多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)選菟杞強(qiáng)腎口服液提取工藝＊

陶松 ，劉玲 ，魏筱華 ，潘德城 ，周健 ，段舟萍

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南昌 330006；2、江西省人民醫(yī)院藥學(xué)部，南昌 330008)

菟杞強(qiáng)腎口服液是根據(jù)古人治療不孕不育經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)，汲取了五子衍宗丸[1]的組方特點(diǎn)，結(jié)合腎虧引起的不育不孕的病因病機(jī)和自身的臨床經(jīng)驗(yàn)所立的經(jīng)驗(yàn)方，是我院傳統(tǒng)方劑。該方由枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子、五味子、桑葚子，韭菜子及淫羊藿八味中藥組成，本方枸杞子、菟絲子為方中之君藥，主要活性成分為為枸杞多糖、菟絲子多糖[2，3]。 覆盆子、五味子、桑椹子、淫羊藿、韭菜子為臣藥；車前子滲利濕熱，起著“反佐”作用，可以達(dá)到補(bǔ)中瀉，澀中有利，瀉中寓補(bǔ)，并治尿后余瀝不盡，為本方之佐藥。諸藥合用共奏益腎補(bǔ)精，助陽(yáng)止遺的功效。其中淫羊藿含有主要有效成分為多糖和黃酮類化合物，還含有生物堿類、酚苷類、微量元素和有機(jī)酸等[4]，它們是菟杞強(qiáng)腎口服液發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，且主要有效成分易溶于水，本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以淫羊藿苷、干膏得率、總黃酮、總多糖的含量為考察指標(biāo)，采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法[5]優(yōu)選菟杞強(qiáng)腎口服液提取工藝。

1 儀器與試藥

UV-1206紫外分光光度計(jì)；TDE5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)；島津AUW220十萬(wàn)分之一電子天平；AB104－N型萬(wàn)分之一天平；KDM型調(diào)溫電熱套 （山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；Agilent 1100 高效液相色譜儀 (Agilent，USA)；SK5200H 型數(shù)控超聲波清洗器；超純水機(jī)；10ml具塞試管；所用玻璃儀器均為天玻牌A級(jí)。

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-200707，含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：110833-200503，含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；淫羊藿苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)：110737-200312）；實(shí)驗(yàn)所用藥材購(gòu)自江西江中武寧中藥有限公司，經(jīng)本院中藥專家鑒定均為合格品；甲醇（色譜純，山東禹王實(shí)驗(yàn)有限公司化工分公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)此方的傳統(tǒng)服用方法，采用水為溶媒，試驗(yàn)以提取時(shí)間、提取次數(shù)、加水量為考察因素，以干膏得率、淫羊藿苷、總黃酮及多糖的含量作為考察指標(biāo)，正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

2.2 淫羊藿苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水（63：37）；體積流量：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μl。

2.2.2 溶液制備 對(duì)照品溶液的制備：取淫羊藿苷對(duì)照品2.24mg，精密稱定，置10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置10ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻即得對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：精密吸取菟杞強(qiáng)腎口服液2ml置于25ml量瓶中，加甲醇超聲處理30min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取淫羊藿苷對(duì)照品溶液 1、5、10、15、20μl注入高效液相色譜儀， 記錄色譜峰面積，以對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)對(duì)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y=1318.1x+13.923，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。線性范圍在0.0224-0.448μg，呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取淫羊藿苷對(duì)照品溶液（0.0224mg/ml），重復(fù)進(jìn)樣 6 次，每次進(jìn)樣 10μl，按色譜條件測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果淫羊藿苷的峰面積平均值為314.6，RSD值為1.12%，表明儀器的精密度良好。

2.2.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，放置 0、2、4、8、12、24h 后，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析。記錄峰面積，計(jì)算，結(jié)果淫羊藿苷峰面積的RSD值為1.43%，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品各6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，以淫羊藿苷峰面積平均值計(jì)算含量，結(jié)果平均含量為0.2083mg/ml，含量的RSD值為1.39%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的本品溶液（批號(hào)：20170721）2ml，各 6 份，分別精密吸取淫羊藿苷對(duì)照品溶液 2ml（0.224mg/ml），搖勻，按樣品的處理方法將其制成供試品溶液，按上述液相色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果淫羊藿苷的平均回收率為100.08%，RSD為1.25%，該法回收率較高。

2.3 菟杞強(qiáng)腎口服液中總黃酮含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品22.00mg，置于100ml容量瓶中，加60%乙醇適量超聲溶解，再加60%乙醇至刻度，搖勻，即得每1ml含無(wú)水蘆丁0.22mg的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密吸取本品溶液1.0ml于10ml容量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，邊加邊搖，待沉淀完全后，移至10ml離心管中，離心10min，取上清液即得供試品溶液。

2.3.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 用蘆丁對(duì)照品溶液測(cè)定菟杞強(qiáng)腎口服液中總黃酮的含量。精密吸取對(duì)照品溶液、樣品溶液各4.0ml，分別置于25ml量瓶中，按2.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下方法操作，并在400-600nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在510nm處有最大吸收波長(zhǎng)，其它成分對(duì)測(cè)定法無(wú)干擾，因此本試驗(yàn)以510nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 使用10ml刻度吸管，精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0ml，分別置于25ml量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉1.0ml，混勻，放置6min，然后加入10%硝酸鋁1.0ml，混勻，再放置6min；加入1mol/L氫氧化鈉溶液10.0ml，用60%乙醇稀釋至刻度，混勻，放置15min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法于510nm處測(cè)定吸光度，以蘆丁對(duì)照品溶液濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照品濃度在0.0088-0.0616mg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系，其回歸方程為：y=12.817x-0.0211，r=0.9999。

2.3.5 方法學(xué)考察

2.3.5.1 精密度與重現(xiàn)性考察 取同一批樣品溶液，精密吸取2.5ml各6份置于25ml容量瓶中，按2.3.2方法制備供試品溶液，得6份25ml樣品溶液，每份各取4ml 3份，按2.3.4方法測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果平均RSD為1.34%，說(shuō)明該方法的精密度和重復(fù)性良好。

2.3.5.2 顯色穩(wěn)定性考察 精密吸取樣品溶液4ml于25ml容量瓶中，按2.3.4的方法測(cè)定吸光度。當(dāng)顯色體系反應(yīng)完全后，每隔5min記錄一次吸光度值，連續(xù)25min考察顯色穩(wěn)定性。結(jié)果在25min內(nèi)樣品溶液吸光度變化不大，RSD為0.57%，故本實(shí)驗(yàn)選擇在顯色體系反應(yīng)完全后25min內(nèi)測(cè)定吸光度值。

2.3.5.3 加樣回收率考察 精密移取已知總黃酮含量（2.5442mg/ml）成品溶液 5ml各6份，按樣品含量與加入對(duì)照品含量（1：1）的比例加入蘆丁對(duì)照品，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率99.34%，RSD為1.65%，該方法回收率較高。

2.4 菟杞強(qiáng)腎口服液中總多糖含量測(cè)定

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)品8.35mg置于100ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1ml含葡萄糖標(biāo)品0.0835mg的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密吸取樣品溶液1ml，加無(wú)水乙醇 4ml，離心（4000r/min）10min，棄去上清液，沉淀用80%乙醇溶液洗滌2-3次，每次8ml，離心10min，棄去洗液，殘?jiān)梅兴崛?次，每次5ml，合并提取液至50ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻即得。

2.4.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密吸取0.8ml葡萄糖對(duì)照品溶液（0.0835mg/ml）于10ml具塞試管中，分別加水補(bǔ)至2.0ml，再分別加入6%苯酚1.0ml，搖勻，再迅速沿壁滴加濃硫酸5.0ml，搖勻，沸水浴中加熱15min ml，取出，迅速冷卻至室溫（冰水浴中）。以試劑為空白，進(jìn)行比色測(cè)定，在400-800nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在490nm處有最大吸收，因此本試驗(yàn)以490nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5ml， 置于 10ml具塞試管中，分別加水補(bǔ)至2.0ml，再分別加入6%苯酚1.0ml，搖勻，再迅速沿壁滴加濃硫酸5.0ml，搖勻，沸水浴中加熱15min，取出，迅速冷卻至室溫（冰水浴中）。以試劑為空白，于490nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A，以葡萄糖溶液濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，吸收度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A=55.041X+0.0251，相關(guān)系數(shù) r=0.9999；結(jié)果表明，葡萄糖在0.0021mg/ml-0.0157mg/ml范圍內(nèi)與吸收度具有良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 按 “2.4.2供試品溶液的制備”項(xiàng)下制備菟杞強(qiáng)腎口服液樣品溶液一份，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6次，記錄其吸光度值，結(jié)果RSD為0.33%（n=6），說(shuō)明儀器精密度良好。

2.4.6 顯色穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液0.2ml，置于10ml具塞試管中，分別加水補(bǔ)至2.0ml，再分別加入6%苯酚1.0ml，搖勻，再迅速沿壁滴加濃硫酸5.0ml，搖勻，沸水浴中加熱15min，取出，迅速冷卻至室溫（冰水浴中）。另以2.0ml蒸餾水作為空白對(duì)照同上平行操作，每隔5min于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，連續(xù)測(cè)定30min考察顯色穩(wěn)定性，結(jié)果平均吸光度為0.273，RSD為1.13%，說(shuō)明樣品在顯色后30min內(nèi)吸光度基本不變，顯色穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按 “2.4.2供試品溶液的制備”項(xiàng)下制備菟杞強(qiáng)腎口服液樣品溶液6份，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定，記錄其吸光度值，結(jié)果菟杞強(qiáng)腎口服液樣品中總多糖平均含量為9.0139，RSD=1.98%（n=6）， 說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率考察 精密移取已知總多糖含量（9.0139mg/ml）成品溶液 1ml各6份，按樣品含量與加入對(duì)照品含量（1：1）的比例加入葡萄糖對(duì)照品，按“2.4.2供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定條件測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果菟杞強(qiáng)腎口服液平均回收率為 100.25%，RSD=1.47（n=6），該方法回收率較高。

2.5 干膏得率的測(cè)定 照 《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版一部）附錄XA浸出物測(cè)定法，精密量取提取定容液25ml，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3h，移置干燥器中，冷卻30min，迅速精密稱定重量，以干燥品計(jì)算供試品中浸出物的含量。按下列公式計(jì)算干膏得率。

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 按1/10處方量稱取36g藥材，共9份，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，考察加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行提取。分別按L9(34)正交試驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)，煎煮藥液定容至100ml，取樣測(cè)定干膏得率、淫羊藿苷、總黃酮及總多糖的含量。本試驗(yàn)采用綜合評(píng)分法對(duì)菟杞強(qiáng)腎口服液提取工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

通過(guò)SPSS軟件，測(cè)定結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，結(jié)果表明直觀因素中，綜合值：C>B>A。因此影響提取工藝的因素順序?yàn)镃（提取次數(shù)）>B（提取時(shí)間）>A（加水量）。方差分析中，C因素對(duì)有效成分含量及干膏得率有顯著性影響。所以僅提取次數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響，加水量和提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均沒(méi)有顯著性影響，根據(jù)直觀分析確定最佳提取工藝為A2B3C3，但因加水量和煎煮時(shí)間均無(wú)顯著性影響，從實(shí)際生產(chǎn)節(jié)約成本考慮可初步確定提取工藝為：加水量10倍，煎煮3次，每次2h或加水量10倍，煎煮3次，第一次2h，第二、三次各1h，以下試驗(yàn)進(jìn)一步考察這兩種提取條件的差異，以最終確定最佳提取工藝。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 工藝1：稱取1/10處方量藥材共36g，共3份，加10倍水煎煮3次，每次2h，合并煎煮液，過(guò)濾，減壓濃縮，定容至一定體積，備用。工藝2：稱取 1/10處方量藥材共 36g，共 3份，加 10倍水煎煮3次，第一次2h，第二、三次各1h，合并煎煮液，過(guò)濾，減壓濃縮，定容至一定體積，備用。取以上6個(gè)樣品分別測(cè)定其淫羊藿苷、干膏得率、總黃酮及多糖的含量。結(jié)果見(jiàn)表4，可以看出，工藝一和工藝二的結(jié)果無(wú)明顯差異，從生產(chǎn)中節(jié)約成本和縮短生產(chǎn)周期考慮，選擇以工藝二即加水量10倍，煎煮三次，第一次2h，第二、三次各1h作為最終提取工藝。RSD均符合要求，表明優(yōu)選出的工藝條件穩(wěn)定可靠。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

3 討論

菟杞強(qiáng)腎口服液的處方是江西省中醫(yī)院伍炳彩教授根據(jù)古人治療不孕不育經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)，汲取了五子衍宗丸的組方特點(diǎn)，結(jié)合腎虧引起的不育不孕的病因病機(jī)和自身的臨床經(jīng)驗(yàn)所立的經(jīng)驗(yàn)方。菟杞強(qiáng)腎口服液是根據(jù)伍炳彩教授的臨床驗(yàn)方開(kāi)發(fā)的，主要針對(duì)腎虧引起的不孕不育，適應(yīng)證突出，明確，具有治愈腎虛精少、陽(yáng)痿早泄、遺精、精冷、余瀝不清等功效?，F(xiàn)已在臨床廣泛應(yīng)用，療效好，受到患者的一致好評(píng)。

考慮到此方為傳統(tǒng)湯劑，通過(guò)文獻(xiàn)檢索枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子、五味子、桑葚子，韭菜子及淫羊藿八味中藥化學(xué)成分得知有效成分水溶性成分較多，故采取水提法。本方枸杞子、菟絲子為方中之君藥。覆盆子、五味子、桑椹子、淫羊藿、韭菜子為臣藥，故以活性成分總黃酮、總多糖、淫羊藿苷、干膏得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)分析。據(jù)對(duì)預(yù)期影響大小賦予不同權(quán)重，行加權(quán)求和而轉(zhuǎn)化為單一指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。將總多糖含量和總黃酮含量的權(quán)重系數(shù)定為0.3，淫羊藿苷和干膏得率的權(quán)重系數(shù)定為0.2，保證分析選取指標(biāo)全面性，通過(guò)該方法確定最佳提取工藝，證明了優(yōu)選的工藝確實(shí)合理可行。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

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