響應(yīng)面法優(yōu)化“金花”菌培養(yǎng)基配方

周國慶，譚玉梅，王亞萍，黃永會，任錫毅，劉永翔，劉作易

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025 ；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，貴州 貴陽 550009；3.貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，貴州 貴陽 550006；4.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴州 貴陽 550006)

茯磚茶是我國特有黑茶，屬于后發(fā)酵茶[1]。茯磚茶具有多元化的保健功能，其中的茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，即黃烷醇類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類及酚酸類中多元酶類及其衍生物的混合物。茶多酚還是一種新型天然抗氧化劑，具有清除自由基、抗衰老等作用[2]；另外對預(yù)防心血管疾病效果尤為顯著，具有降血壓、血脂、血糖等方面的作用[3]。

茯磚茶制造主要步驟包括毛茶制作、毛茶堆放、半成品拼配、氣蒸、渥堆、壓制成型、發(fā)花干燥和切割包裝等[4]。其中“發(fā)花”是茯磚茶生產(chǎn)制造過程中最獨特工藝，發(fā)花過程就是“金花”菌產(chǎn)生的過程[5]；“金花”越多，茶葉質(zhì)量被認為越好，其被作為黑茶品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標[6-7]。冠突曲霉是發(fā)花過程中的優(yōu)勢菌種，也正是它在茶葉發(fā)酵過程中產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物賦予了茯磚茶各種保健功效。

傳統(tǒng)的茯磚茶制作采取的是自然發(fā)花，存在發(fā)花周期長及產(chǎn)品不穩(wěn)定的問題，目前大多數(shù)茶葉生產(chǎn)企業(yè)也都存在發(fā)花差，發(fā)花參差不齊甚至不發(fā)花等問題[8]。研究者們通過研究發(fā)現(xiàn)人工接種發(fā)酵從發(fā)酵周期、功效成分產(chǎn)量、感官評定等各方面都明顯優(yōu)于自然發(fā)酵[9]。所以人工接種必定可以改善茯磚茶的品質(zhì)，然而人工接種所用的培養(yǎng)基制備及優(yōu)化是解決人工接種的關(guān)鍵性問題。歐陽梅和羅冰[9-10]等人用單因素試驗及單水平正交的方法制備的“金花菌”液體培養(yǎng)基都相對比較復(fù)雜，不便于制備。本文將優(yōu)化以麥麩為基礎(chǔ)的單菌發(fā)酵劑，以發(fā)酵劑中產(chǎn)孢量為研究對象，在單因素的實驗基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法對發(fā)酵劑的配方進一步優(yōu)化，以期獲得能在較短時間內(nèi)培養(yǎng)出高孢子濃度的培養(yǎng)基。而這種用料簡單，配置方便，經(jīng)濟節(jié)約的培養(yǎng)基一定能加速人工接種的推廣，同時還為進一步的培養(yǎng)基優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

冠突曲霉：由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物重點實驗室分離于茯磚茶上的“金花菌”，經(jīng)本實驗室鑒定為冠突曲霉( Aspergillus cristatus)。菌株號為GZAAS20.1004。

高滲MYA培養(yǎng)基[11]：麥芽提取物20 g，酵母提取物5 g，蔗糖30 g，NaCl 140 g，瓊脂粉12 g，加蒸餾水定容至1000 mL。液體培養(yǎng)基不加瓊脂粉，分裝，及時滅菌，滅菌條件115℃，15 min。

1.2 儀器

各種規(guī)格的移液槍(Eppendorf)、SS-325型高壓滅菌鍋(日本TomyKogyo公司)、超純水系統(tǒng)(Purelab公司)、常溫冰箱(海爾集團)、-20℃低溫冰箱(海爾集團)、BSS300-WEI電子天平(德國賽多利斯)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、制冰機、KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)、TS-2102C搖床等其它小型儀器均為國產(chǎn)儀器。

1.3 方法

1.3.1冠突曲霉的培養(yǎng)及孢子懸浮液制備 將冠突曲霉接種于高滲MYA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)7 d，在超凈工作臺上，用滅菌過的刀片刮取冠突曲霉，放入帶有適量玻璃珠的滅菌三角瓶內(nèi)，每刮取10個平板上的冠突曲霉倒入100 ml無菌水，于搖床上震蕩30 min轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r/min，再用滅菌過的脫脂棉過濾三角瓶里的菌液，最后對所得濾液利用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)；最后保存4℃冰箱備用。

1.3.2發(fā)酵液孢子濃度測定方法 無菌環(huán)境下向28℃培養(yǎng)了7 d的三角瓶內(nèi)加100 ml無菌水，震蕩搖勻后靜置40 min，再利用兩層紗布過濾，將濾液倒入滅菌過的放有玻璃珠的三角瓶后放入搖床150 r/min，震蕩1 h，將震蕩后的溶液利用血球計數(shù)板計數(shù)。取一塊潔凈干燥的血球計數(shù)板，蓋上干凈的蓋玻片，吸取菌懸液從血球計數(shù)板兩槽處滴加菌液，待菌懸液浸滿計數(shù)室，靜置5 min后鏡檢計數(shù)[8]。

金花菌孢子數(shù)(ml)=N/5×25×104×稀釋倍數(shù)

采用25×16規(guī)格的計數(shù)板，N代表5個中方格孢子總數(shù)

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1單因素試驗 準備500 ml三角瓶若干，利用60目篩子篩去麩皮淀粉末，在各三角瓶內(nèi)稱取10 g麩皮并按照表1添加含水量、NaCl與接種量。表1為單因素試驗設(shè)計，除考察因素外，其余條件均一致并在28℃條件下培養(yǎng)7 d時，將發(fā)酵物浸泡過濾處理后測定孢子含量，初步確定各單因素最佳水平。

1.4.2Box-Behnken設(shè)計 結(jié)合單因素結(jié)果的分析，使用Design Expert中的BBD設(shè)計以上3個因素三個水平(共17個試驗點，5個中心點)的響應(yīng)面試驗，以發(fā)酵劑孢子濃度為響應(yīng)值[12]。

1.5 統(tǒng)計分析

利用Design Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到二次多項式，對該方程進行顯著性、方差分析并分析響應(yīng)面試驗結(jié)果，確定發(fā)酵劑最大孢子含量下對應(yīng)的含水量，氯化鈉濃度及接種量[13]。最后用經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后的發(fā)酵條件進行三次驗證實驗來驗證模型預(yù)測的準確性。

表1 單因素試驗因素水平表Tab.1 Factors and the levels of experiment of single factor experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1含水量對產(chǎn)孢量的影響 由圖1可以看出，不同的含水量對產(chǎn)孢量影響比較大，隨著含水量的增加，產(chǎn)孢量呈遞增趨勢，當含水量為10 ml時，產(chǎn)孢量最大，達到1.8×107個/ml，高出5 ml含水量的孢子數(shù)2倍多，表明適宜的含水量對培養(yǎng)基起著極其重要的作用。對于含水量超過10 ml時，產(chǎn)孢量突然下降，其原因可能是由于含水量過高致使冠突曲霉的呼吸代謝受阻，抑制了其菌體的生長和產(chǎn)孢能力。

圖1 含水量對產(chǎn)孢量的影響Fig.1 Effect of moisture content on sporulation

2.1.2NaCl對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量的影響 由圖2可知，NaCl的添加量對產(chǎn)孢量影響也較大，當NaCl含量達5%的時，產(chǎn)孢量達到最大即2.01×107個/ml。當NaCl添加量高于5%時，產(chǎn)孢量急劇下降，表明NaCl添加量過大對冠突曲霉的產(chǎn)孢量有抑制作用。究其原因可能是NaCl所離解出的Na+和Cl-細胞內(nèi)外滲透壓與電位差有著重要影響，進而使其細胞營養(yǎng)物質(zhì)運輸受影響，產(chǎn)生單鹽毒害，致使微生物活性受影響，最后造成產(chǎn)孢量不斷減少。此結(jié)果和羅冰等人研究結(jié)果基本一致[10]。

圖2 NaCl濃度對產(chǎn)孢量的影響Fig.2 Effect of NaCl concentration on sporultion

2.1.3接種量對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量的影響 從圖3可以看出，隨著接種量的增加，產(chǎn)孢量先呈上升趨勢后下降，當接種量為240 μl的時候孢子產(chǎn)量最高達到1.98×107個/ml。其原因可能是由于接種量較低時，孢子基數(shù)較少，因此其產(chǎn)孢量低，當接種量增加時，孢子基數(shù)較多，使菌體生長提前進入對數(shù)期，致使菌體營養(yǎng)代謝加快，從而提高了產(chǎn)孢量；當接種量過大時，孢子基數(shù)較多，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足微生物的需要，抑制了菌體的生長，因此產(chǎn)孢量呈下降趨勢。

圖3 接種量對產(chǎn)孢量的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on sporulation

2.2 冠突曲霉單菌發(fā)酵劑響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.1響應(yīng)面因素水平的選取 根據(jù)Box-Behnken的驗設(shè)計原理，綜合2.1單因素影響試驗結(jié)果，分別選取含水量(ml)、NaCl(%)以及接種量(μl)三個因素的高中低三個水平，在單因素的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法[12]，試驗因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素及水平Tab.2 Factors and the levels of experiment of Response Surface Analysis

2.2.2響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果 以含水量A、氯化鈉濃度 B以及接種量C為自變量，以發(fā)酵劑孢子濃度為響應(yīng)值(Y)，進行響應(yīng)面分析試驗，試驗方案及結(jié)果見表3。

2.2.3多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立及分析 利用Design Expert軟件對表3實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到響應(yīng)曲面二次多元回歸方程：

Y=34.84-1.09A+1.03B+2.73C-0.21AB-0.29AC-0.62BC-13.40A2-18.02B2-8.34C2

各因素的方差分析見表4。

表3 Box-Behnken實驗設(shè)計方案及結(jié)果Tab.3 Box-Behnken design and results

分析表4可知，該模型p<0.0001，失擬項p=0.9721>0.05可知該模型回歸極顯著，失擬項不顯著，不需要引入更高次項系數(shù)。模型的復(fù)項關(guān)系數(shù)R2=0.9999，說明該模型的擬合較好，各個因素對響應(yīng)值的影響不是線性關(guān)系，能較好的模擬不同條件下產(chǎn)孢量的預(yù)測。校正復(fù)項關(guān)系數(shù)AdjR2=0.9999，信噪比Adeq Precision270.872>4，說明該模型在設(shè)計區(qū)間內(nèi)誤差小，預(yù)測較為準確。

從表4可以看出，影響產(chǎn)孢量的A、B、C三個因素影響水平均達到極顯著水平P<0.0001。各因素間的交互作用AB、AC、BC均達到顯著水平P<0.05，等高線均接近圓形[14]。其中BC交互作用達到極顯著水平P<0.0001見圖6，AB及AC的等高線圖及響應(yīng)面圖見圖4、圖5。

表4 回歸模型的方差分析Tab.4 Analysis of variance with regression model

注：Pr值是方差齊性檢查的結(jié)果；“**”表示極顯著水平，“*”表示顯著水平。

圖4 含水量與NaCl對產(chǎn)孢量影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.4 Response Surface of interrelated influence of NaCl content and sporulation

圖5 含水量與接種量對產(chǎn)孢量影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.5 Response Surface of interrelated influence of moisture content and sporulation

圖6 NaCl與接種量對產(chǎn)孢量影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.6 Response Surface of interrelated influence of inoculation amount and sporulation

2.2.4模型驗證 在獲得非線性回歸模型后，為求得最大產(chǎn)孢量，利用Design expert 8對所得回歸擬合方程各自變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，求得次方程得到最大產(chǎn)孢量最優(yōu)條件為A=-0.042、B=0.026、C=0.162換算成實際值為含水量9.79 ml、NaCl 6.13%、接種量246.48 μl，預(yù)測的最大產(chǎn)孢量為3.51×107個/ml。

為了驗證該模型的準確性和實用性，用經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后的發(fā)酵條件進行三次驗證實驗，產(chǎn)孢量分別為3.43×107個/ml、3.48×107個/ml、3.37×107個/ml，與預(yù)測結(jié)果3.51×107個/ml基本一致，表明該模型準確性和實用性高，能較好的預(yù)測產(chǎn)孢量。

3 結(jié)論與討論

在單菌發(fā)酵劑的制備中，影響發(fā)酵劑產(chǎn)孢量的因素很多，這些因素之間并不是孤立的，而是互相有聯(lián)系的[15]。利用Design expert 8 軟件，該軟件是一款面向?qū)嶒炘O(shè)計以及相關(guān)分析的軟件，可以根據(jù)具體要求設(shè)計出高效的實驗方案，并對實驗數(shù)據(jù)做專業(yè)的分析，給出全面的可視的模型以及優(yōu)化結(jié)果[16]。傳統(tǒng)的正交設(shè)計可以同時考慮幾種因素，尋找最佳因素水平組合，但是不能在給出的整個區(qū)域內(nèi)找到因素和響應(yīng)值之間的一個明確的函數(shù)表達式即回歸方程，故只能分析離散型數(shù)據(jù)，且存在試驗次數(shù)多，精度不夠高及預(yù)測性不佳等缺點[17-18]。響應(yīng)面法(RSM)最早是由數(shù)學(xué)家Box和Wilson于1951年提出來的。利用合理的試驗設(shè)計方法并通過試驗得到數(shù)據(jù)，采用二次回歸方程來擬合因子和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，指導(dǎo)多變量優(yōu)化問題[19]，其中基于Box-Behnken設(shè)計的響應(yīng)曲面法可以進行因素數(shù)在3～7個內(nèi)的試驗；試驗次數(shù)為15～62次，在因素數(shù)相同時比正交試驗所需的次數(shù)少，對于本試驗是一種比較理想的方法。該方法通過響應(yīng)面圖直觀的分析了三個因素對于產(chǎn)孢量的影響，同時還可以觀察各因素之間的交互作用的影響[20]。

傳統(tǒng)的發(fā)花工藝是指茶葉在一定的水熱條件下，其周圍的優(yōu)勢菌種如冠突曲霉大量繁殖，形成胞外酶，這些酶和茶葉中的多酚化合物等成分聚合、分解，與微生物本身一起形成了特殊的色、香、味、形[9]。這種自然發(fā)酵的過程固然很美妙，但因為周期長、烘房周轉(zhuǎn)困難、條件難以控制、容易污染、發(fā)花不均一等問題導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)難以保證，質(zhì)量難以提升，大幅限制了很多茶葉公司的發(fā)展。

但是這些難題都可以在人工接種發(fā)花中找尋到解決的辦法?？茖W(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)人工接種發(fā)酵能大幅度縮短發(fā)酵的時間，縮短了發(fā)花的周期，而且人工接種使用的單菌發(fā)酵劑可以保證優(yōu)勢菌的生長，控制并減少雜菌的污染以提高茶葉的飲用安全性。本試驗應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化最佳的培養(yǎng)基成分添加量：含水量9.79 ml、NaCl 6.13%、接種量246.48 μl，得到的最大產(chǎn)孢量約為3.51×107 個/ml。實驗結(jié)果說明通過響應(yīng)面分析這種方法來優(yōu)化冠突曲霉發(fā)酵劑的成分，能夠使發(fā)酵劑孢子含量得到大幅度提高。這種用麩皮為基礎(chǔ)制得的單菌發(fā)酵劑相較于羅冰和歐陽梅等由察氏培養(yǎng)基優(yōu)化得到的液體發(fā)酵劑，成本更低廉，操作更簡便，且本發(fā)酵劑產(chǎn)孢量高，易于連續(xù)培養(yǎng)，對于人工接種發(fā)酵的發(fā)酵劑制備及優(yōu)化研究提供一定的參考。

參 考 文 獻：

[1] 楊撫林， 鄧放明， 趙艷林， 等.黑茶微生物學(xué)研究進展[J].微生物學(xué)雜志， 2006， 26(1)：81-84.

[2] 馬夢君， 胡文卿， 傅麗亞， 等.溫度和質(zhì)量濃度對茶多酚水溶液穩(wěn)定性的影響[J].食品科學(xué)， 2014， 35(11)：11-16.

[3] 王 蝶， 黃建安， 葉小燕， 等.茯磚茶減肥作用研究[J].茶葉科學(xué)， 2012， 32(01)：81-86.

[4] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 98 33.3-2002 茯磚茶國家標準[S].北京：中國標準出版社，2002.

[5] 劉石泉， 胡治遠， 趙運林.用DGGE法初步解析茯磚茶渥堆發(fā)酵過程中真菌群落的結(jié)構(gòu)[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2014， 40(5)：494-500.

[6] 劉作易， 秦 瓊， 李乃亮.茯磚茶“金花”菌—謝瓦氏曲霉間型變種的孢子產(chǎn)生條件[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報， 1991， 4(1)：73-77.

[7] 劉作易， 秦 瓊.“金花”菌與茯磚茶品質(zhì)[J].貴州農(nóng)學(xué)院學(xué)報， 1991， 10(1)：79-82.

[8] 彭翠珍， 劉 川， 李晚誼.云南普洱茶人工接種發(fā)酵研究[J].云南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)， 2008(S1)：351-355.

[9] 歐陽梅.人工發(fā)酵黑散茶的工藝及降脂效果研究[D].杭州：浙江大學(xué)， 2012.

[10] 羅 冰.茯磚茶發(fā)酵劑生物學(xué)特性及其發(fā)酵劑制備研究[D].西安：陜西科技大學(xué)， 2014

[11] 劉作易， 秦 瓊， 李乃亮.茯磚茶“金花”菌—謝瓦氏曲霉間型變種的孢子產(chǎn)生條件[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報， 1991， 4(1)：73-77.

[12] 閆克玉， 高遠翔.響應(yīng)面分析法優(yōu)化槐米總黃酮的提取工藝[J].食品研究與開發(fā)， 2009， 30(07)：21-24.

[13] 劉 松， 李 祝， 周禮紅， 等.響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件[J].食品科學(xué)， 2013， 34(17)：225-229.

[14] 彭繼燕， 孫 蓉， 唐自鐘，等.響應(yīng)面優(yōu)化綠穗莧多糖的提取工藝[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2017， 36(02)：791-797.

[15] Guo Xia Sun， Yao Liang， Jun Wang，etal.Fermentation Process Optimization of Mulberry Black Tea by RSM[J].AdvancedMaterialsResearch， 2013， 2203(634)：1481.

[16] IvaRezi.Prediction of the surface tension of surfactant mixtures for detergent formulation using Design Expert software[J].MonatsheftefürChemie-ChemicalMonthly， 2011， 142(12)：1220-1222.

[17] Aghaie，M， Pazouki，M.R， Hosseini，M，etal.Response surface methodology (RSM) analysis of organic acid production for Kaolin beneficiation byAspergillusniger[J].ChemicalEngineeringJournal， 2008， 147(2)：245，249.

[18] W.C.Lee，S.Yusof，N.S.A.Hamid，B.S.Baharin.Optimizing conditions for enzymatic clarification of banana juice using response surface methodology (RSM)[J].JournalofFoodEngineering，2005，73(1)：55-60.

[19] Hongfei Yin， Gongjian Fan， Zhenxin Gu.Optimization of culture parameters of selenium-enriched yeast (Saccharomycescerevisiae) by response surface methodology[J].LWT-FoodScienceandTechnology， 2009， 43(4)：667-669.

[20] E.Kristo， C.G.Biliaderis， N.Tzanetakis.Modelling of the acidification process and rheological properties of milk fermented with a yogurt starter culture using response surface methodology[J].FoodChemistry， 2003， 83(3)：437，440.