不同產(chǎn)地連錢(qián)草中4個(gè)成分含量測(cè)定及聚類(lèi)分析*

★ 黃文平 徐旭 李偉 李艷 譚婷* 馮育林 楊世林

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心 南昌 330006)

連錢(qián)草為(Glechomalongituba)為唇形科植物活血丹的干燥地上部分，其味辛微苦、性微寒，具有利濕通淋、清熱解毒、散瘀消腫之功效，臨床上用于治療熱淋，石淋，溫?zé)狳S疸，跌打扭傷等疾病。2015版《中國(guó)藥典》對(duì)其進(jìn)行收載，但無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)[1]。研究表明，酚酸類(lèi)化合物為連錢(qián)草中主要活性成分，綠原酸具有抗菌、抗纖維、抗炎的作用[2-6]，迷迭香酸為天然抗氧化劑，同時(shí)抗炎、免疫抑制作用顯著[7-9]；咖啡酸具有抗菌抗病毒、中樞興奮等作用[9-12]。由于受地理因素和生長(zhǎng)環(huán)境的影響，不同產(chǎn)區(qū)的連錢(qián)草化學(xué)組成不盡相同。為了進(jìn)一步固定藥材來(lái)源，本實(shí)驗(yàn)共收集不同產(chǎn)區(qū)10批樣品，采用HPLC同時(shí)測(cè)定樣品中綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸及迷迭香酸共4個(gè)有效成分含量，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析，考察不同產(chǎn)區(qū)連錢(qián)草藥材的質(zhì)量，為連錢(qián)草質(zhì)量的完善提供依據(jù)。

1 儀器與材料

安捷倫LC-1260型高效液相色譜儀系列；AUW220D型電子天平(十萬(wàn)分之一，日本島津公司)；BS224S型電子天平(萬(wàn)分之一，Sartorius)；KQ250DB型數(shù)控超聲波清洗器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；KQ5200型水浴鍋(昆山市超聲儀器有限公司)。

綠原酸對(duì)照品(批號(hào):110753-201415)，隱綠原酸對(duì)照品(批號(hào):110753-201314)，咖啡酸對(duì)照品(批號(hào):110885-200102)，迷迭香酸對(duì)照品(批號(hào):111871-201404)，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究所。甲醇為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

本實(shí)驗(yàn)收集到不同批次的連錢(qián)草樣品共10批(見(jiàn)表1)，樣品經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)教授鐘國(guó)躍鑒定為連錢(qián)草GlechomaLongituba真品。

表1 10批連錢(qián)草藥材

2 方法與結(jié)果

2.1 連錢(qián)草藥材供試品溶液 取連錢(qián)草藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)1.0g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加60 %甲醇25 mL，稱(chēng)重，超聲提取30min，稱(chēng)重，用60 %甲醇補(bǔ)足減失重量，濾過(guò)，濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸及迷迭香酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含綠原酸0.012mg、隱綠原酸0.028mg、咖啡酸0.01 mg及迷迭香酸0.25 mg的混合溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱:COSMOSIL(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相:甲醇(A)-0.3 %磷酸水(B)，梯度洗脫(0～30 min, 10 %～25 % A；30～38 min， 25 %～40 % A；38～55 min， 40 % A)；流速:0.8 mL/min；柱溫:25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng):330 nm；進(jìn)樣量:10 μL；各待測(cè)組分分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于6000?；旌蠈?duì)照品溶液、供品溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液(A)和供試品溶液(B)高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液1、3、6、10、15、20 μL 分別進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積(Y) 為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X) 為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸和迷迭香酸的線性回歸方程分別為:Y=6647.7722X-0.4216 (r=0.9999)、Y=2849.0452X-0.4216 (r=0.9999)、Y=6968.9569X-0.321 (r=0. 9998)、Y=1767.0006X+3.9569(r=0.9998)；綠原酸在0.012～0.24 μg、隱綠原酸在0.028～0.56 μg、咖啡酸在0.01～0.2 μg、迷迭香酸在0.25～5 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得混合對(duì)照品中綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸和迷迭香酸峰面積的RSD(n=6)分別為0.74 %、0. 88 %、0. 82 %、1.02 %。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品(S8)溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)行測(cè)定，得綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸和迷迭香酸峰面積的RSD(n=6)分別為1.25 %、2. 46 %、2.71 %、0.63 %。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取連錢(qián)草樣品(S8)，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，以“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸和迷迭香酸平均含量分別為0.4124、0.2115、0.0249、0.8913 mg/g，RSD分別為2.43 %、2.52 %、0.76 %、0.93 %。

2.8 加樣回收率 精密稱(chēng)取已知含量樣品1.0g，共6 份，分為3 組，按100 %的量各加入綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸和迷迭香酸對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸和迷迭香酸平均回收率分別為100.64 %(RSD=0.93 %)、99.09 %(RSD=1.39 %)、99.30%(RSD=1.39 %)、101.23 %(RSD=0.86 %)，表明方法的準(zhǔn)確度符合要求(n=6)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測(cè)定 取10批樣品各3份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 mg/g

注：“-”表示未檢出。

2.10 聚類(lèi)分析 采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件對(duì)4個(gè)酚酸成分含量進(jìn)行聚類(lèi)分析，采用組間聯(lián)接聚類(lèi)方法，距離的計(jì)算方法為Pearson相關(guān)性，進(jìn)行層次聚類(lèi)分析，見(jiàn)圖2。通過(guò)分析可將上述10批次藥材分為兩類(lèi)，長(zhǎng)江以北(山東和河南)可以歸為一類(lèi)，長(zhǎng)江以南(江西、云南、湖北、安徽、貴州、江蘇及浙江)可以歸為一類(lèi)。從表3和圖2中可以看出，不同成分，地域不同導(dǎo)致含量差異性比較明顯。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中水相含酸能明顯改善酚酸類(lèi)成分色譜峰的對(duì)稱(chēng)性，流動(dòng)相采用有機(jī)溶劑乙腈與甲醇相比較，甲醇較乙腈分析效果更優(yōu)。指標(biāo)成分吸收波長(zhǎng)經(jīng)綜合考慮，

選定330 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

結(jié)果表明，10批連錢(qián)草樣品，4個(gè)酚酸類(lèi)含量存在一定的差異性，長(zhǎng)江以北的批次(S8-S10)中綠原酸含量均值較長(zhǎng)江以南的批次(S1-S7)的高，而(S8-S10)批次所含的迷迭香酸含量均值較(S1-S7)批次均值的低，推測(cè)可能由于地域的不同而導(dǎo)致含量的差異。因此在針對(duì)某一成分起功效時(shí)，可以選定特定產(chǎn)地的藥材進(jìn)行入藥。本文收集樣本較少，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量并對(duì)各成分含量之間的相關(guān)性開(kāi)展更深入研究。

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