血管內(nèi)皮生長因子對大鼠離體心臟骨髓間充質(zhì)干細胞滯留率的影響

王 佶 胡權(quán)騰 何忠良朱成楚何雪明 辛順心 伍勇勇

目前細胞移植治療心臟疾病越來越受到人們的重視，隨著研究的深入，已有一些應用骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的動物實驗和臨床研究報道，但如何促進更多的移植細胞游走到組織間隙來提高其療效已成為國內(nèi)外研究熱點[1-5]。血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為血管通透劑對缺血性心臟病有一定的療效，但是否對移植細胞的遷移有影響報道極少[6]。本研究觀察VEGF預處理對正常灌注與缺血再灌注模型下大鼠離體心臟BMSCs滯留率的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 2周齡清潔級雄性SD大鼠20只作為BMSCs的來源，12周齡清潔級近交系雌性SD大鼠106只，體質(zhì)量（210.83±12.5）g制備離體心臟正常灌注和缺血再灌注模型，由浙江省實驗動物中心提供，實驗動物合格證：SCXK（浙）2014-0001。所有大鼠均在相同的條件下飼養(yǎng)，人工光照明、暗各12h/d。

1.2 主要試劑和儀器 Langendorff心臟離體灌注裝置、pH計（美國Beckman）；高速冷凍離心機（德國Hermle）；倒置相差/熒光顯微鏡（日本 Olympus公司）；Countess自動細胞計數(shù)儀（Invitrogen Proprietary公司）；Genomic DNA Purification Kit（PromegaWizard公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS緩沖液（美國GibcolBRL公司）；PCR試劑盒（北京易萊西諾生物科技有限公司）；PCR引物（美國invitrogen公司），7300 Real-time PCR System（ABI公司）；小鼠抗大鼠 CD29、CD34、CD44、CD45 和CD106 的單克隆抗、VEGF、DAPI（Sigma 公司，批號SAB4700294、SAB1403649、SAB1405590、SAB4700471、SAB1305520、SRP6255、D9542）。

2 實驗方法

2.1 大鼠BMSCs分離、培養(yǎng)和鑒定 取2周齡清潔級雄性SD大鼠20只，氯胺酮30mg/kg、安定5mg/kg腹腔注射麻醉,無菌條件下取出股骨和脛骨，用DMEM培養(yǎng)基緩慢沖洗骨髓腔，沖洗出來液體離心收集細胞，接種到含DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置37°C、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，原代培養(yǎng)24～48h后換液，細胞長滿70～80%融合時按1：3傳代，3代以后的細胞用于實驗；用倒置顯微鏡觀察第3代BMSCs的形態(tài)，流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45 和 CD106 的 表 達 ，用Countess自動細胞計數(shù)儀記錄活細胞總數(shù)。

2.2 實驗分組與模型構(gòu)建 （1）大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法將大鼠分成正常灌注組與缺血再灌注組，每組50只，其中正常灌注組又分成BMSCs組（n=25）與 BMSCs+VEGF組（n=25），缺血再灌注組也分成BMSCs組（n=25）與BMSCs+VEGF組（n=25）。（2）正常灌注組中BMSCs組大鼠給予戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔注射麻醉、肝素（250U/kg）抗凝，快速顯露，保留3～4mm主動脈剪下心臟，將灌注管固定在主動脈端，連接離體心臟灌注系統(tǒng)，灌注液流量約8mL/min，待心臟穩(wěn)定搏動15min后，注入BMSCs細胞 1mL（1×106/mL），停 2min 后重新開始灌注，于 5、10、30、60、120min 時間點收集從心臟流出的所有灌注液，每個時間點5只。注入高鉀停跳液使心臟在舒張期停跳后，取出心臟，放入液氮中存儲。BMSCs+VEGF組灌注BMSCs前預先向心臟中注入VEGF1mL（濃度 1000μmol/L），其他步驟與 BMSCs組相同。（3）缺血再灌注組先建立心臟離體灌注模型，待心臟穩(wěn)定搏動15min后，關(guān)閉灌注系統(tǒng)使心肌缺血30min，建立缺血再灌注模型，其他操作步驟與正常灌注組相同，見表1。

2.3 測定 BMSCs滯留率 （1）RT-PCR檢測：從BMSCs中提取的DNA按梯度制成細胞數(shù)-CT值的標準曲線。把備用的心臟制成10%組織勻漿，用紫外可見分光光度計測量OD260/280比值，判定DNA的質(zhì)量，計算濃度；（2）RT-PCR擴增：SRY上游引物：5’-3’CATCGAAGGGTTAAAGTGCCA，下游引物：5’-3’ATAGTGTGTAGGTTGTTGTCC。每個樣品含量:10uL的目標 DNA，上下游引物各 1μL，12.5μL的Power：SYBR Green PCR Master Mix 和 0.5μL 的DEPC水。循環(huán)條件是：95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃退火 1min，每個樣本重復 3 次，7300 Realtime PCR System檢測SRY目標基因。

2.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用平均值±標準差（s） 表示。各組內(nèi)5個時間點比較采用配伍組設(shè)計方差分析；兩兩組間比較采用t檢驗和秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠BMSCs分離培養(yǎng)和鑒定 形態(tài)學觀察：采用貼壁法，通過換液、培養(yǎng)去除不貼壁細胞，細胞長到培養(yǎng)瓶面積70%可進行第1次傳代，開始細胞形態(tài)不一，主要為圓形、梭形、紡錘形、多角形。經(jīng)過3次傳代后純化，細胞呈長梭形纖維狀，生長均勻，形態(tài)趨于一致。每個培養(yǎng)瓶可收集到BMSCs（1.8±0.3）×106個，平均細胞直徑為17.2μm。經(jīng)流式細胞儀鑒定計數(shù)，其中 CD34、CD45 表達陰性，CD29、CD44、CD106表達陽性的細胞占95%以上，分離培養(yǎng)后的細胞具有較高的純度；用Countess自動細胞計數(shù)儀進行計數(shù)可計算出BMSCs的活性，傳至第3代的BMSCs細胞活性接近100%，

3.2 動物模型建立 取大鼠106只，其中在手術(shù)中損傷心臟1只，主動脈根部破裂1只，心臟提前停止跳動4只，其余均在1min內(nèi)取下心臟并懸掛至Langendorff裝置，成功建立大鼠心臟離體灌注模型，成功率94.3%。

3.3 PCR檢測結(jié)果 從BMSCs中提取的DNA經(jīng)101～105倍稀釋后獲得每個濃度的CT值，制成細胞數(shù)-CT值的標準曲線，推算出細胞數(shù)量的計算公式：細胞數(shù)=10（31.49-Ct）/3.2412。滯留率=心臟內(nèi)滯留的細胞量/灌注細胞總量，心臟內(nèi)滯留的細胞量通過RT-PCR 計算得出：（1）正常灌注 BMSCs組在 5、15、30、60、120min五個時間點平均BMSCs滯留率之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），這說明BMSCs的滯留主要發(fā)生在細胞注射后的5min之內(nèi)，之后減少不明顯；（2）缺血再灌注組與正常灌注組各同一時間點的平均BMSCs滯留率比較，缺血再灌注組均顯著高于正常灌注 BMSCs組（P 均＜0.05）；（3）正常灌注 BMSCs+VEGF組與正常灌注BMSCs組各同時間點滯留率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；缺血再灌注BMSCs+VEGF組與缺血再灌注BMSCs組各同時間點滯留率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；（4）缺血再灌注BMSCs+VEGF組與正常灌注BMSCs+VEGF組同時間點比較，滯留率均明顯增加（P均＜0.05），見表 2。

4 討論

BMSCs是骨髓中的一種具有自我更新和多向分化能力的多功能非造血干細胞，它可以通過在體外分離、培養(yǎng)、擴增獲得較多的細胞數(shù)并仍有分化的潛能，在特定條件下可分化為軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞等多種組織細胞，對損傷組織有顯著的修復功能，并且具有獨特的免疫調(diào)節(jié)特性（免疫抑制）和極低的免疫原性（免疫赦免）等重要的生物學特性[7-8]。這些特點有可能使BMSCs移植治療心臟疾病成為切實而有效的治療方法，而BMSCs的歸巢和滯留對于細胞移植的治療效果至關(guān)重要。

表1 各組大鼠干預處理情況

表2 各組大鼠離體心臟不同時間點BMSCs滯留率（%，±s）

表2 各組大鼠離體心臟不同時間點BMSCs滯留率（%，±s）

注：與正常灌注組BMSCs比較，*P＜0.05；與正常灌注BMSCs+VEGF組比較，△P＜0.05；BMSCs：骨髓間充質(zhì)干細胞；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子

組別正常灌注BMSCs組正常灌注BMSCs+VEGF組缺血再灌注BMSCs組缺血再灌注BMSCs+VEGF組鼠數(shù)25 25 25 25 5min 16.32±3.84 19.38±4.66 36.96±4.79*41.46±5.88*△10min 14.02±5.23 19.54±5.11 35.88±4.76*37.82±5.74*△30min 12.48±3.46 16.68±2.64 28.05±3.46*32.82±3.53*△60min 12.42±3.61 16.06±2.12 27.04±6.35*33.24±6.19*△120min 12.42±3.49 15.60±2.00 27.06±5.84*31.60±3.26*△

本實驗通過檢測大鼠離體心臟正常灌注下BMSCs滯留率，發(fā)現(xiàn)注入心臟后BMSCs滯留大部分發(fā)生在5min內(nèi)，之后幾乎所有細胞被沖出心臟，滯留率較低，在16.32%左右，與Amado等[9]追蹤BMSCs移植后的結(jié)果相同。同時發(fā)現(xiàn)大鼠離體心臟缺血再灌注可以顯著增加BMSCs的滯留率，達到36.96%，原因是心肌缺血會對一些信號分子產(chǎn)生應答激活，損傷部位釋放趨化因子、黏附分子、生長因子和酶等多種配體，與BMSCs上表達的相應受體結(jié)合，驅(qū)動BMSCs遷移到受損部位的作用[10-11]。Mangi等[12]用大鼠心肌梗塞模型，上調(diào)BMSCs的ATk基因表達后注入心臟發(fā)現(xiàn)細胞移植的治療效果要明顯好于對照組，因為增強細胞對低氧的耐受，減少細胞凋亡，提高BMSCs的存活率。有研究表明，將過表達PKCε基因的BMSCs注入急性心肌梗死大鼠模型的心臟后，BMSCs在心肌的滯留率和存活率明顯提升，并改善心室重塑和心臟功能，且這種效應在抑制CRCR4和PI3K后依然存在，PKCε基因的過表達可以激活SDF-1/CXCR4軸和PI3K/AKT信號通路，兩者在間充質(zhì)干細胞的歸巢過程中起重要作用[13]。

VEGF是體內(nèi)一種強效促血管生成因子，也是一種強效血管通透劑。雖然VEGF和BMSCs各自治療心臟缺血性疾病的有許多報道，但兩者聯(lián)合應用是否有協(xié)同作用的報道卻并不多見。鑒于此，有學者將轉(zhuǎn)染VEGF基因的MSCs移植于心肌梗死區(qū)域后，MSCs可在心肌梗死區(qū)順利存活，實驗組毛細血管數(shù)量顯著高于對照組，心功能改善程度也優(yōu)于對照組[14]。Wang等[15]通過體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，VEGF通過激活FAK和Rac1信號分子促進BMSCs遷移，且這種效應在BMSCs向神經(jīng)細胞方向預誘導分化24h后最明顯，而在心肌細胞中尚未見報道。本研究中正常灌注BMSCs組與正常灌注BMSCs+VEGF組大鼠離體心臟BMSCs滯留率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；缺血再灌注BMSCs組和缺血再灌注BMSCs+VEGF組大鼠高體心臟BMSCs滯留率差異也無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明VEGF作為血管通透劑對提高BMSCs滯留率可能無明顯作用，不能促使更多的細胞進入組織間隙，分析原因可能一是大鼠離體心臟經(jīng)VEGF預處理后，立即開始灌注BMSCs，VEGF沒有起作用的緩沖時間，影響了其療效，二是VEGF的生物半衰期比較短，注入體內(nèi)易稀釋，而且缺血受損組織會釋放某些生物因子，刺激BMSCs分泌促血管生成因子VEGF影響微血管。因此，一次性注入外源性VEGF可能對整個滯留過程影響并不大。此外，有文獻報道，將BMSCs移植到受損心肌后是通過提高血管新生，增加血供和營養(yǎng)支持來發(fā)揮修復受損心肌的作用，這種作用依賴于胎盤生長因子（PLGF），而不是如經(jīng)典學說認為的那樣大量分化為心肌細胞，以此來替代受損的細胞[16]，也有學者發(fā)現(xiàn)外源性補充VEGF對BMSCs的血管再生效應有抑制作用[17]。

總之，缺血再灌注可以顯著增加大鼠離體心臟的BMSCs滯留率，而血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）對其無明顯增加作用，在受損心肌中是否有作用有待進一步深入研究。

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