超分辨率成像熒光探針材料應用進展

劉志賀，吳長鋒

(1.吉林大學 集成光電子國家重點聯(lián)合實驗室 電子科學與工程學院，吉林 長春 130012；2.南方科技大學 生物醫(yī)學工程系，廣東 深圳 518055)

1 引 言

納米技術與生物醫(yī)學的快速發(fā)展和交叉融合促使許多傳統(tǒng)學科產(chǎn)生了革命性的變化，形成了納米生物醫(yī)學這一交叉熱點領域。將新興的納米技術應用于細胞生物學、腫瘤生物學及臨床醫(yī)學是目前納米生物醫(yī)學的研究重點[1-2]。當前，對于生命系統(tǒng)的認識已經(jīng)深入到單細胞、單分子水平，迫切需要在分子水平上對細胞的微觀結(jié)構(gòu)及生物大分子的動態(tài)行為進行實時觀測和分析[3-5]。一方面，人們希望能精密測量活細胞內(nèi)生物分子的三維空間分布；另一方面，研究者也希望準確理解細胞內(nèi)發(fā)生的各種動態(tài)過程：如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間如何發(fā)生相互作用及其時空結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)蛋白與核酸等如何組成細胞的基本結(jié)構(gòu)體系；重要的活性因子如何調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡與信號傳導等生命活動。反映這些體系結(jié)構(gòu)功能的特征尺度都在納米量級，如何在納米尺度上實時觀測活體細胞的精細結(jié)構(gòu)及動態(tài)行為，對于生物醫(yī)學及生物信息科學等諸多研究領域都有重大意義。

典型的生物成像技術中，正電子發(fā)射斷層掃描(Positron Emission Tomography,PET)、光學相干成像(Optical Coherence Tomography,OCT)以及磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)等技術應用到人類以及動物模型成像中主要受限于空間分辨率(～1 mm到10 μm)。電子顯微鏡(Electron Microscopy,EM) 恰好相反，能夠提供分子量級的空間分辨率,該技術與生物樣品的不兼容性以及真空成像環(huán)境等因素，只能對感興趣的區(qū)域提供單一的成像而不能提供動態(tài)的活細胞成像過程。熒光顯微鏡(Fluorescence Microscopy,FM)利用熒光探針對生物分子進行特異性標記，通過監(jiān)測熒光信號實現(xiàn)可視化成像，在過去的幾十年中，已經(jīng)成為活細胞、組織中生物分子特異性定位、相互作用以及亞細胞活動過程等研究的重要工具。熒光顯微鏡最大的優(yōu)勢在于其對活細胞的兼容性，能夠進行動態(tài)無損傷的生物成像實驗。隨著新型熒光探針和成像理論的發(fā)展，研究人員開發(fā)出了突破光學衍射極限的三維超分辨率熒光成像技術。超分辨成像技術可以以納米尺度空間分辨在活細胞內(nèi)觀察到亞細胞結(jié)構(gòu)和動態(tài)行為，極大地推動生命科學的進一步發(fā)展。

Eric Betzig教授，William Esco Moerner教授和Stefan Walter Hell 教授因在超分辨率成像技術中突破性和原創(chuàng)性的貢獻而獲得了2014年諾貝爾獎。和近場光學相比，由于物鏡與樣品之間的距離比光波長大得多，超分辨率成像屬于遠場光學顯微技術。突破光學衍射極限的關鍵在于調(diào)節(jié)熒光探針分子在兩種狀態(tài)之間轉(zhuǎn)變(熒光態(tài)和非熒光態(tài))。本文對不同超分辨熒光成像技術原理進行介紹并總結(jié)近期廣泛應用在生物學研究中的超分辨熒光探針材料的發(fā)展。

2 超分辨熒光顯微鏡概述

在分辨率上，熒光顯微鏡提供了獨特的空間和時間分辨率選擇(如圖1所示)。然而，傳統(tǒng)光學顯微鏡的分辨率受限于光學衍射極限，其分辨率通常是所用光波長的一半。這表明，即使在配備高數(shù)值孔徑(N.A.)物鏡的高精度寬場顯微鏡上，應用可見光最高只能達到200 nm的分辨率(阿貝定律)[6]。因此，受空間分辨率的限制，生物學中幾十到幾百納米的空間范圍的諸多亞細胞基礎過程都無法通過傳統(tǒng)的光學顯微鏡可視化研究。與傳統(tǒng)的光學顯微鏡相比，超分辨率技術能夠提供近10倍高的分辨率[7]。

圖1 不同生物成像技術空間分辨率對比圖 Fig.1 Spatial resolution comparison of different biological imaging techniques

根據(jù)成像技術的原理，超分辨成像可分為四大類：

(1)基于光學非線性效應調(diào)控、壓窄點擴散函數(shù)(Point Spread Function,PSF)的超分辨顯微成像技術(PSF Modulation)。包括受激發(fā)射損耗顯微成像技術(STimulated Emission Depletion，STED)[8-10]、基態(tài)損耗(ground state depletion,GSD)、可逆飽和光學熒光躍遷超分辨顯微成像技術(REversible Saturable Optical Fluorescence Transitions，RESOLFT)，等[11-13]。

(2)基于單分子定位(Single-Molecule Localization Microscopy，SMLM)的超分辨顯微成像技術。包括光激活定位顯微成像技術(PhotoActivated Localization MicroscopyPALM)[14-16]、(直接)隨機光學重構(gòu)顯微成像技術((direct) STochastic Optical Reconstruction Microscopy(d)STORM)，等[14,17-18]。

(3)基于熒光分子隨機漲落(Fluctuation/Blinking)的超分辨顯微成像技術。該類技術包括隨機光學漲落超分辨顯微成像(Super-resolution Optical Fluctuation ImagingSOFI)、貝葉斯超分辨顯微成像(Bayesian Analyisi of Blinking and Bleaching3B)[19-21]，等。

(4) 基于頻域處理的超分辨成像技術。該類技術主要包括：結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(Structured Illumination MicroscopySIM)和飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(Saturated Structured Illumination MicroscopySSIM)[22-23]。

這些突破性的思路將光學顯微鏡的分辨率提升到納米尺度。隨著超分辨率成像技術的出現(xiàn)，用于超分辨率成像的熒光探針材料在化學與生物化學研究中顯得尤為重要。對于STED顯微鏡，材料在較強的STED激光束照射下要具有足夠好的光穩(wěn)定性且具備受激發(fā)射的能力；PALM和STORM/dSTORM要求熒光探針材料具備光激活或光閃爍特性，用來拍攝熒光照片序列并進行單粒子定位和圖像解卷積過程；對于SOFI來說，材料在激光激發(fā)下，需要具有快速的熒光強度漲落特性，通過計算圖像時間序列上熒光分子的累積量來實現(xiàn)超分辨成像。到目前為止，用于優(yōu)化超分辨成像性能的智能熒光材料(熒光蛋白，以及熒光小分子染料和納米材料等)已經(jīng)揭示了諸多傳統(tǒng)熒光顯微鏡不能分辨的亞細胞結(jié)構(gòu)及生物過程。本文對不同超分辨技術原理進行介紹并總結(jié)近期廣泛應用在生物學研究中的超分辨熒光探針材料的發(fā)展。結(jié)構(gòu)光照明超分辨成像(SIM)對熒光探針無特殊要求，熒光探針的可選范圍較廣，但本文不對SIM成像的熒光探針進行總結(jié)。

3 受激發(fā)射損耗熒光顯微鏡(STED)

STED顯微鏡技術由Stefan Walter Hell教授提出并付諸實踐[8,24]。傳統(tǒng)熒光顯微鏡中，在激發(fā)光照明下，激發(fā)態(tài)的熒光探針分子通過自發(fā)輻射而發(fā)射熒光形成衍射極限圖像。在STED顯微鏡(基于掃描共聚焦顯微鏡的掃描方式)中，引入第二束激光(STED光束)將原本自發(fā)輻射(壽命約為幾納秒)的熒光分子通過受激發(fā)射過程將其激發(fā)態(tài)快速損耗到基態(tài)。環(huán)形的STED激光束使處于兩束激光交疊區(qū)域的熒光分子被損耗掉，處在焦平面STED環(huán)形光中心區(qū)域的熒光點便是被壓縮了的點擴散函數(shù)(PSF)，以此提高分辨率[25]。由于STED激光對熒光分子具有再激發(fā)效應，因此STED光波長應該遠離吸收波段，但要在熒光發(fā)射的附近位置(如圖2所示)。STED是一種確定性的功能技術，利用熒光團的非線性響應，在衍射極限以下達到更高的分辨率。

圖2 STED超分辨顯微鏡原理示意圖[25] Fig.2 Basic light-pathway diagram and the principle of STED microscopy[25]

由于環(huán)狀STED光的面積理論上可以通過不斷增加其光強進行無限增大，因此，激發(fā)區(qū)域的光斑可以無限小于衍射極限，最后通過掃描的方式進行成像。STED的分辨率公式為：

(1)

式中，IS是熒光染料的飽和受激輻射強度，定義為探針材料熒光發(fā)射強度被損耗到一半時的STED光強度；I表示STED光強度。由公式(1)可知，隨著STED光強的增加，理論上可以無限增加分辨率。在實際實驗過程中，熒光分子的飽和光強范圍為10～100 MW/cm2，為了獲得較高的空間分辨率，實驗中需要足夠強的STED光功率密度，對樣品的光損傷和光漂白影響較為嚴重[26-28]。為了降低對樣品的光損傷和光漂白的影響，與STED類似的成像技術得到進一步的發(fā)展，其中包括基態(tài)損耗(Ground State Depletion ,GSD)等不同方式的超分辨率熒光顯微成像技術[29-30]。

3.1 用于STED顯微鏡的熒光材料

在光學顯微成像實驗中，通常選取紅光發(fā)射的熒光探針，由于其需要較低的激發(fā)光子能量以及極低的背景干擾。特別是羅丹明類的衍生物ATTO647N，由于具有較高的量子效率和較大的消光系數(shù)，在STED顯微鏡中使用最為廣泛。此外，另一種紅光發(fā)射的染料KK114，具有較好的光穩(wěn)定性和較好的水溶性，在STED顯微鏡中的應用同樣比較廣泛。由于KK114是帶負電荷的染料，不能透過細胞且NHS酯的穩(wěn)定性較低等缺陷抑制了其應用。為了避免這些缺點，Wurum等人設計合成一系列具有高量子效率且改進了NHS酯穩(wěn)定的新型紅光羅丹明染料(如圖3所示)。該系列探針能以較高的對比度實現(xiàn)低于25 nm的STED空間分辨率的細胞成像[31]。

圖3 紅光發(fā)射的羅丹明熒光分子結(jié)構(gòu)式 Fig.3 Chemical structures of red-emitting rhodamine fluorophores

為了能夠達到較高的成像分辨率，STED顯微技術需要一個高功率的STED激光作為第二光源去擦除非靶標處的熒光。因此，具有大斯托克斯位移的熒光分子受到了青睞，因為此類熒光分子受激發(fā)射光的波長可以和自發(fā)輻射的熒光波長明顯區(qū)分，有利于對中心亞衍射極限的熒光斑點信號的收集。Hell等人設計合成了一系列基于香豆素分子結(jié)構(gòu)的衍生物熒光探針，這些探針具有較好的光穩(wěn)定性、較高的熒光亮度和大的斯托克斯位移(如圖4所示)[32]。分子1是通過1-(3-羧基丙基)-4-羥甲基-2,2-二甲基-1,2-二氫喹啉片段與香豆素熒光分子和3-[2-(2-吡啶基)乙烯基]殘基耦連得到的。其吸收和發(fā)射峰位分別在472 nm和623 nm。分子中的磷酸基團用來增強了染料分子的親水性和熒光量子產(chǎn)率，同時減少了非特異性結(jié)合。此外，活性羧酸基團用來生物耦連以實現(xiàn)免疫熒光標記實驗。分子1d (Star470SX+)是紅光發(fā)射的香豆素類熒光染料，通過二抗標記實現(xiàn)對高爾基體網(wǎng)絡中cis-Golgi和trans-Golgi精細可區(qū)分的多色STED超分辨成像，其光學分辨率約為70 nm。

圖4 用于STED熒光顯微鏡的熒光分子1及其衍生物結(jié)構(gòu)式 Fig.4 Chemical structures of fluorescent molecular 1 and derivatives used in STED microscopy

為了更加精細的識別細胞器結(jié)構(gòu)功能和動力學過程，熒光探針除了應該具有足夠的光穩(wěn)定性、高熒光亮度以及能與活細胞相容等性質(zhì)外，細胞滲透性和較低的光毒性同樣至關重要。Schepartz等人[33]發(fā)展了一種基于脂質(zhì)的策略以克服高爾基體的結(jié)構(gòu)成像和動力學過程的挑戰(zhàn)。該方法是在活細胞超分辨成像中引入生物正交反應。通過兩步過程進行實驗標記：用含有高爾基靶向官能基團的反式環(huán)辛烯(Cer-TPO)的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)處理細胞，高熒光亮度、含有四嗪標記的官能團的近紅外發(fā)光染料SiR-Tz (分子2)用來特異性識別Cer-TCO，硅-羅丹明分子(SiR)用來顯示熒光信號(如圖5所示)；當兩種分子在高爾基體內(nèi)接近時，四嗪和反式環(huán)辛烯通過無銅點擊反應快速連接在一起，反應生成具有較好光穩(wěn)定性的染料Cer-SiR(分子3)，從而有助于3D熒光成像和STED超分辨高爾基體的成像分析。

圖5 熒光分子2和3的化學結(jié)構(gòu)式及在活細胞中的正交反應示意圖 Fig.5 Chemical structures of fluorescent moleculars 2 and 3 and the bioorthogonal reaction in live cells

由于硅-羅丹明(SiR)衍生物(如圖6所示，分子4)具有高熒光強度，低光毒性以及環(huán)境依賴的OFF態(tài)(非熒光螺旋體)/ON態(tài)(熒光兩性離子)轉(zhuǎn)化的行為，能夠明顯的區(qū)分它們與極性蛋白質(zhì)表面非特異性結(jié)合(ON態(tài))到疏水表面(OFF態(tài))的變化過程。分子4在聚集態(tài)是無熒光的OFF態(tài)。Johnsson等人[34]根據(jù)這種性質(zhì)開發(fā)了兩套由SiR衍生物與多西他賽(分子5)和脫溴去甲基茉莉酮酸(分子6)組成的熒光探針(如圖6所示)，對活細胞中的細胞骨架結(jié)構(gòu)進行超分辨率成像。Hell等用熒光分子6作為探針，首先報道了活細胞中海馬神經(jīng)元軸突中樹突狀皮質(zhì)下肌動蛋白的存在，該結(jié)果與早期電子顯微鏡實驗結(jié)果一致[35]。損耗光波長處在近紅外區(qū)域的熒光探針光穩(wěn)定性好，ON/OFF的轉(zhuǎn)換效率高，降低了光散射并且對生物組織無毒。Hell等人設計了一系列基于分子7的探針(如圖6所示)，該類探針光穩(wěn)定性好，水溶液中量子效率高，吸收和發(fā)射峰位分別處在600 nm和680 nm。與常用的羅丹明染料(λ=750～770 nm)不同，這些小分子量的熒光探針(分子量小于600)在STED顯微鏡中，使用長波長(λ=800 nm)的損耗激光使成像性能獲得關鍵的提升[36]。

圖6 熒光分子4～7的化學結(jié)構(gòu)式 Fig.6 Chemical structures of fluorescent moleculars 4～7

在典型的掃描STED顯微鏡，熒光分子的吸收截面常為10-16·cm-2，激發(fā)態(tài)壽命為幾納秒，STED光強度常用3～10 MW·cm-2。在掃描的過程中，熒光被STED光損耗掉的熒光分子在需要發(fā)光時能夠快速恢復。只有當其保持在S0或S1狀態(tài)時，才能確保及時的恢復熒光發(fā)射。通常，不希望過渡到更高的激發(fā)態(tài)Sn(nυ>1)或三線態(tài)，熒光分子不能經(jīng)歷長時間的暗態(tài)或光漂白，因此犧牲了光穩(wěn)定性。通過特殊的氧化還原系統(tǒng)(ROXS,還原劑抗壞血酸或Trolox；氧化劑甲基維生素或Trolox-醌)可以顯著提高熒光分子的光穩(wěn)定性。在氧化還原反應緩沖溶液中形成了自由基陰離子和陽離子，激發(fā)的三線態(tài)的熒光分子被快速退激發(fā)掉。隨后的自由基物質(zhì)會進一步通過整體氧化還原反應回落到單線態(tài)基態(tài)。Sauer等人通過這種方法提高了ATTO647N的光穩(wěn)定性并且使空間分辨率提高了幾倍(<30 nm)。用甲基紫精-羧酸作為氧化還原緩沖液，在63 mW的750 nm STED光擦除下，單個ATTO647N分子圖像的精度達到了1.8 nm[37]。Johnsson等人通過調(diào)節(jié)SiR官能團，在SiR650的基礎上發(fā)展了一系列的用于亞細胞結(jié)構(gòu)(微管結(jié)構(gòu)、溶酶體、肌動蛋白)靶向的SiR700的熒光探針，并實現(xiàn)了100 nm的結(jié)構(gòu)光成像和約50 nm的STED細胞微管成像[38]。

目前，小分子熒光分子由于其優(yōu)異的特征，仍然是STED顯微鏡的主要熒光探針。為了拓展STED顯微鏡的應用范圍，Hell等使用商用的CdSe/Zns 和 CdTe/ZnS核殼結(jié)構(gòu)的紅光發(fā)射量子點(Qdots)作為STED的熒光探針，其STED激光波長為775 nm，實現(xiàn)了對Qdots標記的成纖維細胞波形蛋白片段的50 nm的空間分辨率的成像[39]。Qdots較好的光穩(wěn)定性能夠保證可以重復掃描1 000幀以上的圖像而不降低圖像對比度；因此Qdots可作為較長時間成像的熒光探針。

4 光激活定位顯微鏡(PALM)和隨機光學重構(gòu)顯微鏡(STORM)

克服衍射極限造成的分辨率限制的另一種方法是基于熒光團在ON狀態(tài)(熒光)和OFF狀態(tài)(非熒光)之間隨機切換特性的超分辨熒光顯微鏡。該方法主要是通過特定時間的光誘導下探測隨機激活熒光團(有機熒光染料和熒光蛋白)的一系列熒光信號。熒光分子在組合激光(激活和激發(fā)光束)的照射下能夠光轉(zhuǎn)換。熒光分子的隨機光開關性質(zhì)在每幀圖像產(chǎn)生稀疏的熒光信號，通過二維的高斯函數(shù)擬合的分析算法對熒光團精確定位。最后，通過對所有的單個激活的熒光團的位置疊加重建出超分辨熒光圖像。該方法的核心在于利用二維高斯函數(shù)來擬合出單個熒光分子在寬場熒光顯微鏡下的位置。定位中心的誤差，即定位精度，可由公式(2)給出：

(2)

式中，s為點擴散函數(shù)的標準方差，a為探測器CCD像素的大小(單位：nm)，N為收集到的光子數(shù)，b為背景噪聲。單分子定位的理論分辨率為[40]：

(3)

根據(jù)公式(2)和(3)可知，如果熒光探針發(fā)射的光子數(shù)越多，熒光成像過程中引入的背景噪聲就越小，定位精度越高。對于生物熒光探針來說，單個熒光蛋白分子能夠被有效檢測到的光子數(shù)約為幾百個，而單個熒光染料分子為幾千個。因此，定位精度可以達到幾納米的范圍。通過重建數(shù)千幀熒光圖像獲得單個高空間分辨率圖像，用時間分辨率來換取空間分辨率。因此，要想獲得超分辨率圖像，熒光探針材料的性能至關重要。PALM和STORM技術的工作原理比較類似[14,17]，但是分別使用不同的熒光探針(如圖7所示)。PALM技術使用的熒光探針是在完全光漂白之前能夠完成一次或幾次光轉(zhuǎn)換或光激活循環(huán)的過程的熒光蛋白(FPs)或有機熒光分子，STORM技術使用的則是可逆光轉(zhuǎn)換的有機熒光分子作為熒光探針[41-43]。PALM和STORM技術都是通過寬場顯微鏡上配備的靈敏的面陣探測器探測熒光分子的發(fā)光并結(jié)合單分子定位的圖像重構(gòu)技術。

圖7 光激活定位顯微鏡和隨機光學重構(gòu)顯微鏡工作原理及亞細胞結(jié)構(gòu)超分辨圖(左側(cè)：PALM及COS-7細胞溶酶體超分辨圖像；右側(cè)：STORM原理圖及亞細胞結(jié)構(gòu)單色、多色超分辨圖像)[14,17] Fig.7 Working principle of Photoactivation Localization Microscopy, Stochastic Optical Reconstruction Microscopy and subcellular structure super resolution images(Left: PALM and COS-7 cell lysosomal superresolution images; right:STORM schematic and subcellular structure monochrome, multicolor super-resolution images)[14,17]

4.1 用于PALM的熒光材料

在活細胞超分辨率成像中，熒光蛋白(FPs)因具有基因編碼的靶向能力且容易開發(fā)，仍然是不可或缺的生物熒光探針的選擇[41,44]。與此同時，過去的幾十年中，有機熒光分子由于具有獨特的光譜可調(diào)性、溶解度和靶向特異性等優(yōu)點在超分辨率顯微成像技術中得到了廣泛的應用。如前所述，在超分辨率成像中有機熒光探針的發(fā)射是通過可逆的光轉(zhuǎn)換來實現(xiàn)的。Moerner 等人設計了一種有機熒光分子(如圖8所示，分子8),HaloTag與疊氮基-二氰基亞甲基二呋喃(DCDHF)結(jié)合，用在固定的細胞以及活細胞成像中精確標記細胞蛋白[45]。Moerner等人使用分子8成功實現(xiàn)了細胞骨架蛋白(Popz、FtsZ和AmiC)的PALM超分辨率成像。隨機和可逆的光激活在分子內(nèi)部是一個推挽過程，含氨基的DCDHF(如圖8，分子9)具有高亮度，適用于超分辨率成像。將氨基替換成硝基可以提高DCDHF在超分辨成像中的響應。在硝基還原酶(NTR)和電子給體(NADH)的存在下分子10中所含的硝基被還原;因此該分子在實驗期間不需特殊處理并且不存在光依賴的激活(如圖8)等優(yōu)點。該分子在活細菌細胞內(nèi)硝基還原酶的超分辨率成像中數(shù)據(jù)采集時間低于10 min[46]。

圖8 熒光分子8～10的化學結(jié)構(gòu)式 Fig.8 Chemical structures of fluorescent moleculars 8～10

2007年，S.W.Hell等人報道了羅丹明熒光分子(如圖9所示，分子11,SAR577)可用于基于單分子光轉(zhuǎn)換的熒光納米顯微鏡。在紫外光(單光子情況下)或者是雙光子激光照射下，SAR577在安非他酮內(nèi)酯(無熒光)和兩性離子形式(熒光)之間進行光開關轉(zhuǎn)換。該類分子處于熒光態(tài)時可發(fā)射足夠多的光子，在活細胞中獲得較高的空間分辨率圖像。熒光態(tài)和暗態(tài)光強度的高對比度使之在高密度標記的樣品中獲得精細的結(jié)構(gòu)圖像。利用這種方法，軸向可獲得0.5～1 μm的光學切片，提高了基于單分子顯微鏡技術多層成像的適用性。應用PALM熒光顯微鏡，利用包覆了不同熒光分子(SPA545,SRA577,SRA617)的二氧化硅納米球?qū)崿F(xiàn)了15 nm空間分辨率和多色超分辨成像[47]。另外，SRA577-NHSS和含有馬來酰亞胺的SRA552羅丹明類似物能夠?qū)崿F(xiàn)哺乳動物細胞中微管和角蛋白網(wǎng)絡的多色單分子定位超分辨成像。在細胞生物成像實驗中，長時間的紫外光照射對生物樣品有較大的損害。Moerner等人調(diào)控了傳統(tǒng)的使用紫外光照明的光轉(zhuǎn)換羅丹明熒光分子，得到了一系列的可見光激發(fā)的羅丹明衍生物(如圖9所示，分子12～21)。此外，他們在熒光團的內(nèi)酰胺氮上引入了各種共軛發(fā)色團，在不對其光物理性質(zhì)產(chǎn)生影響的情況下降低光活化所需的能量。新的熒光分子進一步功能化后，特異性標記分布在革蘭氏陰性新月牙菌的活細胞表面上的胺。應用PALM顯微鏡在低能量激光(405 nm)下成功的標識出了10～20 nm的二維和三維的細胞表面[48]。

基于羅丹明分子結(jié)構(gòu)，Lavis等人發(fā)展了一種將季碳原子替換黃嘌呤氧的方式合成熒光素的紅移同構(gòu)體和羅丹明110，命名為Carbofluorescein(如圖10所示，分子22)和Carborhodamine110 (如圖10所示，分子23)，優(yōu)異的光譜性質(zhì)和光穩(wěn)定性使得它們可以用于高對比度成像應用。此外，為了比較PALM顯微鏡對活細胞成像的質(zhì)量，通過連接一個對光不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，合成了含有鬼筆環(huán)肽的Carborhodamine110類似物 (如圖10所示，分子24)，實現(xiàn)了老鼠成纖維細胞肌動蛋白的成像。與商用的鬼筆環(huán)肽AlexaFluor647(AF647)相比，分子24光子產(chǎn)量高，成像對比度高，并且能夠提供比AF647高兩倍的定位精度[49]。

半花青染料，由于具有光致變色的光誘導熒光轉(zhuǎn)換行為，在超分辨率成像顯微鏡領域受到廣泛的應用。Raymo等人研究了半花青熒光分子的化學結(jié)構(gòu)和光轉(zhuǎn)換性能之間的關系。設計了一系列的基于半花青的熒光分子(如圖11所示，分子25～29)。該類分子是基于2,3,3-三甲基-3H-二氫吲哚與另一種發(fā)色團(如聯(lián)苯，花青或芘)結(jié)合的季銨鹽。將2-羥基-5-硝基芐基連接到染料的N-位上，在紫外線和可見光照射下能夠使之在暗態(tài)與熒光態(tài)之間轉(zhuǎn)變。將單分子染料裝載到有機聚合物中制備形成納米粒子并用到超分辨成像中，該類熒光探針具有較好的單粒子熒光閃爍特性，空間分辨率能夠達到28 nm[50]。Hu等人利用光致變色熒光分子通過超分辨顯微鏡驗證了聚合物納米粒子中的核殼結(jié)構(gòu)和定位模式[51]。首先，將分子30共軛偶聯(lián)到雙親性聚合物材料上，然后將聚合物包覆在碳酸鈣殼層中，得到核殼納米結(jié)構(gòu)材料(如圖11所示)。通常，熒光分子處于非熒光的螺吡喃形式。在365 nm光照射下轉(zhuǎn)換為熒光態(tài)，在561 nm的可見光照射下轉(zhuǎn)換到螺吡喃形式；由于提高了聚合物負載分子的密度，實驗數(shù)據(jù)采集時間由之前的幾小時縮短到幾分鐘，實現(xiàn)了更快速的PALM顯微成像。Zhang等人使用花青染料設計了基于超分辨成像的傳感器探針(如圖11所示，分子31)，用來定量活細胞中的微管蛋白。在結(jié)合微管蛋白之前，分子31處于暗態(tài)(如圖11所示，分子32)。選擇性結(jié)合，后在375 nm照射時熒光發(fā)射增強，分子31可以在20 nm的空間分辨率下檢測微管蛋白位點的選擇性[52]。

為了進一步豐富適用于PALM顯微鏡的新熒光材料，Zhu等人開發(fā)了一種pH-敏感、具有光開關性質(zhì)的水溶聚合物納米系統(tǒng)(如圖11所示，分子34)對酸性的溶酶體超分辨率成像。分子34中的聚-N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)作為載體材料來調(diào)節(jié)親水性，萘二甲酰亞胺(NI)作為pH敏感單元，光敏性的二甲基亞乙烯(DTE)用來調(diào)節(jié)熒光閃爍特性。該聚合物材料被活細胞內(nèi)吞后首先定位到溶酶體。酸性溶酶體將聚合物的暗態(tài)轉(zhuǎn)換為熒光態(tài)(分子33)。交替的光照射調(diào)節(jié)聚合物的光閃爍，實現(xiàn)了40 nm空間分辨率的超分辨成像[53]。

圖11 分子25～32開關過程的化學結(jié)構(gòu)式以及通過熒光分子31實現(xiàn)的細胞超分辨率圖像；紫外光照射下分子34的光開關轉(zhuǎn)換過程[52-53] Fig.11 Chemical structures and the switching process of 25～32 and superresolution images obtained with 31 in live cells. Photoswitchable process of 34 under irradiation with UV/visible light[52-53]

4.2 用于STORM/dSTORM 的熒光材料

Zhuang等人在2008年報道了一系列可開關的熒光探針，來實現(xiàn)多色隨機光學重構(gòu)顯微鏡(STORM)。熒光探針由活化劑(例如：Alexa405，Cy2，Cy3)、能量供體和能量受體(如Cy5)組成，可在ON/OFF之間循環(huán)開關并應用到多色STORM超分辨成像[54]。進一步地，應用到DNA多色超分辨率成像，能夠在納米尺度直接觀察分子間相互作用。此外，她們將這種方法擴展到細胞內(nèi)，實現(xiàn)了微管和網(wǎng)格蛋白有被小窩的超分辨率STORM成像。在探測光路中配置一個半圓柱透鏡，通過其散光來確定每個獨立熒光分子的軸向和橫向的位置，然后重復光開關過程。這種方式能夠獲得20～30 nm的側(cè)向和50～60 nm的軸向分辨率的三維成像(如圖12所示)[55]。

圖12 (a～c)3種不同DNA結(jié)構(gòu)的三色STORM圖像(Alexa405/Cy5, Cy2/Cy5和Cy3/Cy5標記；405 nm,457 nm和532 nm激光激發(fā))；(d)Alexa647/Cy3 標記的BC-S-1細胞內(nèi)網(wǎng)格蛋白凹坑(CCPs)的三維STORM圖像[54-55] Fig.12 (a～c)Three-color STORM images of three different DNA constructs(labelled with Alexa405/Cy5, Cy2/Cy5, and Cy3/Cy5, activated using 405, 457 and 532 nm laser, respectively); (d)3D STORM image of clathrin-coated pits(CCPs) stained with the Alexa647/Cy3 in BS-C-1 cells[54-55]

與之前STORM技術使用熒光蛋白或熒光分子對(激活劑和熒光報告分子)作為探針不同，Sauer等用常規(guī)熒光分子作為熒光探針，使用不同波長的光激發(fā)實現(xiàn)光轉(zhuǎn)換來進行超分辨成像，并將這種技術命名為直接隨機光學重構(gòu)顯微鏡(dSTORM)。使用市售的熒光探針(如圖13所示，分子35)，可以在幾分鐘的時間內(nèi)獲得細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的20 nm dSTORM成像[56]。

花青染料在熒光態(tài)具有較高的光子發(fā)射產(chǎn)率而被看作是理想的STORM熒光探針。適當?shù)膒H下，在初級硫醇(b-甲基乙醇)和三(2-羧乙基)膦 (TCEP)存在下，花青染料轉(zhuǎn)化為暗態(tài)。通過電子離子化液相色譜-質(zhì)譜(ESI-MS)檢測到硫醇共軛π-電子的破壞，分子中巰基和TCEP加入后，形成了新產(chǎn)物(如圖13所示，分子37和38)。將非熒光加合物通過紫外光照射可逆的轉(zhuǎn)化為分子36的發(fā)光形式[57-58]。Squier等通過FRET對(如圖13所示，分子39)檢測細菌細胞中的四半胱氨酸蛋白。該探針由含雙砷的Cy3-Cy5能量轉(zhuǎn)移對組成，Cy3作為能量供體(激活劑)，接收Cy5的熒光做超分辨成像。與靶蛋白(如，RpoA*)共價連接后，由于Cy3聚甲炔鏈的剛性運動，有明顯的熒光增強(Cy5,20倍的增加)。STORM能夠以20 nm的空間分辨率識別單個分子[59]。Haynes等使用市售的Alexa Fluoro 488激活的羧酸酯對革蘭氏陰性細菌表面外膜蛋白標記，得到了30～40 nm的STORM定位精度[60]。Gianneschi等人開發(fā)了對金屬蛋白酶(MMP)有響應、Alexa647標記的肽-聚合物兩親物(PPA)納米粒子(如圖13所示，分子40)，來研究HT-1080人纖維癌中膠束的累積和增強的滯留行為[61]。

圖13 花青染料(35～40)分子式和假設的閃爍機制 Fig.13 Chemical structures of cyanine dyes(35～40) and the proposed photoblinking mechanism

Sauer等人報道了一種基于市售的羅丹明和惡嗪(Alexa 和ATTO)(如圖14所示，分子41～48)的熒光分子，在生理環(huán)境下實現(xiàn)了簡便的超分辨率成像方案。使用各種硫醇(b-巰基乙胺(MEA)、二硫蘇糖醇(DTT)或谷胱甘肽(GSH))作為還原劑，通過增加暗態(tài)的壽命來選擇性的抑制激發(fā)三線態(tài)。實驗過程中，氧氣和氧化劑的存在確保熒光探針轉(zhuǎn)換到熒光態(tài)。此外，使用市售的有機熒光分子通過該方案實現(xiàn)了對活細胞RNA的超分辨成像[62]。為有機小分子熒光探針分子應用到多色超分辨成像開辟了新的途徑。

如前所述，理想的活細胞成像熒光探針應該具有高光子通量的光轉(zhuǎn)換或光激活性質(zhì)，在近紅外吸收和發(fā)射，以及較高的膜滲透性，這樣最有利于對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)標記研究。Johnsson等人提出了一類新的SiR熒光探針(如圖14所示，分子50～53)，這些熒光分子具備以上提出的所有要求并且容易合成，用于活細胞和組織中蛋白的特異性成像。另外，含有羧基的SiR分子在低介電常數(shù)的溶劑中處于螺內(nèi)酯形式的暗態(tài)，其光閃爍性質(zhì)能夠用于STORM成像。使用如圖14所示的分子50(SiR-SNAP)、51(SiR-CLIP)和52(SiR-Halo)熒光探針實現(xiàn)了對Hela細胞的蛋白的高效多色熒光標記[63]。

圖14 STORM熒光探針41～48結(jié)構(gòu)式及細胞微管的超分辨圖像[62]； Si-羅丹明熒光分子(49～55)衍生物以及分子54在合適pH 環(huán)境中閃爍機制的模型及相應的化學結(jié)構(gòu)式[65]; ATTO655標記的CCR5在水和重水不同環(huán)境下，分子56和57在光照時互相轉(zhuǎn)化過程以及亞細胞結(jié)構(gòu)圖像[66] Fig.14 Chemical structures of fluorescent dyes(41-48) used in STORM[62]; Chemical structures of 49-55 and proposed photoblinking mechanism of 54 in a suitable pH environment[65]; Photoswitching between 56 and 57 upon photoirradiation in the presence of oxygen and ATTO655-labelled CCR5 imaging of live cells in H2O and D2O[66]

Urano等人開發(fā)了一類SiR熒光分子(如圖14所示，分子54)，該熒光分子無論在硫醇的存在與否和輻照強度如何，都能夠?qū)崿F(xiàn)自發(fā)光閃爍。在生理pH環(huán)境下，羧甲基-SiR(HMSiR)處于己內(nèi)酯形式的暗態(tài)(如圖14所示，分子54)。在激發(fā)光照射下，處于兩性離子形式的熒光態(tài)(如圖14所示，分子55)，其中的一些開始自發(fā)的閃爍，且熒光發(fā)光時間足以用于檢測。使用分子54，實現(xiàn)了核孔結(jié)構(gòu)的單分子定位成像和活細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的追蹤[64]。

在基于單分子的超分辨顯微鏡中，通常使用基于酶的除氧系統(tǒng)或通入惰性氣體的方式來提高熒光分子的光穩(wěn)定性以及調(diào)節(jié)熒光分子的光開關和最佳熒光響應。Doose等人證明亞甲基藍(MB)-硫醇可用作高效快速的除氧系統(tǒng)。在光照下MB生成活性氧(ROS)MB+，在適當?shù)倪€原劑存在下，MB+可以進一步被還原成MBH達到了消耗分子氧的目的。使用Cy5標記的抗體，Doose通過dSTORM 顯微鏡在Hela細胞微管中研究了MB-硫醇作為超分辨成像的除氧劑的重要作用[65]。

通常，市售的紅光發(fā)射的有機熒光探針量子產(chǎn)率低、發(fā)光亮度有限。Furstenberg等人報道了一種增強了商業(yè)熒光分子的熒光量子效率的方法。該熒光分子可以在氧化態(tài)(如圖14所示，分子56)和還原態(tài)(分子57)之間轉(zhuǎn)化。將緩沖溶液中的水替換成重水(D2O)量子效率提高了兩倍。這主要是由于在無輻射躍遷的過程中，氫鍵輔助失活從而減少熒光淬滅過程。此外，使用這種方法還對ATTO655標記的趨化因子受體5(CCR5)的結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了20 nm空間分辨率的超分辨成像(dSTORM)[66]。

5 超分辨光學漲落熒光成像(SOFI)

2009年，Dertinger等人發(fā)展了一類新型的超分辨率成像技術，被稱為超分辨光學漲落成像(SOFI,如圖15所示),SOFI是基于相互獨立的熒光發(fā)色團熒光強度的隨機漲落來實現(xiàn)分辨率提高的成像技術[19]。熒光材料只需在激光照射下產(chǎn)生熒光強度的漲落而不需要具有OFF-ON的狀態(tài)轉(zhuǎn)換。通常，可以利用氧化還原反應的緩沖溶液(如dSTORM)或熒光發(fā)色團本身的光轉(zhuǎn)換(可光轉(zhuǎn)化的熒光蛋白和量子點等)來實現(xiàn)熒光強度的漲落。首先拍攝一系列的熒光圖像序列，然后進行隨時間的波動的高階統(tǒng)計分析，找出每個發(fā)色點的獨特的強度波動曲線。在檢測特征的波動曲線時，可以將單個熒光分子彼此區(qū)分開。SOFI適用于高階累積量來重建超分辨率圖像[19]。如果能夠探測到足夠多的光子數(shù)，累積量的階數(shù)越高，則能夠得高更高分辨率的圖像。

假設一個生物結(jié)構(gòu)由N個獨立發(fā)光的熒光分子標記，其熒光分子的熒光強度在時間上隨機、獨立進行閃爍或波動，那么在空間位置r、時刻t時的熒光信號強度I可以表示為[19]：

b(r)+n(r,t) ,

(4)

通常顯微鏡光學系統(tǒng)的PSF表示為式(5)：

(5)

不同熒光分子rk的熒光強度在時間維度上是隨機且獨立的，因此，不同熒光分子熒光強度在時間序列上的互相關運算值為0。SOFI技術是通過計算探測器上每個像素點的熒光波動的n階累積量函數(shù)(Cumulant Functions,CF)。探測器上的熒光閃爍表示為式(6)：

δI(r,t)=I(r,t)-〈I(r,t)〉t,

(6)

式中，〈I(r,t)〉t表示t時間內(nèi)熒光信號強度的平均值。n階累積量函數(shù)為式(7)：

Gn(r,τ1,τ2,τ3,…,τn)=

〈δI(r,t)δI(r,t+τ1)…δI(r,t+τn)〉t.

(7)

由于系統(tǒng)噪聲和背景在時間序列上是隨機的沒有相關性，因此n階累積量可以消除背景及噪聲的影響。對于一個2階相關函數(shù)則可以表示為式(8)：

G2(r,τ)=〈δI(r,t)δI(r,t+τ)〉=

(8)

(9)

通常，SOFI的處理過程是計算互累積量，這樣能夠進一步的消除了使用自相關運算過程中產(chǎn)生的散粒噪聲的影響。使用傅里葉加權(quán)法(Fourier reweighting)、反卷積SOFI的PSF等方法，可以實現(xiàn)n階累積量計算達到三維分辨率n倍的提升[67-71]。

圖15 SOFI成像原理示意圖及使用Qdots標記的細胞微管SOFI圖像[19,67,72] Fig.15 Principle of SOFI imaging and SOFI images of cell microtubule labeled with Qdots[19,67,72]

SOFI顯微術能夠在三個維度同時提高對比度。該技術具有簡單、快速、曝光時間短以及對設備要求低等優(yōu)點。唯一的要求是用于標記的熒光分子具有能夠重復、隨機的熒光閃爍特性。通常，適用SOFI成像的探針包括熒光蛋白(FP)、無機量子點(Quantum Dots,Qdots)以及有及有機熒光小分子(Organic Dyes)等。2009年，T.Dertinger等使用具有熒光閃爍特性的Qdots625對Hela細胞微管結(jié)構(gòu)進行特異性標記并在國際上首次實現(xiàn)了SOFI成像應用[70]，此后一段時間內(nèi)，研究人員通過Qdots525、Qdots705以及Qdots800等對SOFI成像從技術上進行優(yōu)化，實現(xiàn)了通過計算n階累積量得到n倍的分辨率提升，以及發(fā)展了高密度標記的JT-SOFI等技術等[67,69,72]。

5.1 用于SOFI的熒光材料

可逆光開關熒光蛋白(RSFPs)是超分辨顯微成像技術中的一種常用熒光探針，成為國際上的研究熱點。其中以綠色可逆光開光熒光蛋白Dronpa為代表的RSFPs被廣泛地應用在各類超分辨顯微成像中，例如RESOLFT、PALM、SOFI等超分辨顯微成像以及各類生物問題研究中[73]。Dronpa的最大激發(fā)波長約為500 nm，最大發(fā)射波長約為520 nm，在488 nm光的照射下，Dronpa由綠色的亮態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榘祽B(tài)，隨后在405 nm光的照射下可迅速恢復至亮態(tài)，繼續(xù)發(fā)出綠色熒光，這一過程可以轉(zhuǎn)化多次，從而通過不同波長的光實現(xiàn)反復光開關功能。對于熒光蛋白的活細胞SOFI超分辨顯微成像，2012年，Peter Dedecker首次提出利用Dronpa和紅色可逆光開光熒光蛋白rsTagRFP實現(xiàn)雙色活細胞SOFI超分辨顯微成像[74]。

目前,RSFPs 的品種較為單一，常用的綠色RSFPs Dronpa的熒光光子數(shù)較低，光學穩(wěn)定性有待提高[74]。Sun等人選擇了單分子光子數(shù)更高的光轉(zhuǎn)化蛋白mEos 3.1作為模板[75]，對His62位點進行飽和位點突變，獲得了更適合用于活細胞 SOFI 的熒光蛋白Skylan-S，實驗結(jié)果表明Skylan-S的亮度是Dronpa的1.15倍，光穩(wěn)定相比Dronpa更加優(yōu)異，并且熒光波動范圍更大，在多項參數(shù)上超越Dronpa成為新一代活細胞SOFI成像的熒光探針[76]。

為了使SOFI顯微術可以與有機熒光染料兼容，Dertinger等人使用和dSTORM相同的條件，使用EMCCD作為探測器,在光照射下具有快速熒光閃爍性質(zhì)的Alexa647作為熒光探針。在20 Hz的幀率下拍攝1 000張Alexa-647偶聯(lián)抗體標記的COS-7細胞β-微管。使用SOFI算法運算處理之后，得到的圖像表明，SOFI技術可以在較低的成像時間上獲得具有低背景、高分辨率的熒光圖像[77]。

基于單分子定位的超分辨成像技術已經(jīng)能夠顯著提升空間分辨率；然而，當多個熒光分子靠近之后，其光開關過程的區(qū)分會受到限制，從而導致不能夠高密度標記亞細胞結(jié)構(gòu)限制了對活細胞成像。為了解決這個問題，Xi等人發(fā)展了一種聯(lián)合標記超分辨技術(JT-SOFI)，從而實現(xiàn)高密度標記且不影響目標結(jié)構(gòu)的空間分辨率和結(jié)構(gòu)的完整性。為了獲得超高密度標記，他們使用具有不同發(fā)射波長的市售量子點QD525、QD625和QD705來共同標記COS-7細胞中的微管蛋白(圖25)。在分析了具有窄帶發(fā)射光譜寬度的QD標記的熒光閃爍圖像之后，在亞衍射分辨率下精確的獲得了微管網(wǎng)絡的高對比度圖像。與SOFI 相反，JT-SOFI提供了一個高分辨率的連續(xù)微管網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，每個通道只有100幀，從而提高了時間分辨率[72]。

聚合物量子點(Pdots)作為新一代優(yōu)秀的生物熒光探針在熒光成像示蹤分析技術中得到廣泛的應用。此前，受限于眾多因素，Pdots從未實現(xiàn)過超分辨成像。為了實現(xiàn)高量子產(chǎn)率，超高光穩(wěn)定性和優(yōu)異的生物兼容性的熒光探針，同時滿足超分辨成像的要求，Wu和合作者Sun等人成功設計制備了小尺寸光閃爍半導體聚合物量子點，特異性地對生物亞細胞結(jié)構(gòu)進行高密度標記，取得超分辨率光學漲落成像 (SOFI)結(jié)果。Pdots的熒光閃爍特性主要源于聚合物分子內(nèi)的能量遷移的動態(tài)過程(主要是空穴極化子對熒光的淬滅[78-79]。因此，Pdots的尺寸、形貌、激子動力學以及能量傳遞過程等因素都會影響其熒光閃爍特性。前期的單粒子熒光性質(zhì)研究表明，尺寸大于15 nm的Pdots表現(xiàn)出連續(xù)穩(wěn)定的熒光動態(tài)過程；而10 nm左右的小尺寸Pdots表現(xiàn)出具有明顯的熒光閃爍(Photoblinking)特性[80-82]。該工作選用兩種具有較高熒光強度的聚合物PFBT和CN-PPV (如圖16所示，分子58,59)。通過優(yōu)化傳統(tǒng)的納米再沉淀法制備出分布較均一的兩種小尺寸Pdots，均表現(xiàn)出較高的熒光亮度以及熒光閃爍特性。單粒子熒光實驗統(tǒng)計表明，兩種小尺寸Pdots的Off-time 間隔符合Power-law分布。通過優(yōu)化標記，該工作還實現(xiàn)了高密度的亞細胞結(jié)構(gòu)標記和超分辨成像結(jié)果。小尺寸光閃爍聚合物量子點有望大大提高超分辨成像的時空分辨率，減少光毒性，實現(xiàn)長時間超分辨成像(如圖16所示)[83]。

圖16 聚合物熒光探針分子58～59化學結(jié)構(gòu)式，熒光閃爍特性和單色細胞微管標記圖像[83] Fig.16 Chemical structure and photoblinking property of fluorescent polymer probe molecules(58～59), single-color microtubule images labelled with polymer dots[83]

為了能夠?qū)崿F(xiàn)高通量多通道實時的亞細胞結(jié)構(gòu)的超分辨熒光成像，研究團隊通過高通量篩選并調(diào)控制備方法，成功制備出具有閃爍特性的小尺寸Pdtos。PFO和PFTBT5 Pdots(分子61,62)具有較窄熒光光譜(半高全寬分別為40 nm和70 nm)、較好的生物兼容性以及較高的光穩(wěn)定性。此外，由于PFTBT5的聚合物骨架中引入了二噻吩基苯并噻二唑的受體基團，使其能夠在488 nm激光的激發(fā)下發(fā)射紅色熒光。與單色(PFBT和CN-PPV)SOFI相比，PFO與PFTBT5 Pdots具有不同的激發(fā)波長，且其熒光光譜無交疊，這就為實現(xiàn)基于Pdots的雙色SOFI實驗提供了可能。

PFO與PFTBT5的單粒子熒光性質(zhì)結(jié)果表明在相應的激發(fā)光激發(fā)下二者均具有明顯的熒光閃爍特性。統(tǒng)計表明，PFO和PFTBT5 Pdots的Off-Time 間隔符合Power-law分布，適用于基于熒光漲落的SOFI成像技術。通過優(yōu)化蛋白標記，該團隊實現(xiàn)了不同種類Pdots對不同亞細胞結(jié)構(gòu)(微觀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)格蛋白有被小窩，線粒體膜)的高密度標記并實現(xiàn)雙色超分辨成像。實驗結(jié)果表明，Pdots標記的網(wǎng)格蛋白有被小窩的超分辨成像結(jié)果與傳統(tǒng)熒光成像結(jié)果分辨率相比具有1.89倍的提升，微管結(jié)構(gòu)的雙色SOFI結(jié)果表明，其分辨率具有1.93倍的提升(如圖17所示)[84]。

圖17 聚合物熒光探針分子61～62化學結(jié)構(gòu)式，熒光閃爍特性和細胞微管多色標記圖像[84] Fig.17 Chemical structure and photoblinking property of fluorescent polymer probe molecules(61～62), multi-color microtubule images labelled with polymer dots[84]

6 結(jié)構(gòu)光照明成像(SIM/SSIM)

2000年，Gustafsson教授首次提出SIM[22-23]。SIM是基于激光的寬場顯微鏡，在入射激光光路中配置可移動的衍射光柵使入射光在物鏡焦平面產(chǎn)生強度分布為正弦形式的衍射條紋。成像過程中，通過條紋形狀的入射光與物體不同角度之間的混頻形成摩爾條紋。將原本在成像過程中物鏡對物體損失的高頻信息(物體的細節(jié)信息)的損失通過形成摩爾條紋以低頻信息(包含有原來物體的細節(jié)信息)的方式來記錄。經(jīng)過在頻域的變換，以高分辨率的形式重建出物體細節(jié)成分。SIM成像需要拍攝物體焦平面不同角度的圖像以便后期處理過程能夠完整呈現(xiàn)出被拍攝物體的細節(jié)信息。通常，SIM比傳統(tǒng)寬場顯微鏡能夠提高一倍的分辨率。2005年，Gustafsson教授提出飽和結(jié)構(gòu)光照明成像(SSIM)，將結(jié)構(gòu)光的條紋間隔壓窄以得到更高的分辨率，如圖18所示。

圖18 SIM/SSIM原理圖,寬場顯微鏡和SIM顯微鏡下GFP標記的COS-7細胞線粒體結(jié)構(gòu)圖 Fig.18 Principlephotos of SIM and SSIM. GFP-stained mitochondria in COS-7 cells imaged with conventional wide-field and structured illumination microscopy

從SIM的工作原理可知，SIM成像對所拍攝物體的熒光探針無特殊的要求。因此本文不對SIM成像所需的探針進行總結(jié)。

7 總結(jié)與展望

超分辨成像技術的出現(xiàn)打破了經(jīng)典的阿貝光學衍射極限理論，使得傳統(tǒng)光學顯微鏡可以以納米尺度的空間分辨率對亞細胞精細結(jié)構(gòu)、生物大分子空間構(gòu)象以及動態(tài)過程成像。超分辨成像技術極大地推動了生命科學的進步，已然成為科學研究中不可缺少的重要的工具。這些技術的發(fā)展離不開各科研團隊的不懈努力，從不同的角度實現(xiàn)了超分辨率成像。對于通過外加一圈環(huán)狀激光來壓縮調(diào)制點擴散函數(shù)的超分辨技術，最常用的是以Hell從理論提出并實現(xiàn)的受激發(fā)射損耗熒光顯微鏡(STED)，通過不斷地對系統(tǒng)的優(yōu)化以及對熒光探針的不斷開發(fā)，最終使得STED熒光顯微鏡在生物學研究實現(xiàn)了超高的分辨率。當然，通過調(diào)制PSF的技術并不限于STED，還包括基態(tài)損耗顯微鏡(GSD)等超分辨技術?；趩畏肿佣ㄎ患夹g的超分辨熒光顯微鏡(PALM、STORM)在近些年同樣取得了全面的發(fā)展并為生物學家提供了精細的亞細胞結(jié)構(gòu)，在細胞動態(tài)過程的研究中發(fā)揮了重要的作用。此外，基于探針熒光漲落的超分辨光學漲落成像(SOFI)技術憑借其優(yōu)異的時空分辨率、成像深度以及較低的光毒性，成為活細胞結(jié)構(gòu)和生物功能超分辨成像家族的優(yōu)秀成員。

目前主流的超分辨率成像方式已經(jīng)在生命科學的研究中扮演了舉足輕重的角色。這些技術的實現(xiàn)都離不開對成像探針的不斷發(fā)展及優(yōu)化。雖然目前常用的超分辨率熒光成像已經(jīng)取得一系列研究成果，使得科學家們能夠以空前的分辨率去探究生物學過程。但是，目前主流的熒光成像探針仍然存在進一步提升的空間。比如，通常應用到PALM和STORM的熒光蛋白具有內(nèi)源性，且具有較好的光轉(zhuǎn)換、光激活性質(zhì)，但是與其他的有機染料等熒光分子相比，其發(fā)射光子數(shù)目遠遠不及其他的熒光探針，給成像的對比度以及時間分辨率帶來一定的限制。通常用到超分辨熒光顯微鏡中的羅丹明衍生物、香豆素衍生物和花青衍生物等有機染料熒光探針具有較高光子數(shù)和光子發(fā)射效率。然而，有機小分子熒光探針的光穩(wěn)定性仍然有待進一步的提高。目前常用的有機熒光探針在長時間的成像過程中，仍然需要合適的除氧系統(tǒng)或者是合適的成像緩沖溶液的輔助。對于無機量子點(Qdots)作為生物熒光探針而言，其可調(diào)的發(fā)射光譜、較寬的吸收光譜、較高的量子效率等優(yōu)異的光學性質(zhì)在光學超分辨成像探針中也有著諸多的應用。非核-殼結(jié)構(gòu)的Qdots表現(xiàn)出的隨機熒光閃爍性質(zhì)恰好符合新興的超分辨光學漲落成像(SOFI)技術對熒光探針的要求。然而，即便是通過各種方式的修飾或改造，常用的Qdots中的重金屬離子所引起的生物毒性仍然是個值得關注的問題。近期應用到SOFI的聚合物量子點(Pdots)，具備了傳統(tǒng)熒光探針各項優(yōu)異的光學性質(zhì)，通過調(diào)控Pdots的結(jié)構(gòu)及材料尺寸，可以得到具有隨機閃爍特性的Pdots熒光探針。對于Pdots熒光探針在超分辨成像中的應用而言，目前只適用于SOFI以及對成像探針要求不苛刻的SIM成像中，因此在空間分辨率提升的方面仍有一定的空間。對于打破傳統(tǒng)的光學衍射極限，科學家們都展示出了極大的興趣。除了本文中著重列舉了發(fā)展的較早且技術較為成熟的幾類超分辨成像技術，近兩年的另一類超分辨成像技術正在受到人們的關注?？茖W家從生物樣品本身出發(fā)，通過一定的方式讓生物樣品實現(xiàn)膨脹實現(xiàn)超分率成像。因此，隨著超分辨技術的不斷擴增，對生物熒光探針的需求仍然日益增長。設計開發(fā)光學性能優(yōu)異、無生物毒性、普適性強的超分辨成像熒光探針仍是富有挑戰(zhàn)的研究課題。

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