羥丙基-β-環(huán)糊精包合艾納香揮發(fā)油的制備工藝研究

易 瓊，馮樹丹，李昀樺，王 魯*

(1.貴州大學 貴州省生化工程中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 藥學院，貴州 貴陽 550025)

艾納香揮發(fā)油是艾納香植物在精制艾片過程中所產(chǎn)生的一種揮發(fā)油物質(zhì)，許多研究表明艾納香揮發(fā)油具有顯著的藥理學活性，其抗菌、消炎，鎮(zhèn)痛，組織修復等作用顯著，發(fā)展前景廣大[1-3]。其常溫為液體，容易揮發(fā)，水溶解度小，致使其劑型選擇較為局限，生物利用度也不高，制約了其推廣應用[4]。因此，針對其現(xiàn)代生物藥劑學應用上的不足，尋求一種適用于艾納香油的新劑型輔料，具有重要的臨床意義。有報道利用聚乙二醇為輔料將其制成口含滴丸用于急慢性咽炎的防治[5]，但艾納香揮發(fā)油-羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)包合物的制備還未見報道。HP-β-CD是一種水溶性極好(75 g/100ml)， 熱穩(wěn)定性好， 且無刺激性、無溶血作用的醫(yī)用輔料。它可將艾納香揮發(fā)油包合使其固化，增加藥物穩(wěn)定性， 改善藥物溶解度，提高其生物利用度，便于加入不同的基質(zhì)或敷料中制成各種劑型，拓展其應用范圍。因此，本實驗室以自制黔產(chǎn)的艾納香油為研究對象，運用新型包合技術(shù)，以提高艾納香油的水溶性和穩(wěn)定性為目的，采用飽和水溶液法進行正交實驗，制備艾納香揮發(fā)油/ HP-β-CD 精包合物，為下一步艾納香揮發(fā)油新制劑的研發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

JB-3A型磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)；觸點式溫度計(上海醫(yī)用儀器廠)；MultiskanGo型全波段酶標儀(Thermo 公司)；冷凍干燥機(美國LABCONCO公司)；WHF-203B三用紫外分析儀(上海精科實業(yè)有限公司)。

1.2 試劑

2-羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)(粉末型，純度97%)(阿拉丁有限公司)；艾納香揮發(fā)油(貴州大學生化工程中心自制)；其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1艾納香揮發(fā)油的制備 稱取艾納香葉50 g，粉碎，過40目篩，放入1000 mL 圓底燒瓶中，加入10 倍的純水，浸泡1.5 h，然后根據(jù)文獻[6]和《中國藥典》2015 年版一部附錄XD 揮發(fā)油測定方法操作[7]，安裝揮發(fā)油提取器，采用蒸餾法工藝加熱提取5 h，再用無水硫酸鈉干燥即可。

1.3.2艾納香揮發(fā)油包合研究

1.3.2.1 正交試驗設計 通過前期查閱大量文[8-10]和反復預實驗，初步確定影響艾納香揮發(fā)油包合的主要因素有：艾納香揮發(fā)油與HP-β-CD 之間的投料比、包合時間、包合溫度等，采用L9( 34)正交試驗，以包合物油利用率、包合物含油率以及包合物產(chǎn)率為指標，對這3個因素進行考察，因素水平見表1。

表1 因素水平表Tab.1 orthogonal factor level table

1.3.2.2 艾納香揮發(fā)油-HP-β-CD包合工藝 采用飽和水溶液法[11]，取適量HP-β-CD于圓底燒瓶中， 根據(jù)其溶解度加入一定量的水，使其溶解制備為HP-β-CD飽和水溶液，加入轉(zhuǎn)子后將其置于恒溫攪拌器上的水浴鍋中保持包合溫度恒定，再用膠頭滴管吸取少量艾納香油-乙醇溶液[50%(v/v)]，緩慢加入到圓底燒瓶中，分次緩慢加入。為了防止艾納香油揮發(fā)，在圓底燒瓶上安裝一個冷凝回流裝置，開始計時并將溶液在恒溫條件下攪拌一定時間，冷卻至室溫后置于冰箱中靜置24 h，濾過，再用石油醚洗滌(洗滌3次，每次10 ml)， 室溫放置并自然揮干約30 min，使其殘留的有機溶劑揮發(fā)后，置于冷凍干燥機中干燥，即得艾納香揮發(fā)油-HP-β-CD包合物。

1.3.2.3 揮發(fā)油空白回收試驗 根據(jù)2015年版《中華人民共和國藥典》(四部)附錄ⅩD 項下?lián)]發(fā)油測定法[7]，選取甲法測定，精密量取艾納香油一定量，置于500 mL的圓底燒瓶中，加水300～500 ml與沸石數(shù)粒，振搖混合后，按圖所示裝置連接好，加熱微沸5 h，至測定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，讀取揮發(fā)油量，并計算供試品中揮發(fā)油的含量(%)。

圖1 揮發(fā)油檢測裝置Fig.1 Blumea balsamifera volatile Oil

1.3.2.4 包合物揮發(fā)油利用率、含油率及包合物產(chǎn)率的測定 取干燥包合物精密稱質(zhì)量，置圓底燒瓶中，加蒸餾水300 mL，連接揮發(fā)油測定器，微沸并保持4.5 h，至油量不再增加時停止加熱，放置0.5 h，至揮發(fā)油呈淡黃色時讀數(shù)，得到揮發(fā)油體積。按下列公式計算包合物油利用率、包合物含油率以及包合物產(chǎn)率。為了便于結(jié)果的分析比較，將包合物油利用率、包合物含油率以及包合物產(chǎn)率合并為綜合評分，正交試驗結(jié)果見表3。最后對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，評價各因素對綜合評分的影響，最終確定最佳工藝條件。

包合物油利用率(%)即包合率 =[包合物中艾納香油的量(mL)/(艾納香油投料量(mL)×空白回收率)]×100%

包合物含油率(%)=[(包合物含油量(mL)×艾納香油密度(g/ml))/包合物重量(g)]×100%

包合物產(chǎn)率(%)=[干燥后包合物重量(mL)/(HP-β-CD投料量(g)+艾納香油投料量(mL))]×100%

綜合評分=包合物產(chǎn)率×0.3+包合物油利用率×0.5+包合物含油率×0.2

1.3.2.5 驗證實驗 根據(jù)上述正交實驗結(jié)果，選取最佳包合工藝，取揮發(fā)油適量進行驗證，經(jīng)6 次平行實驗驗證重復性。

1.3.3包合物的質(zhì)量鑒定

1.3.3.1 薄層色譜法(TCL) 采用TLC法對艾納香揮發(fā)油包合前后的化學性質(zhì)進行驗證[12-13]。分別制備下列供試品溶液。供試品1：稱取HP-β-CD 0.1 g，加入蒸餾水1 mL，震蕩混勻即可；供試品2：取100 μL艾納香揮發(fā)油與HP-β-CD1 mg混合，再加入無水乙醇1 mL，震蕩混勻后再用0.22 μm的濾芯過濾；供試品3：取適量的艾納香揮發(fā)油-HP-β-CD包合物溶液；供試品4：取100 μL的艾納香揮發(fā)油，加入乙酸乙酯1 mL稀釋并混勻；供試品5：取適量的艾納香揮發(fā)油-HP-β-CD包合物，裝入500 mL放入沸石的圓底燒瓶中，加入300 mL蒸餾水，并連接揮發(fā)油提取器，冷凝回流至油量不再增加為止，將提取出的艾納香揮發(fā)油100 μL加入乙酸乙酯1 mL稀釋并搖勻；分別將上述供試品溶液用毛細管分別點于同一254 nm薄層熒光板上，以乙酸乙酯 -石油醚(1∶8)為展開劑，將板置于展開槽中展開，揮干溶劑，觀察結(jié)果。

1.3.3.2 紫外掃描法(UV) 參考文獻[13-14]分別取適量1.3.3.1中的供試品1、2、3、4溶液，置于紫外分光光度計中，在 190～400 nm范圍內(nèi)進行紫外掃描，測定吸光度結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾納香揮發(fā)油的提取

參照文獻方法可提取到艾納香油，收油率為3.14%，揮發(fā)油為淡黃色透明油狀物，具有特殊濃郁香味，如圖2所示。

圖2 艾納香油提取物Fig.2 Blumea balsamifera volatile Oil detector

2.2 艾納香揮發(fā)油包合研究

2.2.1艾納香油空白回收試驗 取3組空白試驗取其平均值，測得艾納香揮發(fā)油空白回收率為86.67%，取樣量及餾出量見表2。

表2 艾納香揮發(fā)油取樣量及餾出量Tab.2 The solution and distillate of Blumea balsamifera volatile oil

2.2.2最佳工藝條件的篩選 根據(jù)極差R的大小，可以判斷各因素對試驗指標的影響主次。該正交試驗極差R計算結(jié)果見表3，比較各R值大小，對于包合物產(chǎn)率、艾納香油的油利用率和綜合評分方面來說，RA>RB>RC，而對于包合物制備過程的含油率來說RB>RC>RA，所以因素對試驗指標影響的主次順序為A、B、C， 即艾納香油與環(huán)糊精的比例對包合物的綜合影響最大，溫度其次，攪拌時間影響最小。經(jīng)方差分析結(jié)果表明，羥丙基-β-環(huán)糊精與艾納香油的投料量比例(即因素A)對油利用率和綜合評分有顯著影響，而其他因素對包合工藝的實驗結(jié)果影響不顯著。綜合以上數(shù)據(jù)分析，直觀分析和方差分析結(jié)果，確定最佳工藝條件為A3B2C1，即艾納香油：HP-β-CD為1∶8，攪拌溫度為50℃，攪拌時間3 h。

表3 艾納香油-HP-β-CD包合工藝正交試驗安排Tab.3 Orthogonal experiment L9(34) of Blumea balsamifera volatile oil-HP-β-CD inclusion technology

表4 以綜合評分為指標的方差分析表Tab.4 The variance analysis table with the comprehensive score as index

F0.01(2，2)=99 F0.05(2，2)=19

2.2.3最佳工藝的驗證實驗 按照實驗2.2.4計算方法，包合物的平均產(chǎn)率為96.85%，平均油利用率為83.78%，平均含油率為8.32%，綜合平均得分為72.61，與正交實驗設計表中的各項指標最高值相對較近，表明本實驗所選取的工藝條件比較好，并且具有一定的可行性和重復性。

表5 最佳工藝重復驗證Tab.5 the best technology repeatable validation

圖3 左為原樣圖，右為主要成分標記圖Fig.3 The left is the original ,and the right is the main component

2.3 包合物的質(zhì)量鑒定

2.3.1薄層色譜法(TCL) 結(jié)果如圖3所示，供試品1和供試品3不顯斑點，而供試品2、供試品4和供試品5顯示相同的斑點，相對供試品2和供試品4，供試品5顯示斑點較弱，可能是餾出油的含量或成分發(fā)生了一些微小變化，綜合結(jié)果分析表明，艾納香油已嵌入 HP-β-CD的空穴結(jié)構(gòu)中形成了包合物，因此供試品3不顯示斑點，而供試品2、4、5斑點一致說明包合前后艾納香油的性質(zhì)并未發(fā)生明顯改變，主成分也未發(fā)生較大變化。達到包合目的。

2.3.2紫外掃描法(UV) 結(jié)果如圖4所示，HP-β-CD溶液沒有艾納香揮發(fā)油的特征吸收，表明HP-β-CD 對測定無干擾，艾納香揮發(fā)油-HP-β-CD 混合物、艾納香油、艾納香油-HP-β-CD包合物所形成的波譜圖基本一致，說明三種溶液具有相似的紫外吸收圖譜，并且HP-β-CD包合艾納香揮發(fā)油并未改變艾納香揮發(fā)揮發(fā)油的理化性質(zhì)。

圖4 波長掃描圖Fig.4 wavelength scanning chart

3 結(jié)論與討論

當前，環(huán)糊精包合技術(shù)發(fā)展已趨于成熟，歷年來也有許多HP-β-CD包合揮發(fā)油或其他藥物的實例，HP-β-CD作為一種安全無毒害的材料以及分子“內(nèi)疏水外親水”的特性，已廣泛應用于中藥揮發(fā)油產(chǎn)品的制備，并且加快了醫(yī)藥美容等行業(yè)的開發(fā)應用，具有相當可觀的發(fā)展前景[9]。

由正交試驗結(jié)果可知，影響艾納香揮發(fā)油包合效果的主要因素為艾納香揮發(fā)油與HP-β-CD的比例與包合溫度。為了考察這兩個關(guān)鍵因素對包合工藝的影響程度，在前期預實驗中，在保持其他條件不變的情況下， 對艾納香油與HP-β-CD的投料比和包合溫度分別做了進一步單因素影響實驗。實驗結(jié)果顯示， 當HP-β-CD的投料量超過艾納香油投料量的10倍，包合時溫度超過60℃時 ，包合率不僅不再增加， 甚至會出現(xiàn)下降的趨勢。投料比影響包合效果的原因可能為HP-β-CD過多時，其自身內(nèi)部的分子運動阻礙了其對艾納香揮發(fā)油的包合作用；而當HP-β-CD過少時，因艾納香揮發(fā)油過多，超過了HP-β-CD的空穴結(jié)構(gòu)承受范圍，導致一部分艾納香油不能被包合而裸露在外，造成損失引起包合率的降低。包合溫度影響包合效果的原因可能為當溫度過高時，使得分子的熱運動加快，擴散阻力減小，導致分子向外擴散的速度加快， 包合過程中艾納香油的揮發(fā)損失增多導致包合率下降，而包合時間相對來說影響不大。

本研究對艾納香揮發(fā)油包合物采用了TLC、UV等手段進行表征分析，結(jié)果證明艾納香揮發(fā)油與HP-β-CD并非簡單的物理混合，可能是艾納香揮發(fā)油包合進入了HP-β-CD分子空穴內(nèi)，形成了一個新物象，即形成包合物，說明本工藝適合艾納香揮發(fā)油包合物的制備，且此工藝操作簡單，條件易于控制。并且，HP-β-CD包合揮發(fā)油可應用溶液攪拌法、冷凍或噴霧干燥等工藝，易于產(chǎn)業(yè)化應用。其包合揮發(fā)油類物質(zhì)，不但增強了藥物的穩(wěn)定性和溶解度，且能提高揮發(fā)油類物質(zhì)的生物利用度，降低藥物毒性[8]，本研究中，將艾納香揮發(fā)油包合后，由液體藥物固體粉末化，便于制成多種劑型， 如可制成中藥片劑、膠囊劑、顆粒劑、袋泡劑和噴霧劑、滴眼劑、軟膏劑等多種劑型，這為艾納香揮發(fā)油新制劑的進一步開發(fā)提供了實驗基礎(chǔ)。

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