新型多光子成像技術(shù)研究進展

石玉潔，張廣杰，陸政元，應(yīng)亞宸，賈薈琳，席 鵬

(1．北京大學 元培學院，北京 100871；2.北京大學 工學院 生物醫(yī)學工程系，北京 100871)

1 引 言

雙光子吸收是指在強光激發(fā)下，介質(zhì)分子吸收第一個光子到達虛能級后，在幾飛秒內(nèi)吸收第二個光子，獲得足夠的能量，從而躍遷到達激發(fā)態(tài)的過程。在雙光子吸收過程中，熒光分子吸收兩個能量較低(波長較長)的光子到達激發(fā)態(tài)，并在躍遷回到基態(tài)時產(chǎn)生熒光，可用于熒光成像。與單光子熒光成像相比，雙光子熒光成像可以使用波長更長的紅外光作為激發(fā)光源，從而有效減少生物組織對激發(fā)光的散射，并避免單光子自發(fā)熒光的干擾，獲得更大的成像深度和更好的信噪比；并且，由于雙光子激發(fā)過程需要更高的瞬時能量，只有激發(fā)光焦點處的熒光分子會產(chǎn)生熒光，這減少了組織其他部位的光損傷和熒光分子的光漂白現(xiàn)象，并使得雙光子成像具有良好的光學切片能力，便于對組織進行成像與三維重建。

自從1990年Denk等人應(yīng)用雙光子吸收的原理開發(fā)出第一臺雙光子激光掃描顯微鏡[1]，并應(yīng)用于生物觀測以來，雙光子顯微鏡憑借其優(yōu)勢，使人們可以在活體組織中研究細胞的真實狀態(tài)與相互作用，從而在科研和臨床檢測中獲得了廣泛應(yīng)用。在生物研究方面，雙光子顯微技術(shù)在神經(jīng)生物學[2]、胚胎發(fā)育[3]、腫瘤及活體組織成像中發(fā)揮了重要的作用；在臨床應(yīng)用方面，無標記雙光子內(nèi)窺等方法和相關(guān)器械的發(fā)展為研究者提供了更豐富的診斷與檢測手段。然而，生物組織具有很強的異質(zhì)性，其不同組分對光的散射和吸收仍然在一定程度上限制著雙光子成像的深度和分辨率。單純增加激發(fā)光的波長并不總能顯著增加雙光子成像的深度。如果想要獲取高分辨的更深處組織的信息，研究者需要機械穿刺組織或者移除感興趣組織的表面[4]以進行探測和成像，這樣就會對組織造成損傷。近年來，快速發(fā)展的三光子成像技術(shù)可以獲得更大的成像深度和更好的信號-背景比，從而有效地解決了這一問題。

本文對近年來快速發(fā)展的多光子成像技術(shù)，包括微型化雙光子成像技術(shù)、雙光子內(nèi)窺技術(shù)和三光子成像技術(shù)，對其基本原理、成像特點、發(fā)展過程及在生物醫(yī)學基礎(chǔ)研究和臨床上的應(yīng)用進行總結(jié)和討論，并對其廣泛的應(yīng)用和發(fā)展前景進行了展望。

2 微型化雙光子熒光成像技術(shù)

神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是腦，擁有十分復雜而動態(tài)的結(jié)構(gòu)，研究對象的空間尺度從單個突觸(～1 μm)到神經(jīng)回路(cm)，時間尺度從通道的開閉(<1 ms)到長時程記憶(可長達數(shù)年)[5]。借助熒光指示劑，光學顯微為時空尺度跨越幾個數(shù)量級的成像需求提供了可能[6]。

在研究神經(jīng)系統(tǒng)的活動時，研究者們常常希望盡可能保持神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的完整性，因而動物無創(chuàng)活體腦成像成為一大熱點。對于神經(jīng)組織成像，人們面臨一大問題就是腦組織散射。而雙光子熒光成像由于使用近紅外光，具有良好的深組織穿透性；同時得益于其非線性光學特性，具有固有的光學切片能力以及較小的光毒性和光漂白，這些優(yōu)勢使其成為光學無創(chuàng)在體腦顯微成像的首選[7]。

人們已經(jīng)成功地在臺式雙光子顯微鏡(例如加裝了雙光子激光器的激光共聚焦顯微鏡)上實現(xiàn)了動物在體腦成像，包括對小鼠在體樹突棘活動的高速、高效解析[8]等。但這種成像方式需要將動物頭部固定。頭部固定的實驗動物由于身體上的束縛和可能由此帶來的精神上的緊張，與正常生理狀態(tài)可能有所差異。更重要的是，在頭部固定的狀態(tài)下，動物無法正常地完成一些重要的社會行為，例如交配、打斗等，人們也就無從得知這些過程中的神經(jīng)活動情況。

面對這一問題，把顯微鏡做小，小到能夠讓動物攜帶它自由活動，是非常有效的解決方法。于是微型化雙光子顯微鏡應(yīng)運而生。微型化雙光子激光顯微鏡的關(guān)鍵設(shè)計在于微型化的激光掃描機構(gòu)[9]。人們探索了多種適用于微型化雙光子顯微的掃描機構(gòu)，其中最常見的是光纖掃描頭和微機電系統(tǒng)(MEMS)掃描鏡兩種。

2.1 第一臺微型化雙光子顯微鏡

第一臺微型化雙光子顯微鏡原型機于2001年首次被報道，它采用單模光纖尖端進行掃描[10]，掃描原理是利用一個壓電材料元件包裹光纖尖端，接通特定模式的交變電壓，使得壓電材料元件振動，并控制其頻率在光纖材料固有頻率附近，使光纖產(chǎn)生共振；這樣在x、y兩個方向都加上振動就可以合成一個二維掃描模式，如螺線掃描[11]和李薩如掃描[10]。

然而，采用這種掃描機構(gòu)的顯微鏡的質(zhì)量通常難以做到很輕，其掃描頻率也受到限制，且難以批量生產(chǎn)。

2.2 微型化雙光子顯微鏡的改進：引入微機電系統(tǒng)

2006年，Piyawattanametha等人[12]借助此前已在微型化共聚焦顯微鏡上嘗試過的技術(shù)，將微機電系統(tǒng)(MEMS)掃描鏡引入到微型化雙光子顯微鏡中。其光纖固定不動，通過集成電路控制一塊很小的反射鏡繞內(nèi)、外軸(即x、y兩個方向)的旋轉(zhuǎn)，從而使得反射出的激光束實現(xiàn)二維掃描，如圖1為MEMS掃描鏡的顯微照片。2009年，Piyawattanametha等人[9]的另一項工作同樣采用MEMS作為掃描機構(gòu)，其光學結(jié)構(gòu)如圖2所示。然而這些設(shè)備并沒有得到廣泛的應(yīng)用。究其原因大致有兩點：一，由于缺少可以高效保真地將920 nm飛秒激光脈沖傳輸至樣品的光纖，這些微型雙光子顯微鏡往往無法對重要的熒光探針如GCaMP等進行成像。二，這些微型化雙光子顯微鏡在實際工作時往往表現(xiàn)不佳，性能低于文獻報道的實驗條件下的結(jié)果。

圖1 二維MEMS掃描鏡的顯微照片。(a)3.2 mm×3.0 mm硬模中的750 μm× 750 μm 掃描鏡；(b)內(nèi)軸；(c)外軸[12]Fig.1 Micrograph of a two-dimensional MEMS scanner (a)750 μm ×750 μm scanning mirror in a 3.2 mm×3.0 mm die；(b)inner axis；(c)outer axis[12]

圖2 攜帶式雙光子顯微鏡。(a)總覽；(b)掃描鏡整體焊線封裝到印刷電路板上；(c)顯微鏡模型圖(剖面觀)；(d)激光照明(紅)和熒光收集(綠)光路[9] Fig.2 Portable two-photon microscope. (a)overview; (b)the scanner die is wirebonded onto electrodes on the printed circuit board (PCB); (c)computer-aided-design model of the microscope, in a cut-away view; (d)laser illumination(red arrows) and fluorescence collection(green arrows) pathways[9]

2.3 微型化雙光子顯微鏡的最新進展

最近，北京大學程和平課題組報道了微型化雙光子顯微鏡的最新進展——高速高分辨微型化雙光子顯微鏡(FHIRM-TPM)[13]，其外觀和基本結(jié)構(gòu)如圖3所示。該設(shè)備同樣采用的是MEMS掃描鏡設(shè)計，基本光學結(jié)構(gòu)仍類似于此前的同類產(chǎn)品，但對各種配件進行了改進和自主創(chuàng)新，包括自行研制的可以有效傳輸920nm飛秒激光的空心光子晶體光纖(HC-920)、自制的MEMS反射鏡和收集熒光的柔性光纖束SFB等，使其光學性能和實用性都得到了很大提升。這一新設(shè)備重量僅2.15 g，但橫向分辨率和軸向分辨率分別為0.64 μm、3.35 μm，與此前文獻報道的最高分辨率相比提升了約一倍。在256 pixel×256 pixel條件下，實現(xiàn)了光柵掃描頻率40 Hz、線掃頻率10 kHz。該系統(tǒng)可以有效激發(fā)Thy1-GFP和GCaMP-6f熒光(兩種常用熒光指示劑，在生命科學研究中具有重要意義)，且具有在小鼠活躍運動狀態(tài)下長時間穩(wěn)定工作的能力。

圖3 FHIRM-TPM結(jié)構(gòu)及外觀。 (a) 微型化顯微鏡的光學部件和機械組裝；(b) FHIRM-TPM實物照片(指尖和佩戴在小鼠上)[13] Fig.3 Structure and appearance of FHIRM-TPM. (a)Optical components and mechanical assembly of the miniature microscope; (b)photographs of a FHIRM-TPM on a fingertip and mounted to the head of a mouse[13]

產(chǎn)品頭部佩戴重量分辨率掃描速度(頻率、幀頻)掃描機制Helmchen et al.(2001)[10]25 g亞細胞尺度300～800 Hz(線掃描)光纖探針掃描Piyawattanametha et al.(2006)[12]-～1 呂m ～3.5 kHz(線掃描)MEMS掃描鏡Piyawattanametha et al.(2009)[9]2.9 g1.29±0.05 呂m(橫向)10.3±0.3 呂m(軸向)15 fps(光柵掃描)～1 kHz(線掃描)MEMS掃描鏡Zong et al. FHIRM-TPM(2017) [13]2.15 g0.64±0.02 呂m(橫向)3.35±0.37 呂m(軸向)40 fps(光柵掃描)10 kHz(線掃描)MEMS掃描鏡

2.4 微型化雙光子顯微鏡比較

表1將上述微型化雙光子顯微鏡進行了簡單對比[9-10,12-13]。可見，微型化雙光子顯微鏡從2001年誕生至今僅十余年歷史，但各項性能已有了長足的進步。以MEMS掃描鏡為掃描裝置的產(chǎn)品正逐漸成為目前的主流。目前，微型化雙光子顯微鏡主要用于腦成像。隨著技術(shù)的普及，應(yīng)當可以拓展應(yīng)用于更多不同組織的成像。同時改變不同的物鏡來適應(yīng)不同的成像需要，例如可以換用數(shù)值孔徑稍小的透鏡以獲得更大的視場。未來的研究方向包括進一步提升分辨率，以及在保證分辨率的基礎(chǔ)上進一步便攜化等。對于更深層的腦成像，可以通過與此前報道[14-15]類似的微創(chuàng)方法，將微型化的物鏡置入腦內(nèi)或在腦內(nèi)埋植一個中繼的漸變折射率(GRIN)透鏡來實現(xiàn)，還可以寄希望于新興的三光子技術(shù)等?？偠灾?，微型化雙光子顯微技術(shù)的發(fā)展和成熟，將為神經(jīng)科學等諸多領(lǐng)域提供一種有力的研究工具。

3 雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)

檢測、表征和分期是內(nèi)窺診斷的基本要素，而現(xiàn)有的臨床內(nèi)窺診斷技術(shù)尚無法良好地集成這些操作[16]。隨著生物光子學的發(fā)展，雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)克服了傳統(tǒng)顯微鏡的物理限制，提供了早期癌癥局部微創(chuàng)診斷的新途徑。

3.1 雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)優(yōu)勢

雙光子激發(fā)只發(fā)生在焦點附近，且激發(fā)光波長更長，散射更少，相對于單光子激發(fā)可以穿透更深的標本，并在一定程度上提高圖像對比度[17]。通過非線性光學內(nèi)窺鏡檢查，研究者可以分析所獲得的非線性信號的組合，從而全面了解內(nèi)部器官的生理、病理變化。

3.2 雙光子光纖內(nèi)窺鏡分類

類似于線性光學內(nèi)窺鏡，非線性光學內(nèi)窺鏡可以使用光纖來調(diào)節(jié)內(nèi)部器官的觀察距離和用于成像的光學、電子硬件之間的物理距離。雙光子光纖內(nèi)窺鏡按照光纖類型不同，可分為三類，分別是單模光纖(SMF)、光子晶體光纖(PCF)和雙包層光纖(DCF)，圖4為3種光纖的橫截面結(jié)構(gòu)示意圖。單模光纖(SMF)最先被用于光纖雙光子熒光成像系統(tǒng)[18]，但其主要缺點有二：(1)由于色散與非線性因素的影響，激光脈沖在光纖中傳播時會導致脈沖變寬；(2)由于數(shù)值孔徑很低，難以收集到足夠的非線性信號。為避免單模光纖的這些缺點，研究者們更多使用了光子晶體光纖(PCF)和雙包層光纖(DCF)：具有獨特光引導方式的光子晶體光纖能夠提高激發(fā)光束的傳遞效率和非線性信號的采集效率，而包層光纖可并入管狀壓電致動器中，從而便于實現(xiàn)內(nèi)窺鏡的微型化[19]。

圖4 光纖橫截面示意圖。(a)傳統(tǒng)單模光纖；(b)高反射率光子晶體光纖；(c)雙包層光纖[11,20] Fig.4 Schematic of fiber cross-section. (a)A standard fibre consisting of two bulk materials; (b)a high-index guiding PCF with a solid silica core; (c)double-clad fiber[11,20]

除對光纖進行深入研究外，研究者還試圖通過改良掃描裝置來提高雙光子內(nèi)窺鏡的成像速度和質(zhì)量：由級聯(lián)振鏡掃描、微機電系統(tǒng)鏡(MEMS鏡)和壓電或電磁激勵器組成的微型掃描機構(gòu)，已被用于掃描微型內(nèi)窺鏡中的光纖耦合的光，以產(chǎn)生高分辨率二維圖像[20]。圖5展示了在雙光子光纖內(nèi)窺鏡在檢測時不同的掃描方式[21]，分別是近端掃描(圖5(a))、近端線掃描(圖5(b))、近端空間光調(diào)制掃描(圖5(c))、遠端二維鏡掃描(圖5(d))、遠端光纖頭掃描(圖5(e))、遠端光纖物鏡掃描(圖5(f))。

圖5 掃描方式[21] Fig.5 Scanning mechanisms[21]

隨著雙光子內(nèi)窺鏡結(jié)構(gòu)的日益完善，雙光子內(nèi)窺成像在科學研究和臨床應(yīng)用中均獲得了較大的發(fā)展：M.T.Myaing等人[11]在雙光子顯微鏡中采用 DCF傳輸激發(fā)光與收集熒光，實現(xiàn)了以旋轉(zhuǎn)掃描的方式對癌細胞的成像；斯坦福大學的B.A.Flusberg等人[22]將MEMS鏡融入雙光子顯微成像技術(shù)，從而實現(xiàn)了大腦深部成像；密歇根大學的T.B.Norris等人[23]利用雙包層光子晶體光纖實現(xiàn)了對上皮組織雙光子顯微的增強；Ling Fu等人[24]采用雙包層光子晶體光纖和MEMS鏡相結(jié)合對大鼠食管組織和尾腱實現(xiàn)了內(nèi)窺成像。

3.3 雙光子內(nèi)窺成像技術(shù)最新進展

2017年，Liang W X等人[25]實現(xiàn)了第一個擁有亞細胞層次分辨率光纖內(nèi)窺平臺，可對活體內(nèi)生物組織進行無標記的雙光子代謝成像。該研究在正常小鼠腎臟模型中成功實現(xiàn)內(nèi)窺代謝成像。這臺裝置取得了前所未有的高檢測靈敏度，能夠捕獲無標記的亞細胞活體結(jié)構(gòu)和動態(tài)功能代謝信息。其空間分辨率和圖像質(zhì)量接近標準臺式雙光子顯微鏡。

在光纖方面，該裝置采用了純硅單模光纖的內(nèi)芯來減少背景噪音，并在內(nèi)包層摻入氟以減小內(nèi)包層折射率(等效于提高光纖內(nèi)芯的折射率)，從而獲得較高的探測強度。在物鏡部分，由于通常使用的變折射率透鏡(GRIN)會帶來很大的色差，從而產(chǎn)生很大的縱向位移，導致發(fā)射光無法在光纖端面上聚焦。因此，該裝置在變折射率透鏡之前加入一個相位衍射透鏡，抵消了色差，明顯減弱了縱向位移。圖6(b)可看出加入相位衍射透鏡后，對縱向位移的控制可以達到10 μm以內(nèi)。定制透鏡結(jié)構(gòu)示意圖如圖6(a)所示。該裝置還采用了創(chuàng)新的脈沖寬度調(diào)制方法使雙光子激發(fā)效率提高了2倍。結(jié)合2.5倍收集效率的提高以及4～10倍背景噪音的減弱，整體的信噪比提高了20～50倍。

圖6 微型物鏡與縱向聚焦位移。(a)定制物鏡示意圖；(b)樣品側(cè)縱向聚焦位移[25] Fig.6 Miniature objective and longitudinal focal shift. (a)schematic of the customized miniature objective; (b)sample-side longitudinal focal shift[25]

以急性小鼠腎缺血再灌注體內(nèi)模型為例：夾緊麻醉小鼠的左腎動脈和靜脈誘導其缺血(4 min)后，進行再灌注。用無標記雙光子內(nèi)窺技術(shù)對腎皮質(zhì)小管的氧化還原率變化進行了亞細胞層次的監(jiān)測。選用內(nèi)源性熒光物質(zhì)——NADH、FAD，氧化還原比表示為FAD/(FAD+NADH)。缺血時NADH濃度增加，氧化還原比隨之下降，再灌注后氧化還原比恢復正常，此時表明靜息狀態(tài)下腎小管細胞的線粒體NAD處于更氧化的狀態(tài)，即NAD+含量比NADH含量更多。這展現(xiàn)了雙光子內(nèi)窺顯微成像的高分辨率和高靈敏度。實驗過程中相關(guān)結(jié)果如圖7所示，缺血后紅色區(qū)域氧化還原比下降，再灌注后紅色區(qū)域變成綠色，氧化還原比恢復正常。

圖7 鼠腎臟缺血-再灌注體內(nèi)模型雙光子熒光內(nèi)窺成像[25] Fig.7 Endomicroscopy two photon fluorescence redox imaging of a mouse kidney ischemia-reperfusion model in vivo[25]

目前，雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)在多個方面已經(jīng)取得了巨大的進步，如可提供成功率更高的內(nèi)臟器官活檢指導，通過檢測異常宮頸膠原蛋白預(yù)測早產(chǎn)風險[26]，代替昂貴的臺式掃描雙光子成像顯微鏡進行傳染病成像研究等等。未來，雙光子顯微內(nèi)窺成像技術(shù)將向著進一步提高成像速度和信噪比的方向發(fā)展，并在臨床實踐中獲得更加廣泛的應(yīng)用。

4 三光子成像技術(shù)

雙光子成像技術(shù)能幫助研究人員看清高散射生物組織中更加深層的結(jié)構(gòu)，在胚胎、腫瘤和神經(jīng)組織的研究以及臨床組織成像中發(fā)揮了重要的作用。然而，散射仍然在很大程度上限制了雙光子成像的實際深度和效果。在實際探測散射嚴重的深層組織的過程中，非焦平面的組織會不可避免地產(chǎn)生一定的熒光信號，且深層熒光信號在到達表面的過程中本身也會有較大的散射，從而降低了信號背景比(signal-to-background ratio,SBR)[27]，影響成像效果和實際分辨率。為了獲得更好的成像效果和深度，研究人員將視線轉(zhuǎn)向了三光子成像技術(shù)。

4.1 三光子成像技術(shù)發(fā)展歷程

研究者們很早就在不同材料中觀察到了三光子吸收激發(fā)熒光的現(xiàn)象。1979年Catalano等人首先在低溫下使用PMT對無機材料PbI2和CdS的三光子非線性光學性質(zhì)[28]進行了定量的分析。1995年，Davey等人首次在有機高分子聚合物溶液中觀察到了三光子激發(fā)的熒光現(xiàn)象[29]，并定量分析了三光子吸收截面，由此提出了利用該原理將近紅外輻射轉(zhuǎn)化為可見光的設(shè)想。隨后，Hell等使用2,5-雙(4-聯(lián)苯基)唑(BBO)晶體，成功實現(xiàn)了這一設(shè)想[30]；同時，他們還結(jié)合Gryczynski等在鈣染料Indo-1[31]和一些蛋白質(zhì)[32]中觀察的到三光子激發(fā)現(xiàn)象，提出了將三光子熒光激發(fā)用于顯微成像這一重要的應(yīng)用方向。1996年，Xu等人[33]使用鎖模Ti-Sapphire激光器對分離中期染色體進行雙光子和三光子成像，并對這兩種成像技術(shù)進行了比較，驗證了三光子成像與雙光子成像一樣具有逐層掃描樣品并進行3D重建的能力(雖然它需要的激光功率約為雙光子的5～10倍)。同時，Wokosin等人[34]巧妙地通過在同一組織樣品中使用幾種激發(fā)波長不同的熒光染料，從而同時利用三光子、雙光子和單光子激發(fā)，使用同一光源實現(xiàn)了對樣品不同組分的成像。

盡管人們在1990年即認識到了三光子成像的潛力，并開始開發(fā)這項技術(shù)，但充分發(fā)揮三光子成像的優(yōu)勢則需要瞬時功率更高、波長更長的激光光源，這使得三光子成像技術(shù)嚴重受限于當時的光源技術(shù)和成本。人們一直對三光子成像的光源進行探索，期望找到更合適的光源。研究者們嘗試了如Cr-Fosterite激光器[35]、光參量振蕩器(OPO)[36]、孤子自頻移(SSFS)[50]等方法來產(chǎn)生更長的波長和更大的功率。其中，最重要的突破是Horton等人于2013年所報道的一種使用基于SSFS光源的三光子顯微鏡[37]，如圖8所示。該結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵的光源部分由光纖激光器、光子晶體桿和長通濾波器組成；在工作時，首先由光纖激光器產(chǎn)生1 550 nm的激光(脈寬360 fs，頻率1 MHz)，在該光束通過光子晶體桿的過程中，由于孤子自頻移效應(yīng)，該光束的波長會紅移至1 700 nm，同時通過形成孤子獲得100 000倍的能量提高和6倍的脈寬壓縮(脈寬65 fs，脈沖能量500 nJ)，并通過長通濾波器濾除原激光器的光后作為成像光源使用。如圖9所示，可以看到該三光子系統(tǒng)的成像深度和分辨率均比較理想，可以無損地看到大腦灰質(zhì)之下的白質(zhì)。

圖8 SSFS光源及三光子激光掃描顯微鏡示意圖[37] Fig.8 Schematic of SSFS and three-photon microscope setup[37]

圖9 三光子成像結(jié)果圖 (a)腦部血管；(b)神經(jīng)元[37] Fig.9 Three-photon imaging results. (a)Brain vasculature; (b)neurons[37]

除改進光源外，研究者們也在通過其他方法進一步提高三光子顯微鏡的性能。傳統(tǒng)的點掃描成像模式雖然可以獲得較高的分辨率和SBR，但這樣獲取一張圖片的時間大約需幾十毫秒[38]，無法應(yīng)用于需要在短時間內(nèi)激發(fā)很多熒光基團的技術(shù)中，如光遺傳學和高通量成像。Rowlands等人[39]基于時間聚焦(time focusing)激光脈沖，實現(xiàn)對特定區(qū)域的同時照明，實現(xiàn)三光子寬場成像；與寬場雙光子成像相比，該方法具有更大的成像深度，且可以精確控制照明范圍以同時激活在特定組織深度和區(qū)域內(nèi)的光敏感通道，使得在組織內(nèi)部進行光遺傳學研究成為可能。

4.2 三光子與雙光子成像技術(shù)比較

三光子成像是一項具有廣泛應(yīng)用和發(fā)展前景的顯微成像技術(shù)。與雙光子成像相比(表2)，由于三光子成像使用了波長更長的激發(fā)光源，從而很大程度上提升了成像深度——這與長波激發(fā)光在組織中的散射更低有關(guān)，但更重要的是因為三光子成像可以采用的1 600～1 800 nm的激發(fā)光能夠避開組織中水對紅外光的吸收峰，從而更好地穿透組織；同時，發(fā)生三光子吸收需要更高的激光能量，來自非焦平面的背景信號能被進一步削弱，從而可以提高SBR，獲得更高質(zhì)量的圖像。

表2 雙光子與三光子成像部分特性的比較

作為一項新興的成像技術(shù)，三光子成像仍然存在一定的缺陷。限制三光子成像應(yīng)用的主要因素在于三光子熒光過程對高能激發(fā)光的需求。從設(shè)備和技術(shù)方面來看，產(chǎn)生高能紅外激光需要專門開發(fā)的激光器，這在一定程度上提高了三光子熒光成像設(shè)備的成本和技術(shù)難度；從生物組織研究方面來看，通過三光子成像來獲取更大成像深度主要是為了對活體組織進行研究，而功率過強的激光(雖然平均功率較低)仍然有可能對組織造成損傷。因此三光子成像技術(shù)仍有相當大的優(yōu)化潛能，可以通過開發(fā)新型熒光染料、尋找更合適的激光光源、優(yōu)化探測器等方法，來進一步提高三光子成像深度、分辨率和信號強度。

目前，三光子成像的主要應(yīng)用范圍與雙光子成像大致相同，包括活體組織高分辨成像、光遺傳學研究等，并可能應(yīng)用于臨床的光學治療方法中。

5 總結(jié)與展望

近年來，新型多光子顯微成像技術(shù)取得了很大的發(fā)展。本文從以下三個方面對多光子成像技術(shù)的最新進展進行了介紹和總結(jié)：一是微型化雙光子成像技術(shù)，它比傳統(tǒng)的雙光子成像技術(shù)具有更快的成像速度，更高的分辨率，以及顯著更小的體積和質(zhì)量，從而可以在動物清醒、活動的情況下對神經(jīng)系統(tǒng)進行成像；二是雙光子內(nèi)窺技術(shù)，與傳統(tǒng)內(nèi)窺鏡相比擁有極高的檢測靈敏度與分辨率，并且能夠捕獲無標記的亞細胞活體結(jié)構(gòu)和動態(tài)功能代謝信息，從而集檢測、表征和分期功能為一體，更好地輔助疾病的檢測與鑒定；三是三光子成像技術(shù)，它具有比雙光子成像技術(shù)更大的成像深度和更優(yōu)的信號-背景比。

盡管這些新型多光子成像技術(shù)相比于傳統(tǒng)的成像技術(shù)具有諸多優(yōu)勢，但畢竟這一領(lǐng)域剛剛興起，如果要讓這些技術(shù)在生物醫(yī)學科研與臨床中真正獲得更加廣泛的應(yīng)用，我們?nèi)匀幻媾R許多問題。對于微型化雙光子技術(shù)而言，我們希望可以平衡好分辨率和體積的關(guān)系，在保證分辨率的條件下進一步減小體積，并希望可以將其應(yīng)用于除腦外的更多組織之中；對于雙光子內(nèi)窺技術(shù)，固然它具有很高的分辨率與靈敏度，但這也一定程度上犧牲了其成像速度與信噪比；三光子成像技術(shù)則主要受限于缺少低成本且能夠有效產(chǎn)生高功率遠紅外激光的激光器。要解決這些問題，不僅需要各項相關(guān)技術(shù)(如飛秒激光器、高靈敏度探測器、新型掃描裝置)的進步與革新，也需要我們對生物系統(tǒng)的復雜性加深理解。

新型多光子顯微成像技術(shù)領(lǐng)域目前正處于快速發(fā)展的時期，可以預(yù)見，隨著物理、工程、生物、醫(yī)學等多學科研究者們的合作與共同進步，以及各項相關(guān)技術(shù)的革新與成熟，多光子成像技術(shù)必將獲得更大的發(fā)展，并為生物成像與相關(guān)臨床診斷領(lǐng)域帶來一場強有力的革命。

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