微流控SERS芯片及其生物傳感應(yīng)用

王志樂(lè)，王著元，宗慎飛，崔一平

(東南大學(xué) 先進(jìn)光子學(xué)中心，江蘇 南京 210096)

1 引 言

微流芯片誕生時(shí)可能只是作為納米技術(shù)革命的過(guò)渡，而由于材料科學(xué)、加工工藝的快速發(fā)展，微流控技術(shù)也有了突破性的進(jìn)展。微流控系統(tǒng)也被稱(chēng)為“芯片實(shí)驗(yàn)室”(lab on a chip，LoC)[1]，具有樣品消耗量低、反應(yīng)時(shí)間短、嚴(yán)格操控及便攜性等優(yōu)勢(shì)。隨著微流控技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，研究者們不再滿(mǎn)足于只將化學(xué)反應(yīng)搬到芯片中，而是把各種分析物的檢測(cè)也放在微流中進(jìn)行。微量樣品的檢測(cè)必然需要高靈敏度的檢測(cè)方法，于是微流芯片作為一個(gè)良好的平臺(tái)應(yīng)用于很多檢測(cè)技術(shù)，這使得諸如光學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究者都對(duì)其產(chǎn)生了濃厚的興趣[2]。

近年來(lái)，光學(xué)與光譜學(xué)技術(shù)發(fā)展成為了一種高靈敏、快速、高效并且無(wú)損的檢測(cè)成像手段[3]，其中表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)是最常用的光譜方法之一。SERS光譜具有諸多優(yōu)點(diǎn)，例如可作為分子的指紋光譜進(jìn)行無(wú)標(biāo)檢測(cè)[4]，其超高的靈敏度可以實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)[5]，窄峰寬可實(shí)現(xiàn)多元檢測(cè)[6]等，在生物傳感上有著廣泛的應(yīng)用。最近，將SERS技術(shù)與微流芯片相結(jié)合形成的微流控SERS檢測(cè)芯片(SERS-LoC)成為新的研究趨勢(shì)：SERS可以檢測(cè)在微流通道內(nèi)超低濃度的樣品，而微流芯片的多通道設(shè)計(jì)可以方便的實(shí)現(xiàn)多元SERS檢測(cè)[7]。SERS可以為微流平臺(tái)提供優(yōu)秀的檢測(cè)技術(shù)。而通過(guò)微流通道制作SERS基底可以解決在溶液中檢測(cè)時(shí)SERS信號(hào)無(wú)規(guī)律波動(dòng)的問(wèn)題，從而大幅度提高SERS檢測(cè)的重復(fù)性與可靠性。不僅如此，微流控芯片良好的可操作性也被很多研究者用來(lái)控制合成不同形貌的基底以及實(shí)現(xiàn)多功能[8]。SERS與微流芯片的結(jié)合為兩種技術(shù)的發(fā)展都提供了很多新的機(jī)遇，而且二者互補(bǔ)也解決了各自的問(wèn)題，為多功能的SERS-LoC系統(tǒng)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，在生物、化學(xué)檢測(cè)，醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域都有很大的發(fā)展空間[9]。

鑒于SERS-LoC近年來(lái)取得的突出研究進(jìn)展，本文在簡(jiǎn)要介紹SERS的機(jī)理及最近的發(fā)展的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)概述了SERS在生物傳感領(lǐng)域中的典型應(yīng)用，最后討論了SERS微流控芯片技術(shù)及在生物檢測(cè)中的應(yīng)用前景及發(fā)展方向。

2 SERS原理及發(fā)展

自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，拉曼散射一直倍受關(guān)注[10]。拉曼光譜與分子振動(dòng)能級(jí)相關(guān)，可以提供每種分子獨(dú)一無(wú)二的“指紋”信息。這使得拉曼光譜在研究物質(zhì)成份時(shí)十分方便有效。同為振動(dòng)光譜的紅外光譜(IR)技術(shù)在材料分析等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用，然而水有著很強(qiáng)的紅外吸收，容易產(chǎn)生較強(qiáng)的背景。相反地，水的拉曼散射信號(hào)非常弱，不會(huì)對(duì)樣品的信號(hào)產(chǎn)生顯著干擾。因此，在分析水溶液樣品時(shí)，拉曼光譜相比紅外光譜更有優(yōu)勢(shì)。然而，物質(zhì)的拉曼散射信號(hào)強(qiáng)度通常較低，導(dǎo)致拉曼散射光譜技術(shù)的靈敏度不高。尤其對(duì)于低濃度的痕量樣品來(lái)說(shuō)，拉曼散射信號(hào)甚至?xí)o(wú)法探測(cè)到。幸運(yùn)的是，1974年Fleischmann首次發(fā)現(xiàn)粗糙金屬表面可以極大地增強(qiáng)拉曼散射，增強(qiáng)倍數(shù)可達(dá)103～104。這一異常增強(qiáng)現(xiàn)象被稱(chēng)為SERS效應(yīng)。SERS發(fā)現(xiàn)對(duì)拉曼光譜的發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響和有力的推動(dòng)[11]。其后，人們對(duì)SERS效應(yīng)中金屬(特別是貴金屬)增強(qiáng)拉曼散射信號(hào)的原理進(jìn)行了深入的研究，目前人們廣泛認(rèn)可的增強(qiáng)機(jī)制為長(zhǎng)程電磁增強(qiáng)(electromagnetic enhancement,EE)和短程化學(xué)增強(qiáng)(chemical enhancement,CE)的協(xié)同作用[12]。

金屬粒子增強(qiáng)局部電磁場(chǎng)強(qiáng)的能力主要來(lái)自于其等離激元(plasmon)的性質(zhì)。等離激元為金屬的自由電子的振蕩。等離激元可分為發(fā)生在宏觀(guān)表面的表面等離激元極子(surface plasmon polaritons,SPP)和發(fā)生在納米結(jié)構(gòu)中的局域表面等離激元(localized surface plasmons,LSP)。圖1(a)可以顯示出這一過(guò)程。振蕩的電子云與電磁場(chǎng)矢量相反方向運(yùn)動(dòng)，在入射光激發(fā)下金屬納米粒子會(huì)產(chǎn)生自己的偶極子場(chǎng)來(lái)增強(qiáng)局域光場(chǎng)。當(dāng)入射光接近局域表面等離子體共振(LSPR)頻率時(shí)場(chǎng)增強(qiáng)效果會(huì)變得更好。當(dāng)增強(qiáng)的入射光激發(fā)附近的拉曼分子時(shí)，散射出來(lái)的場(chǎng)又會(huì)被金屬納米粒子增強(qiáng)(圖1(c)～1(d))。于是有了SERS增強(qiáng)的經(jīng)典公式：

(1)

式中，Eloc為局域場(chǎng)的振幅，E0為入射場(chǎng)的振幅，εm為金屬納米粒子的介電常數(shù)，εs為環(huán)境的介電常數(shù)(圖1(b))。由公式(1)也可推斷出最理想的增強(qiáng)金屬為銅、銀和金，因?yàn)檫@些金屬不僅吸光度低，并且可以在光學(xué)頻率上支持局域表面等離子體共振。處在電磁場(chǎng)的納米結(jié)構(gòu)在其尖端或邊緣增強(qiáng)因子最強(qiáng)，可達(dá)到1010數(shù)量級(jí)。如果將拉曼分子置于納米粒子表面的這些位置，可以得到非?？捎^(guān)的SERS信號(hào)。

圖1 (a)電子云振蕩的圖示，對(duì)于小于光波長(zhǎng)的納米粒子而言其電子云振蕩方向與電場(chǎng)矢量方向相反;(b)描繪正文中公式1的參數(shù);(c)在光激發(fā)下金屬納米粒子發(fā)射的偶極子場(chǎng);(d)入射場(chǎng)和出射場(chǎng)的電磁增強(qiáng) Fig.1 (a)Illustration of the oscillating electron cloud, which moves in opposite direction of the electric field vector, for a nanoparticle smaller than the wavelength of light; (b)depiction of the parameters used in eq 1 of the main text; (c)emitted dipole field of a metallic nanoparticle under light excitation; (d)EE of both the incident field and the scattered field

相對(duì)電磁增強(qiáng)而言，化學(xué)增強(qiáng)是一種非常短程的效應(yīng)，只影響到吸附在金屬表面或者幾埃(?)范圍內(nèi)的拉曼分子，而且增強(qiáng)因子通常也比較小，只有101～102。化學(xué)增強(qiáng)的機(jī)制產(chǎn)生于一個(gè)自由分子被金屬表面吸引時(shí)電子結(jié)構(gòu)的改變，有4種過(guò)程可以產(chǎn)生這種化學(xué)增強(qiáng)：吸附在金屬表面分子極化度的增加；分子-金屬?gòu)?fù)合物的電子轉(zhuǎn)移共振；共振散射的增強(qiáng)以及等離子體共振的增強(qiáng)。這4種過(guò)程互相關(guān)聯(lián)，很難單獨(dú)量化每一個(gè)成分對(duì)化學(xué)增強(qiáng)總體的貢獻(xiàn)。

于是SERS信號(hào)強(qiáng)度的增強(qiáng)因子(EF)可以由電磁增強(qiáng)(EE)和化學(xué)增強(qiáng)(CE)相乘得到(EF=EE×CE)。而這兩種增強(qiáng)因子較難量化，因此一般利用以下公式計(jì)算增強(qiáng)因子：

(2)

式中，ISERS和IRFM分別表示待測(cè)物的SERS信號(hào)強(qiáng)度和未經(jīng)增強(qiáng)的拉曼散射信號(hào)強(qiáng)度，Nsurface和Nbulk分別表示SERS和拉曼散射檢測(cè)中被激發(fā)待測(cè)分子數(shù)。有關(guān)SERS的報(bào)道中，增強(qiáng)因子從107～1015不等。在實(shí)際研究中拉曼分子的SERS增強(qiáng)效果會(huì)被很多因素影響，例如分子-金屬的相互作用、激發(fā)光以及SERS基底。

對(duì)于金屬表面的拉曼分子而言，分子取向會(huì)影響SERS光譜。如果局域電場(chǎng)的極化與金屬表面垂直，則吸附分子的拉曼模式中垂直于表面的極化張量被選擇性增強(qiáng)。這一選擇性增強(qiáng)造成的結(jié)果是，不同濃度下SERS光譜中有新的峰出現(xiàn)或有的峰消失，尤其是被測(cè)拉曼分子中有很多不同的官能團(tuán)時(shí)這一現(xiàn)象更容易出現(xiàn)。這種現(xiàn)象最早由表面選擇規(guī)則(Surface Selection Rules,SSR)描述[13]。高度對(duì)稱(chēng)的分子散射主要取決于與對(duì)稱(chēng)相關(guān)的選擇性規(guī)則，如中心對(duì)稱(chēng)的分子吸附到金屬表面時(shí)其對(duì)稱(chēng)性被破壞而使不同的峰被增強(qiáng)。

對(duì)于激光的影響，主要是當(dāng)激發(fā)等離子激元的激光頻率與分子能量相當(dāng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生表面增強(qiáng)共振拉曼散射(SERRS)，拉曼信號(hào)會(huì)得到極大的增強(qiáng)[14]。雖然等離子激元共振頻率很難精確的匹配分子的電子轉(zhuǎn)移頻率，但在實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)，即使二者相差250 nm左右時(shí)依然可以激發(fā)SERRS。與SERS相比，SERRS中的增強(qiáng)因子會(huì)有由共振引起的額外的增強(qiáng)效應(yīng)，但SERRS所得到的強(qiáng)度很大程度上依賴(lài)于激發(fā)波長(zhǎng)。

值得注意的是，SERS基底對(duì)SERS信號(hào)的影響十分顯著，因此SERS基底是很多研究的重點(diǎn)[15]。由于金、銀等貴金屬的SERS增強(qiáng)效果最佳，一般的SERS研究都以金、銀或其合金作為基底。在SERS基底中，能提供拉曼增強(qiáng)的區(qū)域被稱(chēng)為熱點(diǎn)(hot spot)，主要為納米粒子的聚集處。熱點(diǎn)處的電場(chǎng)被極大地增強(qiáng)，從而產(chǎn)生顯著的拉曼增強(qiáng)。至今，研究者們已經(jīng)提出了各種各樣的SERS基底，而這些基底中必不可少的就是為SERS增強(qiáng)做主要貢獻(xiàn)的熱點(diǎn)區(qū)。Song等人[16]的綜述文章中將熱點(diǎn)的發(fā)展分為三代。

第一代SERS基底為簡(jiǎn)單的納米粒子結(jié)構(gòu)，如圖2(a)～2(c)。這類(lèi)SERS基底通常是具有特殊幾何形貌的金屬納米粒子，他們的尖角或邊緣等處可形成有效的熱點(diǎn)。因此雖然結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，也可以獲得較大的拉曼增強(qiáng)效果。典型的代表有，球形金納米顆粒[17]、球形銀納米顆粒[18]、棒狀金納米顆粒[19]、星形金納米顆粒[20]、三角形銀納米顆粒等[21]。我們課題組也制備出了多種SERS基底，例如金納米星[22]、金納米團(tuán)簇[23]、銀納米棱鏡[24]等(圖2(d)～2(f))。

圖2 (a)金納米粒子的TEM圖；(b)銀納米粒子的TEM圖；(c)鹽酸處理過(guò)的金納米棒的TEM圖；(d)金納米星的TEM圖；(e)4MBA標(biāo)記的金團(tuán)聚體的TEM圖；(f)銀納米棱鏡的TEM圖 Fig.2 TEM image of (a)AuNPs; (b)AgNPs; (c) HCl-treated GNRs; (d)gold nanostars; (e)4MBA-labeled Au aggregates; (f)Ag nanoprisms

第二代SERS基底為納米粒子組裝體，通過(guò)組裝體內(nèi)粒子間的電磁場(chǎng)耦合作用產(chǎn)生熱點(diǎn)以達(dá)到SERS增強(qiáng)的效果。圖3是典型的多聚體[25]、納米衛(wèi)星[26]的TEM照片。制備這種納米組裝體時(shí)，通常需要精密的設(shè)計(jì)。例如，可通過(guò)靜電作用、DNA或小分子等進(jìn)行納米顆粒的組裝，并對(duì)組裝實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化以保證一定的產(chǎn)率。得益于豐富的熱點(diǎn)，利用這類(lèi)納米粒子組裝體作為SERS基底時(shí)，獲得的SERS信號(hào)強(qiáng)度能比第一代SERS基底高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖3 (a)L形納米三聚體的TEM圖，在二氧化硅殼內(nèi)包裹三個(gè)修飾PCEPE的金核；(b)3D自組裝等離子體超結(jié)構(gòu)的TEM圖，在硅殼內(nèi)包裹80納米金核和眾多單分散的20納米金納米衛(wèi)星粒子 Fig.3 (a)TEM image of an L-shaped trimer nanoantenna comprised of three Au cores functionalized with PCEPE (structure shown) and encapsulated in a SiO2 shell; (b)TEM images of 3D self-assembled plasmonic superstructure comprising a silica-encapsulated 80 nm Au core and multiple monodisperse 20 nm Au satellite particles

第三代SERS基底指有序的陣列基底，它們可以提供更均勻的SERS增強(qiáng)效果。從整體上看，前兩代SERS基底具有較隨機(jī)的結(jié)構(gòu)，即便是同批制備的基底(例如金納米星)，彼此之間的SERS增強(qiáng)因子差別仍可能較大，使得SERS信號(hào)的均一性不佳。第三代有序陣列SERS基底在第一、二代基底的基礎(chǔ)上，將第一、二代SERS基底與硅、PDMS等基質(zhì)材料結(jié)合，制作均勻的陣列結(jié)構(gòu)。例如，使第一代或第二代基底在硅襯底上以一定的規(guī)律排布，即可獲得按規(guī)律排列的熱點(diǎn)陣列。如圖4，經(jīng)典的第三代SERS基底有納米天線(xiàn)陣列[27]、納米柱陣列[28]、SHINERS陣列[29]、納米球平板印刷(NSL)陣列[30]等。這些陣列基底的制備大多采用物理方法，利用高度發(fā)達(dá)的納米工藝對(duì)材料的形貌實(shí)現(xiàn)精密的控制。規(guī)則的陣列可以使SERS熱點(diǎn)排布更加均勻，測(cè)得的信號(hào)也具有良好的可重復(fù)性及可靠性。SERS基底制備工藝的發(fā)展對(duì)推進(jìn)SERS的應(yīng)用起到了關(guān)鍵作用。正是由于SERS基底有著如此多元的制作方法和工藝，使人們可以方便地賦予SERS很多功能，因而SERS正逐漸被應(yīng)用于越來(lái)越廣泛的領(lǐng)域。

圖4 (a)BT修飾的Ag-PAO模板的SEM圖，由氧化鋁基質(zhì)在0.1 M氫氧化鈉溶液中部分分解得到；(b)52°傾角的帶有6納米IPS和150 nm硅納米柱的NOSP二聚體SEM圖；(c)非接觸模式TERS；(d)SHINER：殼分離模式；(e)用納米球印刷術(shù)制成的規(guī)則SERS基底方法示意圖 Fig.4 (a)SEM image of BT-modified Ag-PAO templates obtained by partial dissolution of the alumina matrix in 0.1 M aqueous NaOH; (b)SEM image at a 52° tilted view of the NOSP dimers with a 6-nm IPS and 150-nm Si pillar height; (c)Tip-enhanced Raman spectroscopy: noncontact mode; (d)SHINERS: shell-isolated mode; (e)schematic diagram of template methods using nanosphere lithography to fabricate ordered nanostructured SERS-active substrates

3 SERS生物傳感

圖5 (a)基于金納米粒子-金納米棒復(fù)合體檢測(cè)BPA的SERS適體探針示意圖；(b)檢測(cè)ATP的SERS比率計(jì)硅片適體探針示意圖；(c)銀@介孔硅@銀三層核殼結(jié)構(gòu)納米粒子制備流程示意圖；(d)合成19種SERS編碼納米粒子的編碼、結(jié)構(gòu)及光譜 Fig.5 (a)Scheme of SERS aptasensor for the detection of BPA based on gold nanoparticle-nanorod heteroassembly; (b)Schematic illustration of the ratiometric silicon SERS aptasensor for ATP detection; (c)proposed preparation process of Ag@MSiO2@Ag TCSNPs; (d)codes, structures and measured spectra of the synthesized 19 SERS encoders

在生物檢測(cè)應(yīng)用中，SERS逐漸發(fā)展成為一種最常用的多功能方法之一。與其他傳統(tǒng)的生物檢測(cè)手段相比，SERS檢測(cè)突出的優(yōu)點(diǎn)包括極窄的峰寬、高靈敏度多元檢測(cè)能力和較寬的動(dòng)態(tài)范圍等。構(gòu)建功能化的SERS探針是SERS生物應(yīng)用中的一個(gè)重要前提。一般而言，在SERS基底上修飾拉曼分子和特定的生物靶向分子就可以獲得面向生物傳感應(yīng)用的SERS光學(xué)探針。圍繞SERS探針進(jìn)行的生物傳感與檢測(cè)成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一[31]。設(shè)計(jì)該類(lèi)探針時(shí)要考慮到以下幾個(gè)方面：SERS活性，靶向效率,納米結(jié)構(gòu)及光學(xué)特性的穩(wěn)定性及多元檢測(cè)能力等。為實(shí)現(xiàn)特定的生物探測(cè)功能，通常會(huì)在SERS探針的表面修飾特定的生物靶標(biāo)分子，如抗體、DNA等。已有報(bào)道中，典型的SERS探針結(jié)構(gòu)如圖5所示。Feng Jingjing等人將金納米粒子通過(guò)DNA適體連接在金納米棒兩端制成探針[32]，利用在金納米粒子與金納米棒之間非常狹窄的縫隙極強(qiáng)的電磁增強(qiáng)得到顯著的初始SERS信號(hào)(圖5(a))。連接二者的適體同時(shí)可以作為識(shí)別分子與待測(cè)物BPA反應(yīng)而使金納米粒子從納米棒上脫離，導(dǎo)致SERS信號(hào)的減弱。故這里的SERS信號(hào)強(qiáng)度與待測(cè)物的濃度成反比關(guān)系。類(lèi)似的結(jié)構(gòu)還有在金納米星外通過(guò)適體DNA連接銀納米粒子而形成衛(wèi)星型復(fù)合結(jié)構(gòu)[33]，其中DNA適體的優(yōu)點(diǎn)之一是提高了對(duì)待測(cè)物的靶向性。Shi Huayi等人設(shè)計(jì)了一種基于適體的探針(圖5(b))，可以特異性的識(shí)別待測(cè)物ATP并形成環(huán)狀的復(fù)合物，從而使一開(kāi)始與其雜交的兩條單鏈DNA分離，最終導(dǎo)致修飾的兩個(gè)拉曼分子的SERS信號(hào)產(chǎn)生差異而形成SERS比率計(jì)型探針[34]。由于靶標(biāo)分子要識(shí)別待測(cè)物而使探針整體暴露在環(huán)境中，增加了環(huán)境中的分子對(duì)探針信號(hào)影響的風(fēng)險(xiǎn)。Jiang Tao等人在銀納米粒子外包裹一層介孔硅[35]，再在硅殼上吸附一層銀納米粒子形成三層的復(fù)合結(jié)構(gòu)，在保證SERS信號(hào)強(qiáng)度的前提下提升了探針的穩(wěn)定性(圖5(c))。

圖6 (a)A：實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)示意圖。B：基于SERS的側(cè)向流條帶實(shí)驗(yàn)定量檢測(cè)HIV-1 DNA的檢測(cè)原理。(C為對(duì)照組，T為實(shí)驗(yàn)組)；(b)銀納米金字塔由DNA框架自組裝SERS分析生物標(biāo)志物示意圖。C：通過(guò)外泌體、磁球和SERS探針間免疫識(shí)別形成的三明治結(jié)構(gòu)；(c)利用BODIPY修飾的納米粒子SERS成像示意圖；(d)SERS探針與基因組DNA的雜交原理示意圖 Fig.6 (a)A:Schematic illustration of the configuration. B:The measurement principle of the SERS-based lateral flow assay for quantification of HIV-1 DNA.(C is the control line and T is the test line); (b)Scheme of Ag pyramids self-assembled by DNA frame for SERS analysis of biomarkers; (c)schematic representation of the targeted SERS imaging using aza-BODIPY attached to NPs; (d)schematic Illustration of the Hybridization between the SERS Nanoprobes and Genome DNA

在合成出功能化的SERS探針之后，即可利用它們進(jìn)行目標(biāo)物的檢測(cè)。常見(jiàn)的待測(cè)物包括DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、藥物、離子等。DNA作為一種生物標(biāo)記物在一些疾病診療上扮演著重要的角色，而Fu Xiuli等人就選取了HIV-1 DNA作為目標(biāo)物并設(shè)計(jì)了側(cè)向流(LF)條帶實(shí)驗(yàn)來(lái)定量檢測(cè)分析(圖6(a))[36]。側(cè)向流條帶被認(rèn)為是一種出色的現(xiàn)場(chǎng)護(hù)理診斷工具，其與SERS的聯(lián)用可以解決低濃度檢測(cè)等問(wèn)題，也證明了SERS可以與很多平臺(tái)兼容互補(bǔ)。在腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)中，蛋白質(zhì)尤其是抗原的檢測(cè)占據(jù)了很大的比例。Liguang等人利用DNA適體將銀納米粒子組裝成金字塔結(jié)構(gòu)作為SERS探針[37]，可以檢測(cè)前列腺抗原(PSA)、凝血酶和粘蛋白三種目標(biāo)分子(圖6(b))。除了小分子的生物標(biāo)志物，細(xì)胞也是SERS進(jìn)行生物檢測(cè)的目標(biāo)之一。Nagappanpillai等人將熒光染料BODIPY當(dāng)作拉曼分子制成SERS探針并用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞(圖6(c))，這種納米探針的識(shí)別效率非常高并且可以進(jìn)行細(xì)胞成像[38]。我們研究組在SERS的生化檢測(cè)方面也做了大量的研究工作，例如端粒酶活性檢測(cè)[39]、蛋白質(zhì)免疫檢測(cè)[40]、汞離子檢測(cè)[41]、農(nóng)藥檢測(cè)[42]等。其中，端粒酶的長(zhǎng)度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中用著絲粒的SERS強(qiáng)度作為內(nèi)標(biāo)排除其他因素對(duì)SERS信號(hào)的影響，用端粒酶與著絲粒探針強(qiáng)度的比來(lái)確定端粒酶長(zhǎng)度(圖6(d))。這種SERS原位雜交(in situ hybridization)的靈敏度非常高，可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)端粒酶的檢測(cè)。

此外，利用SERS光譜十分窄的特點(diǎn)，人們提出了基于SERS的光譜編碼技術(shù)，生成的光譜碼可以用于多元待測(cè)物的同時(shí)檢測(cè)。我們提出了一種波長(zhǎng)-光強(qiáng)雙編碼的SERS探針(圖5(d))[43]。利用3種拉曼分子的光譜以及強(qiáng)度兩類(lèi)不同信息的組合，可得到多達(dá)19種不同的SERS光譜。Lai Yuming等人選了5種拉曼分子進(jìn)行編碼制成SERS探針并用PS微球裝載(圖7(a))，獲得了31種不同光譜編碼的PS球[44]。值得注意的是，將SERS光譜與其他光學(xué)手段結(jié)合可以顯著提高可編碼容量。例如，我們提出了一種SERS-熒光共編碼的光學(xué)編碼新方法(SFJSE)，并利用有機(jī)-金屬-量子點(diǎn)復(fù)合納米結(jié)構(gòu)構(gòu)筑了一類(lèi)SFJSE光學(xué)編碼微球作為探針(圖7(b))[45]。這種SFJSE編碼方案借助熒光-SERS聯(lián)合光譜拓展了可編碼光譜的有效范圍，與傳統(tǒng)單一熒光信號(hào)編碼方法相比，可編碼數(shù)量獲得了指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。此外，通過(guò)不同種編碼分子錯(cuò)層分布的策略簡(jiǎn)化了編碼微球的設(shè)計(jì)方案，并大大減輕了信號(hào)串?dāng)_、制備復(fù)雜等問(wèn)題，對(duì)于獲得大編碼容量的微球具有積極意義。

圖7 (a)A：硅殼金納米粒子探針的SERS光譜(左)及拉曼分子的分子結(jié)構(gòu)(右)。B：使用不同拉曼分子的SERS標(biāo)簽典型的拉曼光譜(左)及相應(yīng)的編碼(右)。(b) 合成的15種納米粒子的構(gòu)成、光譜和編碼 Fig.7 (a)A:SERS spectra of AuNPs-Ra@SiO2(left) and molecular structures of Raman reporters employed in this study(right). B:Typical Raman spectra(left) on microbeads with different types of SERS label using different Raman reporter (10000, 01000, 00100,00010, 00001 and 11111) and their corresponding spectral barcodes(right). (b)Composition, measured spectra, and codes of the synthesized 15 nanoparticles

除了高通量檢測(cè)本領(lǐng)之外，基底對(duì)拉曼散射信號(hào)的增強(qiáng)作用使得SERS具有與熒光相當(dāng)?shù)臋z測(cè)靈敏度。因此，SERS技術(shù)在生物傳感的應(yīng)用中展現(xiàn)出了優(yōu)異的檢測(cè)性能。另一方面，SERS檢測(cè)技術(shù)也有局限性。比如，SERS檢測(cè)的步驟相對(duì)繁瑣以及可重復(fù)性相對(duì)較低等。因此，開(kāi)發(fā)高效、可重復(fù)、自動(dòng)化的SERS檢測(cè)技術(shù)成為推廣SERS實(shí)際應(yīng)用時(shí)亟待解決的問(wèn)題之一。近年來(lái)迅速發(fā)展的微流控芯片技術(shù)為人們提供了一種很好的解決方案。

4 微流控SERS檢測(cè)芯片及其生物傳感應(yīng)用

微流控芯片可將樣品預(yù)處理、目標(biāo)物分選以及檢測(cè)等多個(gè)功能集成到一塊芯片上，以流體和陣列多通道的形式縮短分析時(shí)間，為大規(guī)模高通量生物分析提供高效的實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)。微流控芯片具有高度的自由定制性及可操作性，若將SERS技術(shù)與微流控芯片技術(shù)結(jié)合，即可獲得自動(dòng)化的微流控SERS檢測(cè)芯片[46]。SERS效應(yīng)的產(chǎn)生極度依賴(lài)于SERS增強(qiáng)基底。因此，微流控SERS檢測(cè)芯片的一大關(guān)鍵是將SERS基底引入芯片中。根據(jù)芯片上SERS基底的類(lèi)型可以將微流控SERS檢測(cè)芯片(SERS-LoC)簡(jiǎn)單地分為三種：液態(tài)、固態(tài)及原位生長(zhǎng)基底芯片。

液態(tài)基底是最早在微流控SERS檢測(cè)芯片中使用的基底。這種基底的操作方法簡(jiǎn)單，并且可以直接利用微流中液體流動(dòng)的特性進(jìn)行散熱，從而避免大功率激光對(duì)待測(cè)分子造成的光熱損傷。最簡(jiǎn)單的方法是直接將制備好的金屬納米粒子通入微流通道內(nèi)作為SERS檢測(cè)的基底。如圖8(a)，將銀膠通入微流通道內(nèi)時(shí)，銀膠與修飾拉曼分子的DNA連接，形成基底-拉曼分子結(jié)構(gòu)，最終落在SERS檢測(cè)區(qū)進(jìn)行檢測(cè)[47]。液態(tài)的SERS基底最顯著的優(yōu)點(diǎn)是可以在微流芯片內(nèi)流動(dòng)，從而與拉曼分子充分混合。類(lèi)似的還有圖8(b)中的研究[48]，都是將制備好的金屬納米粒子通入微流通道。在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其反應(yīng)微環(huán)境相對(duì)可控，增加了實(shí)驗(yàn)的可靠性并能在一定程度上可以提高檢測(cè)的靈敏度。此外，另一種液態(tài)基底利用微流控芯片良好的操控性，控制納米粒子流動(dòng)并讓其聚集在理想的區(qū)域或者形成規(guī)則密集的聚集體。這些可控的納米粒子聚集體可以提供大量的SERS熱點(diǎn)，因而更有效地增強(qiáng)拉曼信號(hào)。目前，這種將流入芯片的納米粒子捕獲在一定區(qū)域，并控制納米粒子的形貌、濃度等特征，使其形成納米聚集體成為了液態(tài)基底的又一研究方向。如圖8(c)，在PDMS芯片上設(shè)置一個(gè)氣閥，通過(guò)壓力控制擠壓其變形，從而阻止金納米粒子通過(guò)而聚集在SERS檢測(cè)區(qū)形成聚集體。在檢測(cè)完畢后釋放壓力使芯片恢復(fù)，則金納米粒子可以通過(guò)并被清洗掉[49]。然而，這種基于阻塞流通的聚集體形成方法對(duì)納米粒子的形貌要求較高，且形成速度較慢。圖8(d)給出了另一種可控納米聚集體的形成方法[50]。Hyundoo等人設(shè)計(jì)了三層的微流控平臺(tái)：透明電極上的光導(dǎo)層、液體空腔及接地電極。當(dāng)光導(dǎo)層被電磁激發(fā)時(shí)，電流通過(guò)光照區(qū)域在空腔內(nèi)形成一個(gè)不均勻的電場(chǎng)，致使金屬納米粒子集中起來(lái)形成一個(gè)聚集體。并且通過(guò)改變光照區(qū)域可以在不同位置形成SERS基底。這一巧妙的設(shè)計(jì)可以很方便的將最簡(jiǎn)單的納米粒子聚集在微流芯片上形成需要的聚集體作為基底使SERS信號(hào)得到極大增強(qiáng)。

在微流芯片內(nèi)引入液態(tài)基底的方法簡(jiǎn)單方便，但液態(tài)基底的顯著問(wèn)題是液體的流動(dòng)性導(dǎo)致基底形貌不均勻，進(jìn)而使其產(chǎn)生的熱點(diǎn)分布不均衡。后果是同一批次實(shí)驗(yàn)通道內(nèi)不同位置的SERS信號(hào)強(qiáng)度差異較大，均一性不好。雖然研究者提出了可重復(fù)性的基底作為改進(jìn)，但能更好的解決這一問(wèn)題的方案就是使用固態(tài)的SERS基底。近年來(lái)，由于制作工藝發(fā)展突飛猛進(jìn)，許多應(yīng)用在PDMS上的固態(tài)基底研究被報(bào)道出來(lái)。如圖9(a)，Young等人先用熱蒸發(fā)法在PDMS上鍍一層銀，再用氧等離子處理后與玻璃鍵合形成微流通道。同時(shí)氧等離子體處理后可以在平展的銀表面生成一些粗糙的微結(jié)構(gòu)以增加熱點(diǎn)而增強(qiáng)SERS信號(hào)[51]。在這些精心設(shè)計(jì)的SERS基底中，一些3D等離子體的結(jié)構(gòu)由于其大面積可吸附分析物的性質(zhì)吸引了很多研究者的注意。如圖9(b)，在柱形硅陣列上濺射一層薄薄的銀后形成一種被稱(chēng)為納米柱森林(nanopillar forest)的基底結(jié)構(gòu)被應(yīng)用在微流芯片內(nèi)[52]。這一結(jié)構(gòu)最突出的特點(diǎn)是其良好的可重復(fù)性，據(jù)報(bào)道在檢測(cè)時(shí)相對(duì)誤差只有13%。

圖8 (a)集成DNA競(jìng)爭(zhēng)取代序列檢測(cè)的SERRS微流微系統(tǒng)。修飾DNA探針-報(bào)告分子對(duì)的二氧化硅微球(插圖)充滿(mǎn)一個(gè)區(qū)塊。當(dāng)目標(biāo)序列引入到入口時(shí)，拉曼分子的鏈被取代。它們沿著通道流動(dòng)時(shí)與金屬納米聚集體混合并被捕獲在微流芯片中的SERRS檢測(cè)區(qū)域。(b)A：基于SERS競(jìng)爭(zhēng)吸附免疫檢測(cè)的螺旋線(xiàn)雙通道微流傳感器示意圖。傳感器由兩個(gè)平行的通道組成：一個(gè)檢測(cè)PGA(淺灰)，另一個(gè)作對(duì)照(深灰)。B：注滿(mǎn)四種不同顏色墨水的芯片圖像。C：磁性免疫檢測(cè)的捕獲區(qū)域圖。(c)用帶氣閥的通道捕獲與釋放金納米粒子進(jìn)行SERS檢測(cè)的示意圖。(d)光電微流SERS光譜。小量樣品的光電微流設(shè)備集成到一個(gè)傳統(tǒng)的SERS檢測(cè)系統(tǒng)。用一個(gè)激光光源可以同時(shí)達(dá)到使金屬納米粒子聚集和SERS信號(hào)的檢測(cè)的目的 Fig.8 (a)Microfluidic SERRS microsystem with integrated competitive displacement for DNA sequence detection. Silica microspheres functionalized with DNA probe-reporter pairs(inset) are packed against a frit. When the target sequence is introduced at the inlet, Raman-labeled reporter oligos are displaced. As they flow along the channel, they are mixed with metal nanoclusters and trapped in the microfluidic SERRS detection region. (b)A:Schematic illustration of the solenoid-embedded dual channel microfluidic sensor for SERS-based competitive immunoassay. The sensor is composed of two parallel channels: one for PGA sensing(light gray) and the other for control(dark gray). B:optical images of the solenoid chip filled with four different colors of inks. C:photograph of the capture area for magnetic immunocomplexes. (c)Schematics of trapping and releasing of gold nanoparticles using a modified pneumatic microvalve for SERS detection. (d)Experimental setup for optoelectrofluidic SERS spectroscopy. An optoelectrofluidic device containing a tiny volume of sample droplet is integrated into a conventional SERS detection system. Both concentration of metal nanoparticles for SERS enhancement and detection of SERS signal are simultaneously achieved with a single laser source

圖9 (a)光流控芯片的制做流程；(b)納米柱森林的制造流程及其SEM圖 Fig.9 (a)Device fabrication of the optofluidic SERS chip; (b)Fabrication process for nanopillar forests and SEM images of the obtained nanopillars

圖10 (a)在微流芯片內(nèi)激光制造SMA的示意圖；(b)A：微流芯片內(nèi)三個(gè)模塊示意圖，分別用紅、綠和藍(lán)色方塊表示注射、混合和光學(xué)檢測(cè)功能區(qū)。B：光引導(dǎo)銀納米聚集體的形成過(guò)程及原位SERS檢測(cè)。注射區(qū)的硝酸銀、水、CV和檸檬酸鈉溶液用不同顏色表示。微流通道內(nèi)的流動(dòng)用白色箭頭指示 Fig.10 (a)Scheme for laser fabrication of SMAs inside a microfluidic channel; (b)A:schematic of microfluidic chip with three modules functioning as injection, mixing, and optical detection marked by the red, green, and blue squares, respectively. B:the procedure of photoinduced growth of silver nanoaggregates and in situ SERS measurements. The solutions of AgNO3, H2O, CV and sodium citrate in the injection module are represented by different colors. The flow in the microchannel is indicated by the white arrows

此外，還有一類(lèi)微流控芯片直接在微流芯片內(nèi)部實(shí)現(xiàn)基底的制備并用于檢測(cè)，被稱(chēng)作原位(in situ)生長(zhǎng)的SERS基底。如圖10(a)，Xu B B等人用飛秒激光器引導(dǎo)光致還原[53]，在通道內(nèi)生成銀微花形結(jié)構(gòu)陣列，每一個(gè)單體的表面都非常粗糙，以此為基底可以產(chǎn)生很強(qiáng)的SERS增強(qiáng)效果。類(lèi)似的，Yan W等人在微流內(nèi)利用光化學(xué)還原銀納米聚集體[54]，并發(fā)現(xiàn)在第一次光照還原生成納米粒子后將其洗去接著第二次在相同的激光下再次生成大量細(xì)小的銀納米粒子，這一關(guān)鍵的步驟直接導(dǎo)致在通道內(nèi)產(chǎn)生了大量的熱點(diǎn)，而使得在檢測(cè)SERS信號(hào)時(shí)可以增強(qiáng)一個(gè)數(shù)量級(jí)(圖10(b))。

隨著微流芯片內(nèi)SERS基底制備技術(shù)的不斷改進(jìn)與優(yōu)化，SERS信號(hào)的靈敏度、特異性和可重復(fù)性得到了進(jìn)一步的改善。微流控芯片與SERS技術(shù)二者的協(xié)同作用使得SERS-微流芯片(SERS-LoC)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[55]。

4.1 生物檢測(cè)

SERS的特異性與無(wú)損特性使其非常適合生物醫(yī)學(xué)方面的研究。再加上微流芯片的穩(wěn)定性、靈活性與微量樣品檢測(cè)的特性，目前，SERS-LoC的生物檢測(cè)應(yīng)用取得了不少突出的進(jìn)展[56-67]。

圖11 (a)在硅片上修飾銀納米粒子作為基底集成在微流芯片上，A：一步法，B：兩步法檢測(cè)miRNA；(b)基于SERS的液滴微流傳感器免清洗的磁性免疫檢測(cè)示意圖。這種傳感器由5個(gè)部分組成，功能如下：i液滴生成及試劑混合；ii形成磁性免疫復(fù)合物；iii磁鐵分離免疫復(fù)合物；iv含有上清的更大的液滴生成來(lái)進(jìn)行SERS檢測(cè)；v含有磁性免疫復(fù)合物的更小的液滴生成；(c)微流芯片構(gòu)成及概念示意圖。細(xì)胞預(yù)先標(biāo)記腫瘤特異性與對(duì)照探針(后者兩種細(xì)胞都有修飾)，再注入芯片中，流向中心匯集后通過(guò)拉曼激光照射；(d)微流芯片示意圖：A：頂視圖 B：側(cè)視圖。這一設(shè)備有兩層：液體流動(dòng)層(黑線(xiàn))和調(diào)節(jié)流動(dòng)層連接的控制層(粉色和藍(lán)色圖案)。在側(cè)視圖中芯片由3個(gè)功能區(qū)域組成。區(qū)域I：細(xì)胞培養(yǎng)池(癌細(xì)胞)；區(qū)域II：抗體條碼(不同通道內(nèi)基底與抗體相匹配)；區(qū)域III：細(xì)胞培養(yǎng)池(免疫細(xì)胞被基底上的抗體捕獲) Fig.11 (a)Microfluidic chip integrating pSi membranes decorated by Ag NPs and detection schemes of miRNA by A:one-step hybridization assay, B:two-step hybridization assay; (b)schematic illustration of the SERS-based microdroplet sensor for wash-free magnetic immunoassay. The sensor is composed of five compartments with the following functions: (i)droplet generation and reagent mixing, (ii)formation of magnetic immunocomplexes, (iii)magnetic bar-mediated isolation of immunocomplexes, (iv)generation of larger droplets containing the supernatant for SERS detection and (v)generation of smaller droplets containing magnetic immunocomplexes; (c)schematic of setup and concept. Cells, prelabeled with a cocktail of cancer-specific(NRP) and control(UC) SBTs (the latter binding both cell types), are injected into the device, where they are flow-focused before passing through the Raman laser; (d)schematic illustration of a microfluidic chip: A: top view and B: side view. The device contains two layers: a flow layer (black line) for transport of fluids and a control layer(pink and blue pattern) to regulate the connections in the flow layer. In the side view, the chip is composed of three functional sections. Section I the cell culture chamber (cancer cells); section II:antibody barcode(the substrate is patterned with various antibodies in different channels); section III:the cell culture chamber(immune cells are captured by the antibody on the substrate)

與在溶液中類(lèi)似的檢測(cè)原理，在微流控芯片中也可以利用SERS光譜來(lái)進(jìn)行生物標(biāo)志物的檢測(cè)。miRNA是一種控制基因表達(dá)的非編碼RNA，參與了生物體的很多過(guò)程。Novara C等人在微流芯片上制作了兩種SERS基底(圖11(a))，分別檢測(cè)帶拉曼標(biāo)記的miRNA和無(wú)標(biāo)記的miRNA[58]。抗原作為最重要的腫瘤標(biāo)志物之一也被引入到SERS微流芯片中。Gao R等人制作了液滴的微流系統(tǒng)(圖11(b))，將磁球作為捕獲基底，同時(shí)加入待測(cè)物PSA和SERS探針后在微流內(nèi)充分混合[59]。最后用磁鐵將反應(yīng)生成的磁球-PSA-探針免疫復(fù)合物分離，通過(guò)檢測(cè)通道內(nèi)剩余探針的SERS信號(hào)來(lái)反映待測(cè)物的濃度。微流控芯片的一大優(yōu)勢(shì)是可以模擬體液流動(dòng)環(huán)境，這給識(shí)別并收集體內(nèi)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)提供了研究平臺(tái)。Pallaoro Alessia等人在微流通道內(nèi)注入腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的混合液并使其排成一列流動(dòng)(圖11(c))，通過(guò)激光照射區(qū)域得到SERS信號(hào)并利用兩種分析方法即主成分分析(PCA)和最小二乘法進(jìn)行分析[60]。除了直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和分析，檢測(cè)細(xì)胞分泌物作為研究細(xì)胞間通信的基礎(chǔ)也是生物檢測(cè)分析的一大課題。我們也提出了一種SERS微流芯片內(nèi)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞間通信的方法(圖11(d))[61-62]。該芯片結(jié)合了SERS光譜編碼技術(shù)與蛋白質(zhì)陣列的空間編碼技術(shù)，將大量待測(cè)樣品中蛋白質(zhì)的種類(lèi)和含量信息加載到基于SERS的三維碼中，只需通過(guò)三維碼的解碼即可獲取所有樣品中各種蛋白質(zhì)的含量信息，該檢測(cè)平臺(tái)具有信息量大、檢測(cè)靈敏度高(～10 fg/mL)、響應(yīng)速度快(30 min)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

4.2 離子檢測(cè)

小分子或離子的檢測(cè)要求檢測(cè)方法具有優(yōu)異的可靠性與靈敏度。SERS-LoC的一系列優(yōu)秀的特性使其成為檢測(cè)小分子或離子的非常有力的工具[63]。

硫氰酸離子作為評(píng)價(jià)人體健康的重要標(biāo)記分子廣泛存在于體液中，檢測(cè)體內(nèi)硫氰酸離子的濃度對(duì)臨床診斷與疾病預(yù)防很有意義。砷作為一種環(huán)境中普遍存在的污染物影響著人們的健康，圖12(a)中展示了一種間接檢測(cè)砷離子的策略[64]。Nan等人將銀納米粒子修飾谷胱甘肽(GSH)和拉曼分子作為探針，在之字形微流通道內(nèi)使砷離子與探針充分混合，其中砷離子與谷胱甘肽結(jié)合可以導(dǎo)致銀粒子的聚集從而增強(qiáng)SERS信號(hào)。這種方法可以檢測(cè)低至6.7×10-10g/mL的砷離子。我們?cè)O(shè)計(jì)了一種液滴SERS微流控系統(tǒng)[65]，將樣品與銀殼金納米棒混合形成液滴在通道內(nèi)流動(dòng)并進(jìn)行快速的SERS檢測(cè)(圖12(b))。這種方法在人血清中檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍達(dá)到4到256 μM并可以實(shí)現(xiàn)真實(shí)唾液樣本的檢測(cè)。

圖12 (a)A：用來(lái)檢測(cè)砷離子的微流芯片示意圖。砷離子與GSH/4-MPY修飾的納米粒子在之字形微流通道內(nèi)快速、充分混合(插圖)。B：砷離子的分析原理。當(dāng)砷離子與GSH/4-MPY修飾的納米粒子耦合時(shí)發(fā)生聚集，銀納米粒子上的4-MPY的拉曼信號(hào)被增強(qiáng)；(b)A：液滴微流設(shè)備的示意圖。B：銀殼金納米棒的SERS光譜(紅色)及加入硫氰酸離子后的SERS光譜(藍(lán)色) Fig.12 (a)A:schematic diagram of the microfluidic chip used for analyzing the As(III) ions. The rapid, full mixing of the As(III) ions and GSH/4-MPY functionalized AgNPs achieved in a zigzag(75 angles) microfluidic channel(inset). B:the analytical principle for As(III) ions. When As(III) ions couple with GSH/4-MPY functionalized AgNPs, aggregation occurs and the Raman signals are improved when 4-MPY is adsorbed on the surface of the AgNPs; (b)A:schematic illustration of the droplet microfluidic device. B:SERS spectra of CTAB-stabilized Au@Ag NRs(red curve) and Au@Ag NRs with the addition of SCN-(blue curve)

4.3 便攜的SERS-LoC

利用高集成度的芯片可以在一塊芯片上完成整個(gè)復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)，使得微流芯片直接代替了實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，微小的尺寸使其有很好的便攜性，可在任意地方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。然而對(duì)于SERS而言，由于檢測(cè)時(shí)需要光學(xué)校準(zhǔn)和對(duì)焦等復(fù)雜過(guò)程，將SERS-LoC做成便攜的設(shè)備成為不小的挑戰(zhàn)。近來(lái)，光流控(optofluidic)的發(fā)展解決了這一困難[66]。如圖13(a)，Soroush等人將光纖元件集成到微流芯片上消除了SERS檢測(cè)時(shí)光學(xué)對(duì)焦等負(fù)擔(dān)[67]，使現(xiàn)場(chǎng)(on-site)SERS檢測(cè)成為可能。除此之外，手持的拉曼光譜儀也可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)SERS的現(xiàn)場(chǎng)分析[68]。圖13(b)顯示了Kim等人提出的將芯片內(nèi)的納米柱陣列作為SERS基底，運(yùn)用手掌大小的便攜拉曼光譜儀進(jìn)行在現(xiàn)場(chǎng)的SERS檢測(cè)牛奶中的三聚氰胺[69]。這種簡(jiǎn)便的拉曼光譜儀并沒(méi)有降低檢測(cè)靈敏度，實(shí)驗(yàn)在水溶液中檢測(cè)限達(dá)到1.2×10-10g/mL，而在奶粉提取物中檢測(cè)限為1.0×10-10g/mL，均達(dá)到了FDA要求的標(biāo)準(zhǔn)。隨著更多簡(jiǎn)易方便的平臺(tái)被研究出來(lái)[70]，為現(xiàn)場(chǎng)SERS檢測(cè)而準(zhǔn)備的便攜設(shè)備越來(lái)越成熟。

圖13 (a)A：光流控SERS微系統(tǒng)示意圖。B：光流控SERS系統(tǒng)。C：充滿(mǎn)的微球和集成的光纖；(b)牛奶中三聚氰胺檢測(cè)的比較使用A：標(biāo)準(zhǔn)的FDA過(guò)程和B：我們的納米柱檢測(cè)方案。在顯示金納米柱芯片用于分子檢測(cè)同時(shí)展示的具有代表性的SEM圖為打開(kāi)(左)和關(guān)閉(右)的金納米柱五聚物分別對(duì)應(yīng)處理過(guò)濾的牛奶前后 Fig.13 (a)A:schematic of optofluidic SERS microsystem. B:photo of optofluidic SERS microsystem. C:micrograph of packed microspheres and integrated fiber optic cables; (b)Comparison of melamine sensing in milk using A:a standard FDA procedure versus B: our nanofinger-based sensing solution. The representative SEM images of open(left) and closed(right) pentamer gold nanofingers before and after treatment with the filtered milk, respectively, are shown along with the illustration of how the gold nanofinger chips were used for molecular sensing

5 結(jié)束語(yǔ)

綜上所述，本文簡(jiǎn)單介紹了SERS的原理，著重從基底的設(shè)計(jì)上敘述了SERS的發(fā)展。接下來(lái)總結(jié)了幾種SERS在生物傳感中的應(yīng)用，主要從SERS探針的制備和不同待測(cè)物的檢測(cè)兩方面進(jìn)行概述。通過(guò)將SERS基底引入到微流芯片內(nèi)形成微流控SERS檢測(cè)芯片(SERS-LoC)。在微流控SERS檢測(cè)芯片中，無(wú)論是液態(tài)、固態(tài)還是原位生長(zhǎng)的SERS基底都有其特點(diǎn)及應(yīng)用背景。最后，我們討論了目前微流控SERS檢測(cè)芯片的幾種應(yīng)用。檢測(cè)的分析物有DNA、抗原、生物標(biāo)志物、細(xì)胞、汞離子、砷離子等。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展SERS-LoC系統(tǒng)也逐漸趨于便攜性，出現(xiàn)了手持的設(shè)備，為真正的on-site現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了有力幫助。

盡管微流控SERS檢測(cè)芯片已經(jīng)取得了引人注目的研究進(jìn)展，然而檢測(cè)特異性與可重復(fù)性、芯片的多功能化與集成度的提高等依舊是微流控SERS檢測(cè)芯片今后的研究目標(biāo)。尤其是如何直接使用實(shí)際臨床生物樣本進(jìn)行目標(biāo)物的檢測(cè)。實(shí)際臨床樣品(如病人的血液)很復(fù)雜，它們往往含有豐富的蛋白質(zhì)、DNA等。這些生物大分子在SERS檢測(cè)的過(guò)程中都有可能提供非特異性的噪聲信號(hào)，從而造成假陽(yáng)性或假陰性的檢測(cè)結(jié)果，嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性。因此，對(duì)于實(shí)際樣品來(lái)說(shuō)，微流控SERS檢測(cè)芯片的特異性問(wèn)題尤為重要。通常，解決微流控SERS檢測(cè)芯片的特異性問(wèn)題可從兩點(diǎn)出發(fā)。首先，優(yōu)化SERS基底或探針的生物功能化修飾，提高基底或探針識(shí)別待測(cè)物的選擇性和準(zhǔn)確性；其次，在微流芯片內(nèi)增加可對(duì)待測(cè)物進(jìn)行篩選的功能單元，例如物理尺寸篩選或化學(xué)配體識(shí)別篩選，盡可能地排除其他物質(zhì)的非特異性干擾。若微流控SERS檢測(cè)芯片能夠?qū)?shí)際的復(fù)雜生物樣品進(jìn)行高準(zhǔn)確性地測(cè)試，則必將極大地推進(jìn)微流控SERS檢測(cè)芯片在臨床診斷與治療中的應(yīng)用。此外，低成本的自動(dòng)化微流控SERS檢測(cè)芯片也是今后人們研究的重點(diǎn)目標(biāo)之一。其關(guān)鍵是如何在保證完善的傳感與分析功能的前提下，盡可能降低芯片的制作成本。低成本的微流控SERS芯片對(duì)于欠發(fā)達(dá)地區(qū)的生化檢測(cè)(如疾病普查、環(huán)境監(jiān)測(cè)等)具有非常重要的社會(huì)價(jià)值與現(xiàn)實(shí)意義。在將來(lái)，SERS與微流控芯片技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，如將激光、光譜儀等設(shè)備集成到芯片上后會(huì)更大程度上發(fā)揮SERS-LoC的作用，為現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)的完善作出巨大貢獻(xiàn)，屆時(shí)生命健康科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等方面會(huì)極大受益。可以預(yù)見(jiàn)的是，隨著功能的不斷完善和性能的不斷提高，集成的、自動(dòng)化的SERS-LoC芯片必然會(huì)成為生物傳感檢測(cè)領(lǐng)域中一項(xiàng)非常重要的技術(shù)。

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