結(jié)腸癌組織ILK與E-cadherin表達(dá)及預(yù)后意義

劉 偉 楊 鵬 李于紅 洪 琛 羅華立 顧衛(wèi)軍

惡性腫瘤的形成與發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，涉及到多個(gè)腫瘤基因，多種致癌通路。整合素鏈接激酶（integrin-linked kinase，ILK）屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶[1]。其在腫瘤形成的相關(guān)因素中處于交叉部位，并與惡性腫瘤的發(fā)展、侵犯和遷移有著密切的關(guān)系。上皮細(xì)胞鈣黏素（E-cadherin）是一種黏附分子，具有鈣依賴(lài)性，大多存在于上皮細(xì)胞中，主要在同型細(xì)胞之間起黏附反應(yīng)，并在細(xì)胞骨架中起重要作用[2]，在維持細(xì)胞形態(tài)和調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附中具有重要作用。研究[3-5]表明，ILK與E-cadherin在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。我們采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)結(jié)腸癌組織ILK和E-cadherin表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討ILK及E-cadherin表達(dá)水平與結(jié)腸癌的臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年—2016年期間于我院施行結(jié)腸癌根治性手術(shù)的50例標(biāo)本，均未施行放療和化療，25例正常結(jié)腸組織標(biāo)本中有15例選取距離惡性腫瘤邊緣至少5cm以上，并經(jīng)病理證明為正常結(jié)腸組織，10例正常結(jié)腸組織來(lái)自良性疾病結(jié)腸部分切除標(biāo)本。兩組數(shù)據(jù)符合分類(lèi)變量的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理原則。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采用甲醛溶液固定，所有標(biāo)本石蠟包埋，標(biāo)本切片厚度為4μm。50例結(jié)腸癌患者中男27例，女23例，年齡44～82歲，中位年齡57歲。腫瘤分化程度：高中分化13例，低分化37例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者22例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例；按美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)（AJCC）制定的 Dukes分期法[6]：A+B 期 24例，C+D期26例。

1.2 主要試劑 兔抗人ILK多克隆抗體（批號(hào)16B10235）；鼠抗人E-Cadherin單克隆抗體（批號(hào)16A10609）購(gòu)自北京信生元生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。SP免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒自北京諾博萊德科技有限公司購(gòu)得。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法 確定標(biāo)本的組織學(xué)類(lèi)型及分化程度行常規(guī)HE染色。50例結(jié)腸癌及25例結(jié)腸正常組織均行抗整合素連接激酶（ILK），抗E-cadherin的免疫組織化學(xué)染色，每一個(gè)蠟塊標(biāo)本連續(xù)切片4～5張，厚約4μL。切片脫蠟，水化后嚴(yán)格按照S-P法試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。抗原修復(fù)用檸檬酸緩沖液。一抗工作時(shí)濃度為1：50。運(yùn)用DAB顯色試劑盒染色，對(duì)比染色采用蘇木素，封片采用中性樹(shù)膠。陰性對(duì)照采用PBS代替一抗。染色為SP法過(guò)氧化物酶標(biāo)記的堿性磷酸酶染色。

1.4 結(jié)果判定 每張病理切片選擇約3個(gè)高倍視野，在每個(gè)視野中由約3個(gè)病理科醫(yī)師計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。整合素連接激酶（ILK）蛋白在腫瘤細(xì)胞漿中染色呈現(xiàn)為黃色或者為棕黃色提示為陽(yáng)性，根據(jù)陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分率進(jìn)行統(tǒng)計(jì):如果百分率≤5%記分為0分，在6%～50%之間記為1分，50%～80%記為2分，＞80%記為3分。陰性評(píng)分為0～1分，陽(yáng)性評(píng)分在2～3分之間。E-cadherin蛋白在腫瘤細(xì)胞質(zhì)中染色為棕黃色為表達(dá)陽(yáng)性，無(wú)染色提示陰性。采用Gofuku等[7]的判定標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞70%判定為正常表達(dá)，＜70%提示表達(dá)異常，判定為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)SPSS19.0軟件，計(jì)數(shù)資料比較，采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織及結(jié)腸正常組織ILK和E-cadherin表達(dá)情況 ILK在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)不同程度染色為黃色顆粒時(shí)提示為陽(yáng)性（封三圖1）。結(jié)腸癌組ILK表達(dá)陽(yáng)性率 66.0%（33/50），正常結(jié)腸組表達(dá)陽(yáng)性率24.0%（6/25）。結(jié)腸癌組織ILK表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于正常結(jié)腸組（P＜0.05）。E-cadherin在結(jié)腸癌細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色染色為低表達(dá)（封三圖2）。結(jié)腸癌組E-cadherin表達(dá)陽(yáng)性率42.0%（21/50），正常結(jié)腸組表達(dá)陽(yáng)性率96.0%（24/25），結(jié)腸癌組織E-cadnerin表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于正常結(jié)腸組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 結(jié)腸癌組及正常結(jié)腸組ILK和E-cadherin表達(dá)[例（%）]

2.2 ILK和E-cadherin表達(dá)與結(jié)腸癌各臨床病理因素之間的關(guān)系 統(tǒng)計(jì)分析顯示，ILK表達(dá)與結(jié)腸癌臨床分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05），與性別、腫瘤大小無(wú)關(guān)（P＞0.05）；雖然ILK在低分化結(jié)腸癌組織表達(dá)上調(diào)，但高、中、低分化之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。E-cadherin表達(dá)與結(jié)腸癌的臨床分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及結(jié)腸癌的分化程度均有關(guān)（P均＜0.05），但與腫瘤大小、性別無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表 2。

表2 ILK和E-cadherin表達(dá)與各個(gè)臨床病理因素相關(guān)性[例（%）]

2.3 ILK和E-cadherin相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析顯示，ILK與E-cadherin在結(jié)腸癌組織表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.421，P＜0.05），見(jiàn)表 3。

3 討論

整合素連接激酶（ILK）是一種含有多個(gè)錨蛋白重復(fù)序列的絲/蘇氨酸蛋白激酶，分子大小為59KD，它的基因定位于染色體11p5.5-11p15.4。ILK可以介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）之間的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程；可以參與調(diào)節(jié)控制整合蛋白、并可以參與Wnt等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。通過(guò)以上各種轉(zhuǎn)導(dǎo)方式進(jìn)而影響細(xì)胞的增生、凋亡、細(xì)胞黏附和遷移[8]。

表3 ILK和E-cadherin表達(dá)相關(guān)性

ILK過(guò)量表達(dá)能夠促進(jìn)一部分依賴(lài)性的腫瘤細(xì)胞存活。整合素是一種重要的黏附分子，ILK能提高細(xì)胞的可運(yùn)動(dòng)性，主要是它存在于整合素和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間這一有利的中間位置，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。在活體外，ILK能磷酸化PKB/Akt，激活PKB傳導(dǎo)通路，抑制上皮細(xì)胞的凋亡。ILK激活是通過(guò)黏附到細(xì)胞外基質(zhì)和磷脂酰肌醇（-3）激酶（PI3K）依賴(lài)途徑的生長(zhǎng)因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的，ILK激活促進(jìn)了細(xì)胞的存活并保護(hù)抑制了細(xì)胞的凋亡。在上皮細(xì)胞中ILK的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了停泊非依賴(lài)性細(xì)胞的增長(zhǎng)，細(xì)胞周期的延長(zhǎng)，并且增強(qiáng)細(xì)胞周期蛋白A的表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞的致瘤性[9]，ILK表達(dá)可抑制GSK3的活性，并能增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（activatorprotein-1，AP-1）的活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)，當(dāng)ILK的高表達(dá)時(shí)，能夠?qū)е禄|(zhì)金屬蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9） 上調(diào)，MMP-9 可以通過(guò)AP-1轉(zhuǎn)錄因子途徑。MMP-9表達(dá)增加，從而參與生長(zhǎng)因子信號(hào)通路，這些通路的激活在一定程度上可以降解細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)惡性腫瘤組織中血管的形成；增強(qiáng)了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，從而促進(jìn)了惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[10]。ILK還能夠磷酸化PKB Akt的Ser473，阻礙上皮細(xì)胞的凋亡，ILK是可以作用于一些磷酸化的調(diào)控元件，這些調(diào)控元件位于PKB Akt上游區(qū)，這些元件參與一些癌基因與PI3K通路，促進(jìn)VEGF的表達(dá)，VEGF促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、從而導(dǎo)致腫瘤血管的生成[11]。研究表明ILK在卵巢癌[12]、非小細(xì)胞肺癌[13]、胃癌[14]、乳腺癌[15]、喉鱗狀細(xì)胞癌[16]的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，ILK具有癌基因的特性。本研究結(jié)果顯示，在50例結(jié)腸癌組織ILK的陽(yáng)性表達(dá)率（66.0%）高于正常結(jié)腸組（P＜0.05），ILK 蛋白表達(dá)水平與臨床分期、結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05），與結(jié)腸癌的分化程度無(wú)關(guān)（P＞0.05）。結(jié)果提示，在結(jié)腸癌組織ILK的高表達(dá)會(huì)刺激結(jié)腸癌中某些惡性腫瘤相關(guān)因子活化以及某些與惡性腫瘤擴(kuò)散相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生，并促進(jìn)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移及侵襲，提示ILK高表達(dá)在結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移中起到了一定作用。

E-cadherin基因定位于16q22.1，是一種廣泛分布于上皮細(xì)胞的鈣依賴(lài)性細(xì)胞黏附分子。E-cadherin作為最重要的黏附分子，其表達(dá)異常將導(dǎo)致細(xì)胞的聚集、甚至侵襲和轉(zhuǎn)移，從而形成惡性腫瘤。研究[17]表明，在某些惡性腫瘤的組織E-cadherin的丟失導(dǎo)致細(xì)胞間接觸的減弱，進(jìn)而導(dǎo)致組織的惡性變及惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，E-cadherin在正常結(jié)腸組織中高表達(dá)，而在結(jié)腸癌組織中表達(dá)率明顯降低（P＜0.05）；E-cadherin表達(dá)水平與結(jié)腸癌臨床分期分化程度，結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），表明隨著結(jié)腸癌的惡性程度進(jìn)展加劇，E-cadherin表達(dá)也會(huì)有所下降，E-cadherin低表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞之間黏附減弱，從而引起結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移，提示E-cadherin表達(dá)異常與結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，E-cadherin低表達(dá)提示患者預(yù)后不良。

研究[18]表明，ILK能夠激活E-caherin的抑制物S-nail，從而使E-cadherin表達(dá)下調(diào)、細(xì)胞間連接減弱或消失，從而導(dǎo)致惡性腫瘤侵襲性的增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌組織ILK表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），這與既往文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[19]。可能的原因?yàn)镮LK過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Snail及ZEB1表達(dá)，這個(gè)過(guò)程是通過(guò)磷酸化激活PKB來(lái)實(shí)現(xiàn)的，從而抑制E-caherin表達(dá)，兩者的共同反應(yīng)促進(jìn)結(jié)腸癌的侵犯和遷移、擴(kuò)散。

總之，ILK及E-cadherin在結(jié)腸癌的發(fā)生、侵犯、轉(zhuǎn)移中起到積極的作用，兩者在結(jié)腸癌進(jìn)展中相互作用。臨床上聯(lián)合檢測(cè)ILK及E-cadherin有助于評(píng)估結(jié)腸癌的生物學(xué)行為，可能是結(jié)腸癌的一個(gè)新的診斷和治療的標(biāo)志。

圖1 ILK在結(jié)腸癌組織高表達(dá)（HE×200）

圖2 E-cadherin在結(jié)腸癌組織低表達(dá)（HE×200）

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