濃度(100 μM)雙氧水輔助下實(shí)現(xiàn)了高效的傷口殺菌性能(圖5)[50]。

圖5 (a)基于GQDs和低含量H2O2抗菌系統(tǒng)的設(shè)計(jì)示意圖。(b)GQD創(chuàng)可貼應(yīng)用于活體傷口殺菌[50] Fig.5 (a)The designed system based on GQDs and low level of H2O2 for the antibacterial application. (b)GQD Band-Aids used in wound disinfection in vivo[50]

綜上，根據(jù)碳納米點(diǎn)自身的結(jié)構(gòu)及光物理性能，通過碳納米點(diǎn)多模式成像、自靶向、光敏化、光熱轉(zhuǎn)換等過程可實(shí)現(xiàn)碳納米點(diǎn)成像引導(dǎo)的腫瘤診斷和疾病治療，由于碳納米點(diǎn)良好的水溶性和生物相容性以及低制備成本，基于碳納米點(diǎn)的一體化診斷和治療試劑的設(shè)計(jì)和開發(fā)在納米醫(yī)療領(lǐng)域及其臨床推進(jìn)中具有極大的發(fā)展?jié)摿脱芯績r(jià)值。

4 碳納米點(diǎn)復(fù)合物診斷治療試劑

碳納米點(diǎn)具有共軛平面以及羧基、氨基、羥基等豐富的表面官能團(tuán)，可通過配位鍵、共價(jià)鍵、靜電相互作用或π堆積實(shí)現(xiàn)化學(xué)修飾，制備碳納米點(diǎn)復(fù)合物。復(fù)合物中各組分協(xié)同作用，可實(shí)現(xiàn)多模成像、載藥、靶向釋藥和光動(dòng)力/光熱治療。

4.1 多模成像

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)影像對疾病的早期、無創(chuàng)診斷至關(guān)重要，磁共振成像(MRI)、X射線斷層掃描、超聲成像、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(PET)、熒光成像、光熱[51]、光聲成像[52-53]等技術(shù)各具優(yōu)缺點(diǎn)，由于熒光成像響應(yīng)快、靈敏度高、具有亞細(xì)胞級分辨率，可與其它具有高組織穿透深度以及空間分辨率的成像手段結(jié)合實(shí)現(xiàn)多模成像。在多模成像探針中，磁共振(MR)/熒光探針在生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)展的最為成熟。碳納米點(diǎn)在生物熒光成像中的應(yīng)用已被廣泛研究，利用碳納米點(diǎn)與MRI造影劑復(fù)合，進(jìn)行MR/熒光多模成像，可實(shí)現(xiàn)疾病的精確診斷。

圖6 (A)細(xì)胞毒性和靶向性。(a)Gd@C-dots在不同PH值緩沖溶液中放置的光致發(fā)光強(qiáng)度變化。(b)Gd@C-dots隨時(shí)間變化的Gd釋放量。(c)MTT法測定U87MG細(xì)胞活性。(d)細(xì)胞靶向研究。(e)細(xì)胞顆粒T1-加權(quán)MR成像,細(xì)胞與RGD-Gd@C-dots或Gd@C-dots共孵育。(B)(a)T1-加權(quán)斷面MR成像，成像時(shí)間0, 10, 30, 45, 60 and 240 min。(b)T1-加權(quán)冠狀MR成像。動(dòng)物腫瘤注射RGD@Gd-dots后信號明顯增強(qiáng)。(c)b中成像結(jié)果不同時(shí)間點(diǎn)信號變化。(d)腫瘤樣品的免疫熒光組織學(xué)研究[52] Fig.6 (A)Cytotoxicity and cell targeting. (a)Photoluminescence intensity change when Gd@C-dots were incubated in buffers of different pH values. (b)Gd release from Gd@C-dots over time. (c)Cell viability, evaluated by MTT assays with U87MG cells. (d)Cell targeting study. (e)T1-weighted MR images of cell pellets, where cells had been incubated with either RGD-Gd@C-dots or Gd@C-dots. (B) (a) T1-weighted transverse MR images. Images were acquired at 0, 10, 30, 45, 60 and 240 min. (b)T1-weighted coronal MR images. Significant signal enhancement was observed in tumors of animals injected with RGD@Gd-dots. (c)Relative signal change at different time points, based imaging results from b. (d)Immunofluorescence histology study with tumor samples[52]

4.2 基因傳遞與藥物輸運(yùn)

基因治療在遺傳性疾病、感染性疾病、惡性腫瘤的治療中具有重要的應(yīng)用前景[61-62]。對于核酸傳遞，由于病毒載體的安全隱患和規(guī)模生產(chǎn)限制，非病毒基因載體被廣泛開發(fā)。碳納米點(diǎn)可以與核酸通過靜電作用形成復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)基因傳遞[63-67]。Liu等人利用甘油和枝化聚乙烯亞胺(bPEI)通過微波熱解法合成了PEI表面鈍化的碳納米點(diǎn)。通過優(yōu)化微波時(shí)間，獲得具有低毒性和激發(fā)波長依賴特性的多色發(fā)光的碳納米點(diǎn)-PEI(CD-PEI)復(fù)合物，與“黃金標(biāo)準(zhǔn)”非病毒載體PEI25k相比，CD-PEI在COS-7和HepG2細(xì)胞中表現(xiàn)出高于或與PEI25k相當(dāng)?shù)慕閷?dǎo)pDNA轉(zhuǎn)染能力，同時(shí)實(shí)現(xiàn)熒光成像[64]。Kim等人利用PEI修飾的碳納米點(diǎn)(CD-PEI)、PEI修飾的金納米粒子(Au-PEI)和pRNA通過靜電相互作用構(gòu)筑了三元納米組裝體(CD-PEI/Au-PEI/pDNA)。根據(jù)Au-PEI與CD-PEI空間距離的變化帶來的動(dòng)態(tài)熒光淬滅和恢復(fù)，CD熒光強(qiáng)度的變化可以反應(yīng)出組裝體的形成和解離過程。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明CD-PEI/Au-PEI/pDNA具有低毒性和高DNA轉(zhuǎn)染能力，并可以通過熒光研究實(shí)時(shí)監(jiān)控組裝體形成/解離和轉(zhuǎn)染過程，免去了對pDNA的熒光標(biāo)記(圖7)[65]。Wu等人通過氧化bPEI和水熱反應(yīng)合成了高熒光量子效率(54.3%)的碳納米點(diǎn)PCD，PCD具有熒光標(biāo)記特性、高生物相容性和基因傳遞能力[66]。Lebeau等人以檸檬酸和bPEI為原料微波合成碳納米點(diǎn)(CD)，并對CD在不同pH下透析進(jìn)行精細(xì)提純。CD可有效地結(jié)合pDNA和siRNA，在活體實(shí)驗(yàn)中通過非入侵式的肺部給藥實(shí)現(xiàn)與GL67A相當(dāng)?shù)母咝Х尾緿NA輸運(yùn)，并且毒性更低[67]。作為非病毒載體，以PEI為碳源或表面鈍化劑的碳納米點(diǎn)可通過靜電相互作用有效地結(jié)合核酸，實(shí)現(xiàn)與PEI25k相當(dāng)?shù)幕騻鬟f能力并降低載體的毒性。碳納米點(diǎn)作為基因載體既可實(shí)現(xiàn)外源基因體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染，又可以實(shí)現(xiàn)活體基因傳遞，為基因治療提供有潛力的非病毒載體。

圖7 利用CD-PEI/Au-PEI/pDNA分子組裝納米雜化材料進(jìn)行基因傳遞及細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)時(shí)監(jiān)測示意圖[65] Fig.7 A schematic illustration for the gene delivery and real-time monitoring of cellular trafficking utilizing CD-PEI/Au-PEI/pDNA molecular assembly of nanohybrids[65]

化學(xué)藥物輸運(yùn)在靶向給藥以及藥物緩釋的研究中具有重要意義。碳納米點(diǎn)具有π共軛核結(jié)構(gòu)和豐富的表面官能團(tuán)，可以與藥物分子和其它組裝單元相互作用，實(shí)現(xiàn)載藥、可控釋藥和診斷治療，降低藥物副作用，提高腫瘤抑制效果[27,68-71]。Singh等人將微波合成的碳納米點(diǎn)與喹啉-苯丁酸氮芥共聚物通過共價(jià)復(fù)合形成了光響應(yīng)納米藥物輸運(yùn)系統(tǒng)。依賴碳納米點(diǎn)的發(fā)光特性，該復(fù)合物具有激發(fā)波長依賴的熒光發(fā)射(325～550 nm)，可進(jìn)入HeLa細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中實(shí)現(xiàn)熒光成像。喹啉作為光觸發(fā)劑可實(shí)現(xiàn)抗癌藥苯丁酸氮芥在HeLa細(xì)胞內(nèi)的單光子/雙光子光控釋放，高效地殺死癌細(xì)胞[68]。Zhou等人將碳納米點(diǎn)包埋于聚合物poly(NIPAM-AAm)中制備納米凝膠，并與抗癌藥姜黃素復(fù)合，熒光碳納米點(diǎn)復(fù)合物可進(jìn)入B16F10癌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)成像，通過納米凝膠熱敏體積相轉(zhuǎn)變引起的碳納米點(diǎn)熒光強(qiáng)度改變實(shí)現(xiàn)環(huán)境溫度光學(xué)傳感。碳納米點(diǎn)光熱轉(zhuǎn)換特性可實(shí)現(xiàn)姜黃素近紅外光控釋放，增強(qiáng)對B16F10細(xì)胞毒性[69]。Wang等人將綠光發(fā)射的碳納米點(diǎn)與分子篩咪唑酯骨架化合物(ZIF-8)納米晶復(fù)合，利用ZIF-8的孔結(jié)構(gòu)負(fù)載抗癌藥5-氟尿嘧啶，在HeLa細(xì)胞中同時(shí)實(shí)現(xiàn)成像和PH控制釋藥[70]。Sun等人通過熱解檸檬酸和多烯多胺合成發(fā)光碳納米點(diǎn)，并將碳納米點(diǎn)與奧沙利鉑氧化前體(Oxa(IV)-COOH)共價(jià)接枝形成復(fù)合物CD-Oxa實(shí)現(xiàn)藥物負(fù)載。復(fù)合物在HepG2細(xì)胞和荷載肝癌(H22)小鼠活體中可實(shí)現(xiàn)激發(fā)波長依賴的熒光成像。CD-Oxa在瘤內(nèi)注射后可通過活體熒光成像監(jiān)控鉑藥的體內(nèi)分布從而控制給藥時(shí)間和劑量，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。癌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境可將Oxa(IV)-COOH還原為oxaliplatin(II)實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞內(nèi)靶向釋藥(圖8)[27]。

圖8 CD-Oxa合成及其在生物成像和診斷治療中的應(yīng)用示意圖[27] Fig.8 Synthetic scheme for CD-Oxa and its applications in bioimaging and theranostics[27]

碳納米點(diǎn)負(fù)載抗癌藥阿霉素(DOX)也被廣泛報(bào)道[72-78]。Qu等人通過高溫?zé)峤釫DTA-2Na·2H2O制備表面負(fù)電性的發(fā)光碳納米點(diǎn)，與表面正電修飾的介孔硅納米粒子通過靜電相互作用復(fù)合，將DOX包封負(fù)載于介孔硅納米粒子中。納米復(fù)合物可通過內(nèi)吞作用進(jìn)入HeLa細(xì)胞溶酶體，在Hela細(xì)胞中和裸鼠皮下實(shí)現(xiàn)熒光成像。負(fù)載阿霉素的復(fù)合物在溶酶體的酸性條件下解離，在細(xì)胞內(nèi)釋藥，提高藥物細(xì)胞毒性[73]。Sharon等人以山梨醇為原料微波下合成綠光發(fā)射碳納米點(diǎn)，與牛血清蛋白(BSA)、葉酸(FA)復(fù)合并負(fù)載DOX(負(fù)載率86%)，靶向進(jìn)入癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)并成像，在中性以及微酸性環(huán)境下釋藥[74]。Guo等人利用氧化石墨烯photo-Fenton反應(yīng)制備石墨烯量子點(diǎn)(GQD)，并通過π-π相互作用與DOX形成復(fù)合物。GQD實(shí)現(xiàn)載藥性能的同時(shí)可以提高DOX的DNA裂解活性和細(xì)胞核內(nèi)聚集能力。相比于DOX，DOX/GQD復(fù)合物提高了對于具有DOX抗藥性的MCF-7/ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒性[75]。Chang等人利用苯硼酸改性的MnFe2O4與碳納米點(diǎn)復(fù)合，以苯硼酸為靶向配體，復(fù)合物可在HeLa細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)T2加權(quán)MRI和熒光雙模成像。復(fù)合物中碳納米點(diǎn)通過π-π相互作用負(fù)載DOX，并通過PH控制細(xì)胞內(nèi)釋藥[76]。我們利用微波法合成表面富羧基的綠光發(fā)射碳納米點(diǎn)并通過非共價(jià)吸附實(shí)現(xiàn)DOX負(fù)載?；诎┘?xì)胞與正常細(xì)胞pH環(huán)境的差別，使藥物對癌細(xì)胞實(shí)現(xiàn)選擇性釋放，以肝癌(HepG2)腫瘤為模型實(shí)現(xiàn)裸鼠活體成像和腫瘤抑制(圖9)[77]。

圖9 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。(a)DOX上的胺基(-NH2)與CDs上的羧酸基團(tuán)(-COOH)通過靜電相互作用和氫鍵結(jié)合；(b)CD-DOX復(fù)合物傳遞至HepG2癌細(xì)胞和HL-7702正常細(xì)胞并伴隨強(qiáng)綠光信號示蹤。因?yàn)榘┘?xì)胞內(nèi)PH值低，CD-DOX復(fù)合物可將DOX釋放至HepG2癌細(xì)胞，但不會(huì)釋放到HL-7702正常細(xì)胞?；贕QD的FRET細(xì)胞核靶向傳遞系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)控藥物釋放過程的示意圖[77] Fig.9 Schematic illustration of the experimental design overview. (a)The amines(-NH2) on DOX bind with the carboxylic acid(-COOH) on CDs via electrostatic interactions or hydrogen bonding. (b)Delivery of CD DOX conjugates to HepG2 cancer cells and HL-7702 normal cells with strong green signal imaging tracking. The CD DOX conjugates are expected to release DOX in HepG2 cancer cells, but not HL-7702 normal liver cells, due to low pH in cancer cells.Schematic illustration of the GQD-based FRET system for nuclear-targeted delivery allowing for real-time monitoring the drug release process[77]

Dong等人利用酸堿中和放熱在短時(shí)間內(nèi)(6 min)合成了磷、氮共摻雜中空結(jié)構(gòu)綠光發(fā)射碳納米點(diǎn)，與DOX形成復(fù)合物，在HepG2細(xì)胞和荷瘤小鼠活體中成像和釋藥，抑制腫瘤[78]。Cui等人將表面PEG化的石墨烯量子點(diǎn)與細(xì)胞穿膜肽TAT偶聯(lián)，作為藥物載體與DOX復(fù)合，同時(shí)碳納米點(diǎn)作為給體與DOX構(gòu)成熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)復(fù)合物。在體外細(xì)胞(HeLa)試驗(yàn)中，TAT肽可靶向核孔復(fù)合物，有助于藥物的核內(nèi)輸運(yùn)。FRET信號可反應(yīng)給受體間的距離，在通過給受體的熒光變化可以實(shí)時(shí)監(jiān)控藥物釋放情況[79]。Xu等人以阿司匹林為原料，采用“一步法”微波輔助合成具有雙功能性的碳納米點(diǎn)。該碳納米點(diǎn)不但有良好的熒光穩(wěn)定性，而且能夠進(jìn)入人頭頸癌細(xì)胞及小鼠單核巨噬細(xì)胞。結(jié)構(gòu)分析表明該碳納米點(diǎn)含有阿司匹林官能團(tuán)。通過建立大鼠體內(nèi)急性炎癥動(dòng)物模型，H&E(hematoxylin-eosin staining)染色、ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)等方法檢測結(jié)果表明所制備的碳納米點(diǎn)具有良好的抗炎作用。體外脂多糖 (LPS)與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)炎癥環(huán)境，Real-time PCR檢測炎癥因子表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在一定濃度時(shí)，合成的碳納米點(diǎn)能降低TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平，且優(yōu)于阿司匹林的抗炎作用[80]。

4.3 光動(dòng)力/光熱治療

光動(dòng)力治療(PDT)通過光敏劑將光能傳遞給周圍氧產(chǎn)生活性氧簇殺死細(xì)胞或破壞腫瘤組織實(shí)現(xiàn)局部疾病治療[81]。碳納米點(diǎn)除了用作光動(dòng)力治療的光敏劑外，還可以負(fù)載光敏藥物形成多功能復(fù)合物用于診斷和光動(dòng)力治療。Chen等人將NH2-PEG鈍化的綠光發(fā)射碳納米點(diǎn)與二氫卟吩e6(Ce6)共價(jià)偶聯(lián)形成復(fù)合物C-dots-Ce6，碳納米點(diǎn)的發(fā)射光譜與Ce6的吸收光譜重疊，通過FRET能量轉(zhuǎn)移，430 nm激發(fā)下Ce6的熒光強(qiáng)度提高35倍。C-dots-Ce6可標(biāo)記MGC803細(xì)胞質(zhì)實(shí)現(xiàn)紅光成像，并通過在MGC803腫瘤荷瘤小鼠體內(nèi)活體成像實(shí)現(xiàn)藥物示蹤。C-dots-Ce6的尺寸效應(yīng)延長了藥物血液循環(huán)半衰期并通過被動(dòng)靶向在腫瘤組織富集。細(xì)胞毒性試驗(yàn)證明碳納米點(diǎn)的復(fù)合可以提高Ce6的單線態(tài)氧(SO)產(chǎn)率，并在動(dòng)物活體試驗(yàn)中通過PDT作用有效抑制腫瘤增長[82]。Hahn等人將碳納米點(diǎn)-Ce6復(fù)合物與透明質(zhì)酸(HA)偶聯(lián)，通過HA的靶向作用穿皮給藥實(shí)現(xiàn)對黑色素瘤的成像及高效光動(dòng)力治療[83]。Chen等人通過水熱法合成表面帶負(fù)電的藍(lán)光發(fā)射碳納米點(diǎn)，并通過靜電相互作用與帶正電的卟啉化合物5,10,15,20-tetrakis(1-methyl 4-pyridinio) porphyrins (TMPyP)復(fù)合，碳納米點(diǎn)的發(fā)射帶隙與TMPyP的吸收帶隙重合，F(xiàn)RET能量轉(zhuǎn)移效率為45%。700 nm處碳納米點(diǎn)雙光子吸收截面(TPACS)為15 000 GM。基于高TPACS和FRET效率，700 nm飛秒激光激發(fā)下，復(fù)合物在HeLa細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)雙光子成像，SO產(chǎn)率高于單獨(dú)使用光敏劑TMPyP。在細(xì)胞PDT試驗(yàn)中，以復(fù)合物為光敏劑，在700 nm、160 mW/mm2飛秒激光照射下，45 min后HeLa細(xì)胞的存活率低于20%，復(fù)合物可實(shí)現(xiàn)在低功率密度照射下的高效雙光子PDT治療[84]。Wei等人將石墨烯量子點(diǎn)與光敏劑Hypocrellin A通過π-π相互作用復(fù)合，包覆于多孔SiO2中。碳納米點(diǎn)用于載藥和多色熒光成像，在可見光激發(fā)下排除組織自發(fā)熒光的干擾；Hypocrellin A作為可見光激發(fā)的高效光敏劑光動(dòng)力治療淺表性疾病和腫瘤；多孔SiO2在提高成像和PDT效果的同時(shí)防止輸運(yùn)過程中復(fù)合物的解離。復(fù)合物在HeLa細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中實(shí)現(xiàn)了多色成像，以及可見光激發(fā)下的光動(dòng)力治療[85]。Kim等人通過環(huán)糊精碳化、PEG-NH2表面鈍化以及葉酸(FA)表面修飾獲得了具有腫瘤靶向特性的藍(lán)光發(fā)射碳納米點(diǎn)(CD-PEG-FA)。CD-PEG-FA通過π-π相互作用復(fù)合光敏劑酞菁鋅(ZnPc)，復(fù)合物通過靶向作用進(jìn)入葉酸受體高表達(dá)細(xì)胞系中，在HeLa細(xì)胞和HeLa腫瘤荷瘤小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞成像，并通過輸運(yùn)ZnPc實(shí)現(xiàn)腫瘤光動(dòng)力治療(圖10)[86]。

圖10 通過α-環(huán)糊精制備碳納米點(diǎn)(CD)以及利用葉酸修飾碳納米點(diǎn)負(fù)載酞菁鋅(CD-PEG-FA/ZnPc)進(jìn)行靶向光動(dòng)力治療的示意圖[86] Fig.10 Schematic illustration of the preparation of carbon nanodots(CD) from α-cyclodextrin and targeted photodynamic therapy with folic acid functionalized carbon nanodots loaded with zinc phthalocyanine(CD-PEG-FA/ZnPc)[86]

光熱治療通過光熱轉(zhuǎn)換試劑將外部光源的能量轉(zhuǎn)換為熱量引起組織局部溫度提高進(jìn)而殺死細(xì)胞[87]，碳納米點(diǎn)的近紅外吸收可以使其用作光熱轉(zhuǎn)換試劑，同時(shí)，碳納米點(diǎn)可以負(fù)載其它類型光熱轉(zhuǎn)換試劑以及化學(xué)藥物實(shí)現(xiàn)多種治療手段協(xié)同作用的疾病治療。Zhou等人將發(fā)光碳納米點(diǎn)包埋于多孔碳納米膠囊中構(gòu)筑尺寸100 nm左右的復(fù)合物FPC-NC，可在DU145細(xì)胞質(zhì)中實(shí)現(xiàn)雙光子熒光成像。FPC-NC的多孔結(jié)構(gòu)有利于負(fù)載抗癌藥，且具有近紅外光熱轉(zhuǎn)換特性，在DU145細(xì)胞中，負(fù)載DOX的FPC-NC可通過PH調(diào)控和近紅外光熱轉(zhuǎn)換引發(fā)釋藥，F(xiàn)PC-NC-DOX復(fù)合物在近紅外光源照射下可以實(shí)現(xiàn)光熱治療和化療的協(xié)同作用殺死DU145細(xì)胞(圖11)[88]。Sharon等人通過微波熱解阿拉伯膠(GA)制備發(fā)光碳納米點(diǎn)，并利用碳納米點(diǎn)修飾金納米棒(GNR)表面，得到低細(xì)胞毒性的碳納米點(diǎn)-金納米棒復(fù)合物(C-dots@GNR)。復(fù)合物負(fù)載抗癌藥DOX，由于碳納米點(diǎn)的多孔結(jié)構(gòu)，載藥量達(dá)到94%，碳納米點(diǎn)的熒光特性實(shí)現(xiàn)對藥物的熒光標(biāo)記。在細(xì)胞試驗(yàn)中，復(fù)合物通過表面正電實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)吞，在近紅外光照射下，其中GNR的光熱轉(zhuǎn)換特性可同時(shí)實(shí)現(xiàn)加速釋藥和光熱治療[89]。

圖11 (a)多功能FPC-NCs示意圖。嵌入多孔碳?xì)さ陌l(fā)光碳納米點(diǎn)不僅能夠作為共聚焦和雙光子成像造影劑,也能有效地將近紅外光轉(zhuǎn)換成熱。同時(shí),大的中空腔和多孔碳?xì)た梢酝ㄟ^FMC-NCs與DOX之間的超分子π堆積、氫鍵、和靜電相互作用大量負(fù)載抗癌藥(DOX)。因此，F(xiàn)PC-NCs可以將光熱/化療整合成一個(gè)納米體系從而實(shí)現(xiàn)更高的療效；(b)負(fù)載DOX的FPC-NCs化療和近紅外光照下光熱/化學(xué)合并治療示意圖[89] Fig.11 (a)Schematic illustration of multifunctional FPC-NCs. The fluorescent CDs embedded in the porous carbon shell can not only be used for confocal and two-photon imaging contrast, but also convert the NIR light to heat effectively. In addition, the large hollow cavity and porous carbon shell can provide a high loading capacity for anti-cancer drug(DOX) through the supramolecular π stacking, hydrogen bonding, and electrostatic interactions between DOX and FMC-NCs. Thus, the FPC-NCs can combine photothermal/chemotherapy into a single nano-object to provide high therapeutic efficacy; (b)Schematic illustration of the chemotherapy and combined chemo-photothermal treatment of the DOX-loaded FPC-NCs in the presence of NIR irradiation[89]

5 碳納米點(diǎn)生物毒性

相比于傳統(tǒng)的量子點(diǎn)，碳納米點(diǎn)由于其碳基組成而具有本源的生物相容性。碳納米點(diǎn)在細(xì)胞和活體成像以及治療方面的實(shí)驗(yàn)證明碳納米點(diǎn)對細(xì)胞、植物和動(dòng)物的生存能力無明顯影響。然而，基于碳納米點(diǎn)自身的結(jié)構(gòu)和組成單元，其在生物體內(nèi)的長期毒理和藥物代謝動(dòng)力學(xué)仍需深入研究。

Sun等人研究了PEG表面鈍化的碳納米點(diǎn)生物毒性，證明了碳納米點(diǎn)對MCF-7和HT-29細(xì)胞系的增殖、存活率等無明顯影響。在CD-1鼠活體試驗(yàn)中，給藥動(dòng)物的臨床癥狀、血液生物分析和組織學(xué)分析均可證明高于活體成像劑量的碳納米點(diǎn)對模型鼠無明顯生物毒性。此類碳納米點(diǎn)在給藥6 h后在肝臟和脾臟有少量富集[90]。Liu等人證明了通過氧化碳納米管和石墨烯獲得的碳納米點(diǎn)在高濃度時(shí)對293T細(xì)胞生長和小鼠活體無毒[91]。Cui等人通過急性毒性、亞急性毒性、基因毒性試驗(yàn)證明了通過硝酸氧化法制備的碳納米點(diǎn)對試驗(yàn)鼠無毒[92]。Chen等人通過單次和多次給藥和小鼠血液學(xué)、血液生化指標(biāo)、組織病理學(xué)等檢驗(yàn)證明了基于檸檬酸合成的碳納米點(diǎn)在90天實(shí)驗(yàn)期對鼠體低毒，其對雌鼠和雄鼠的半數(shù)致死量(LD50)分別為391.615 mg/kg和357.771 mg/kg[93]。Dhara和Liu等人分別研究了碳納米點(diǎn)的血液相容性[94-95]。Liu等人證明了水熱碳化α-環(huán)糊精獲得的碳納米點(diǎn)在濃度低于0.1 mg/mL時(shí)對血液成分基本無不利影響；碳納米點(diǎn)靜脈注射量在50 mg/kg以內(nèi)時(shí)對鼠體的凝血功能無明顯影響[95]。Xu等人通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，對以阿司匹林制備的碳納米點(diǎn)的毒性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在生物應(yīng)用濃度范圍內(nèi)，合成的碳納米點(diǎn)細(xì)胞毒性較小，對細(xì)胞及心、肝、脾、腎等臟器影響不明顯[80]。

圖12 (a)不同方法給藥后C-dot-ZW800的尿富集。小鼠在異氟烷麻醉下，膀胱部位曝光，近紅外成像圖像在靜脈(上)、肌肉(中)、皮下(下)注射前、后如圖中標(biāo)識(shí)的時(shí)間點(diǎn)獲取。(b)(a)中ZW800熒光信號數(shù)值。(c)64Cu-C-dot經(jīng)3種給藥方式：左，靜脈注射；中，肌肉注射；右，皮下注射后通過1h動(dòng)態(tài)PET成像獲得的代表性冠狀位圖像。(d)C-dot-ZW800經(jīng)不同方式給藥后的腫瘤富集情況[96] Fig.12 (a)Urine accumulation of C-dot-ZW800 after different routes of injection. The mice were kept under isoflurane anesthesia, the bladder was exposed, and NIR images were acquired at the indicated time points before and after (top) iv injection, (middle) sc injection, and (bottom) im injection. (b)Quantification of the ZW800 fluorescence signal in (a). (c)Representative coronal images from 1 h dynamic PET imaging of 64Cu-C-dot after three routes of injection: left, iv injection; middle, sc injection; right, im injection. (d)Tumor uptake of C-dot-ZW800 after different routes of injection[96]

Chen等人通過近紅外熒光成像和正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(PET)成像研究PEG表面鈍化的碳納米點(diǎn)在不同給藥方式(靜脈、肌肉、皮下注射)下在小鼠體內(nèi)分布、代謝情況，并發(fā)現(xiàn)3種給藥方式進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的碳納米點(diǎn)均可快速的通過腎臟代謝隨尿液排出體外；此外，碳納米點(diǎn)可通過被動(dòng)靶向作用進(jìn)入荷瘤小鼠腫瘤部位(圖12)[96]。根據(jù)已有的報(bào)道，盡管不同組成和結(jié)構(gòu)的碳納米點(diǎn)在生物體內(nèi)的毒理及代謝機(jī)制不同，但是碳納米點(diǎn)的基本碳基組成和尺寸效應(yīng)保證了碳納米點(diǎn)具有較高的生物相容性，這為碳納米點(diǎn)的臨床推進(jìn)研究提供了基礎(chǔ)。

6 結(jié)論與展望

碳納米點(diǎn)的組成、結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特性使得其在碳納米管和氧化石墨烯之后成為極具生物醫(yī)用前景的新興碳納米材料。碳納米點(diǎn)原料來源廣泛，合成方法簡單多樣，表面官能團(tuán)豐富，可以與靶向配體、醫(yī)學(xué)影像造影劑、核酸、化學(xué)藥物、光敏劑、光熱轉(zhuǎn)換試劑等功能性診斷治療試劑相互作用形成復(fù)合物?，F(xiàn)有的研究結(jié)果證明碳納米點(diǎn)除了自身的發(fā)光、自靶向、光敏化、光熱轉(zhuǎn)換等特性可作為診斷治療試劑應(yīng)用于納米醫(yī)療領(lǐng)域外，其與特定功能材料形成的復(fù)合物在醫(yī)學(xué)影像、基因及藥物輸運(yùn)、腫瘤治療的應(yīng)用中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。具有診斷治療功能的碳納米點(diǎn)及其復(fù)合物的研究在推進(jìn)疾病的個(gè)體化、可視化、非入侵式、小損傷、靶向治療中展現(xiàn)了良好的發(fā)展前景。

相比于傳統(tǒng)無機(jī)量子點(diǎn)，碳納米點(diǎn)的碳基組成具有更高的生物相容性。作為納米材料，碳納米點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和組成單元帶來的長期毒性和藥物代謝動(dòng)力學(xué)是決定其實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用的關(guān)鍵，已有的動(dòng)物模型生理指標(biāo)數(shù)據(jù)和循環(huán)代謝結(jié)果證明了碳納米點(diǎn)的低毒性，然而由于碳納米點(diǎn)的組成、結(jié)構(gòu)的多樣性和活潑的表面特性，碳納米點(diǎn)在生物體內(nèi)的作用機(jī)制、毒理研究及臨床推進(jìn)仍是碳納米點(diǎn)應(yīng)用于生物醫(yī)療領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

綜上，研究并明確碳納米點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和發(fā)光機(jī)制，實(shí)現(xiàn)碳納米點(diǎn)的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和可控發(fā)光，逐步開發(fā)具有高生物相容性和可精確修飾的碳納米點(diǎn)及其復(fù)合物，進(jìn)而在細(xì)胞水平上獲得基于碳納米點(diǎn)的熒光成像試劑實(shí)現(xiàn)高分辨/超分辨亞細(xì)胞級成像，研究生命過程，通過復(fù)合修飾獲得基因、化學(xué)藥物、光熱/光動(dòng)力治療試劑是目前碳納米點(diǎn)研究的重要課題。在此基礎(chǔ)上，將碳納米點(diǎn)功能性復(fù)合試劑進(jìn)一步推廣到活體成像、診斷和治療，明確碳納米點(diǎn)及其復(fù)合藥物在生物體內(nèi)的毒理特性和代謝動(dòng)力學(xué)，最終推進(jìn)并實(shí)現(xiàn)基于碳納米點(diǎn)的試劑及藥物的臨床應(yīng)用。將碳基納米材料與納米醫(yī)學(xué)技術(shù)從研發(fā)推向應(yīng)用，克服已有的有機(jī)熒光染料、小分子藥物、無機(jī)納米粒子面臨的問題，為人類重大疾病診斷治療提供新型材料和方法，是碳納米點(diǎn)研究的重要方向和目標(biāo)。

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