注射用歐前胡素脂微球處方前研究*

★ 祝婧云 湯濤 廖正根 趙國巍 梁新麗*

(1.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院藥學(xué)部 南昌 330003；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004)

歐前胡素是一種線性呋喃香豆素類天然活性成分，主要來源于中藥白芷、歐前胡、蛇床、獨(dú)活、北沙參、當(dāng)歸等植物。歐前胡素不僅在治療心血管疾病、抗菌、抗病毒等方面具有顯著意義[1]，并且有研究表明歐前胡素能夠通過靶向于Mcl-1蛋白來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡來從而發(fā)揮抗腫瘤的作用以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥[2-7]。提示歐前胡素是一種潛在的抗腫瘤藥物，具有良好的應(yīng)用前景。

近年來，處方前的研究在新藥的劑型設(shè)計(jì)和老藥的劑型改進(jìn)方面已經(jīng)逐漸成為一種常規(guī)化的研究項(xiàng)目[8]。藥物的親脂性或疏水性與藥物在細(xì)胞膜上的滲透性相關(guān)，而油水分配系數(shù)和平衡溶解度又是反映藥物脂溶性的2個(gè)重要理化性質(zhì)參數(shù)，這2 個(gè)重要理化性質(zhì)參數(shù)對研究藥物在體內(nèi)過程以及指導(dǎo)臨床用藥具有十分重要的意義[9]。目前，國內(nèi)外尚無測定歐前胡素的平衡溶解度、表觀油水分配系數(shù)及其影響因素試驗(yàn)的文獻(xiàn)報(bào)道，本文通過測定歐前胡素的平衡溶解度、表觀油水分配系數(shù)及其在高溫(60℃)、光照(4500±500 Lx)條件下穩(wěn)定性來進(jìn)行處方前研究，以期為歐前胡素注射用脂微球的劑型設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

歐前胡素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110826-200712);歐前胡素(西安昊軒生物科技有限公司);甲醇(上海振興化工一廠，色譜純);正辛醇(上海化學(xué)試劑公司，分析純);注射用大豆油(LCT鐵嶺北亞藥用油有限公司，批號y11030103-2-01);注射用中鏈脂肪酸甘油脂(MCT Lipoid，批號940031);其他試劑都為分析純。

Agilent1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司);UV2100PC 型紫外分光光度計(jì)(尤尼科上海儀器有限責(zé)任公司);TG328A十萬分之一電子天平(德國Startorius公司);QYC-200型全溫空氣搖床(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);高速冷凍離心機(jī)(德國SIGMA公司);Millipore Synergy超純水系統(tǒng)(美國密理博公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 正辛醇水飽和液的制備 精密吸取100 mL的正辛醇溶液置于250 mL的具塞錐形瓶中，加超純水100 mL，放入空氣恒溫?fù)u床上，控制溫度為(25±1)℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，振搖24 h，靜置，備用。

2.1.2 不同pH緩沖液的制備 按照2015版《中國藥典》第三部試劑試液標(biāo)準(zhǔn)品8004緩沖液的配制方法，分別精密配置pH為2.0，4.0，6.0，7.4，8.0，9.0的緩沖液[10]。

2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取歐前胡素對照品約5.0 mg，加甲醇定容至10 mL的棕色容量瓶中。精密量取200 μL置10 mL棕色容量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成10μg/mL的對照品溶液。

2.2 歐前胡素的含量測定

2.2.1 檢測波長的選擇 取歐前胡素對照品溶液，以甲醇為空白對照，采用紫外分光光度法在190～400nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示歐前胡素在300 nm處有最大吸收波長，因此選擇300nm作為歐前胡素的檢測波長。

2.2.2 色譜條件 Agilent1260，Phenomenex-C18柱(5μm，250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相甲醇-水(80∶20)，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，紫外檢測波長300nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 按照2.2.2項(xiàng)下液質(zhì)條件檢測，見圖1。結(jié)果顯示陰性無干擾。

A.歐前胡素對照品;B.空白脂微球;C.歐前胡素脂微球

2.2.4 方法學(xué)的建立 精密稱取歐前胡素對照品5mg，置10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，制得0.5mg/mL的儲備液。精密量取儲備液適量用甲醇稀釋，配成1、5、10、15、20、25 μg/mL系列對照品溶液。按2.2.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，分別記錄歐前胡素的峰面積。以進(jìn)樣濃度(X) 為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)作圖并進(jìn)行線性回歸，得線性方程為Y=199.73X-177.41，r=0.9995(n=6)，結(jié)果表明歐前胡素在進(jìn)樣質(zhì)量濃度1～25μg/mL時(shí)呈良好線性關(guān)系。采用逐級稀釋法，測定歐前胡素的定量限限為66ng/mL(S/N=11.4)。高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的回收率在99.20%～101.75%之間，平均回收率為100.12%，RSD均值為0.77%。精密度RSD為0.12%。

2.2.5 穩(wěn)定性考察 將對照品儲備液分別在0、2、4、6、8、10、12、24h，取樣按照2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，計(jì)錄峰面積(A)，經(jīng)計(jì)算其RSD為0.87%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 歐前胡素平衡溶解度的測定

2.3.1 不同pH值緩沖液中的表觀溶解度 精密稱取過量的歐前胡素分別加至pH為2.0，4.0，6.0，7.4，8.0，9.0的5mL的緩沖液中，置于空氣恒溫?fù)u床上，控制溫度為(25±1)℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，振搖72 h，0.22 μm微孔濾膜過濾后，按上述色譜條件進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，計(jì)算歐前胡素在不同pH緩沖液中的含量，并計(jì)算其在不同pH緩沖液中的平衡溶解度，結(jié)果分別為0.36，2.45，1.14，2.45，2.66，2.52μg/mL，表明歐前胡素在不同pH緩沖液的溶解度都相對較低，提示歐前胡素水溶性差。

2.3.2 LCT∶MCT不同比例下在油相中的溶解度 精密稱取0.5g的歐前胡素，按表2中MCT和LCT的不同比例，精密稱取油相6 g，置于空氣恒溫?fù)u床(25 ℃，100 r/min)，振搖72 h，用0.22 μm微孔濾膜過濾。精密稱取0.4 g，置于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。按“2.2.2”項(xiàng)下液相色譜條件，進(jìn)行含量測定。結(jié)果表1。歐前胡素在注射用油中的溶解度隨著MCT比例的增加，溶解度也一直增大。歐前胡素在MCT中的溶解度最大，為26.3 mg/g。

表1 歐前胡素在LCT∶MCT不同比例油相中的溶解度 mg/g

2.4 表觀油水分配系數(shù)的測定 精密稱取歐前胡素對照品25 mg，置于50 mL水飽和的正辛醇溶液中，超聲溶解，以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，備用。精密吸取含歐前胡素的水飽和正辛醇2 mL，置于10 mL離心管中，分別加入2 mL正辛醇飽和的水及不同pH的緩沖液，將離心管封口后放入空氣恒溫?fù)u床上，控制溫度為(25±1)℃，轉(zhuǎn)速為100r/min，振搖72 h直至平衡。4000 r/min離心15 min后，取上層正辛醇溶液0.5mL定容至10mL容量瓶中。按照上述2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測定，記錄峰面積，按照外標(biāo)法計(jì)算出油相中歐前胡素的濃度Co，然后計(jì)算油水分配系數(shù)Papp值。計(jì)算公式如下：

Papp=CoVo/ C1V- CoVo

上式中Papp為歐前胡素的表觀油水分配系數(shù)，C1為正辛醇中歐前胡素的初始藥物濃度(μg/mL)，V為水飽和正辛醇的體積(即2.0 mL)，Co為分配平衡時(shí)歐前胡素在油相中測得的濃度(μg/mL)，Vo為油相體積(即2.0 mL)，C1-Co為分配平衡時(shí)歐前胡素在水相中的濃度(μg/mL)。

按照上述公式計(jì)算在不同pH緩沖液溶液中歐前胡素的表觀油水分配系數(shù)。結(jié)果顯示，歐前胡素在水中的表觀油水分配系數(shù)為16.76(logP=1.22)，在正辛醇-緩沖液中的表觀油水分配系數(shù)見表2。表2表明歐前胡素在正辛醇-緩沖液中的表觀油水分配系數(shù)中受pH的影響不大。

表2 歐前胡素在不同pH值下的油水分配系數(shù)

2.5 歐前胡素的影響因素試驗(yàn)考察 按照2015版《中國藥典》第四部通則中9001原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則，進(jìn)行歐前胡素原料藥的影響因素試驗(yàn)[11]。以歐前胡素的含量測定為評價(jià)指標(biāo)，考察光照、溫度對歐前胡素的變化影響。

2.5.1 光照對歐前胡素溶液的影響 精密稱取歐前胡素5.0 mg，置于10mL的容量瓶中，配制成0.5 mg/mL的儲備液，光照設(shè)為4500±500 Lx，分別于0、1、5、10天取0.2 mL并用甲醇稀釋成10 μg/mL溶液。按照上述2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測定濃度。結(jié)果見表3。歐前胡素在強(qiáng)光光照條件下，連續(xù)10天的降解率未超過10%，說明歐前胡素溶液在光照條件下相對比較穩(wěn)定。

表3 強(qiáng)光對歐前胡素含量的影響

2.5.2 高溫對歐前胡素溶液的影響 精密稱取歐前胡素5.0mg，置于10 mL的容量瓶中，配制成0.5 mg/mL的儲備液，于60℃下放置10天。分別于0、1、5、10天取0.2 mL并用甲醇稀釋成10 μg/mL溶液。按照上述2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測定濃度。結(jié)果見表4。歐前胡素在60℃高溫下，第一天含量降解率為3.8%，連續(xù)10天的降解率為19.9%，說明歐前胡素在高溫條件下不是很穩(wěn)定，提示歐前胡素及其制劑必須低溫或者常溫保存。

表4 高溫對歐前胡素含量的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)用HPLC首次測定了歐前胡素的表觀溶解度及其油水分配系數(shù)，以期為歐前胡素注射用脂微球的劑型設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。通過歐前胡素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式可知其是線性呋喃香豆素類化合物，具有烯丙醚和酯鍵，故選擇在不同消化道的生理pH值區(qū)間范圍內(nèi)的緩沖液作為溶劑來測定其表觀溶解度。通過測定25℃時(shí)歐前胡素在不同pH緩沖液下的表觀溶解度，得知?dú)W前胡素水溶性差；在不同的LCT/MCT油相比例下，發(fā)現(xiàn)歐前胡素的溶解度隨著MCT的增加逐漸增加，在MCT中溶解度為26.3 mg/g，說明歐前胡素在注射用油中有相對較高的溶解度，提示能將歐前胡素做成注射用脂質(zhì)微球的可能。

目前，油水分配系數(shù)的測定方法主要包括搖瓶法、產(chǎn)生柱法和高效液相色譜法[12-14]。但是，由于產(chǎn)生柱法的測定過程繁瑣且平衡時(shí)間太長，反向高效液相色譜法也需要使用已知Papp值的同系物作為對照品來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線且費(fèi)用昂貴，而經(jīng)典的搖瓶法不僅操作簡單而且成本低，因此本實(shí)驗(yàn)中我們采用了搖瓶法來檢測歐前胡素的油水分配系數(shù)。正辛醇溶液的溶解度參數(shù)與生物膜的溶解度參數(shù)一致，均為21.07 MPa1/2，故選用正辛醇來模擬生物膜，對藥物的透過性有一定的參考依據(jù)[15]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，藥物吸收的最佳范圍是-1

本實(shí)驗(yàn)中參照2015版《中國藥典》在光照(4500±500 Lx)和高溫(60 ℃)條件下對歐前胡素的穩(wěn)定性進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)歐前胡素在光照下相對穩(wěn)定，但應(yīng)該在低溫或者常溫下保存。

藥物的理化參數(shù)(如溶解度、油水分配系數(shù)以及在不同的環(huán)境中藥物的穩(wěn)定性等)直接影響著藥物的生物利用度。本實(shí)驗(yàn)通過對歐前胡素進(jìn)行一個(gè)較為系統(tǒng)的處方前研究，以期為制備成注射用脂微球的處方設(shè)計(jì)以及工藝優(yōu)化等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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