空腸彎曲菌脂多糖對大鼠脊髓髓鞘損傷的實(shí)驗(yàn)研究

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空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni，Cj)是常見的人獸共患細(xì)菌性腸道病原菌，臨床約90%的急性細(xì)菌性腸炎均與該菌相關(guān)。同時(shí)，Cj感染是導(dǎo)致格蘭-巴利綜合征(Guillain-Barré syndrome，GBS)的主要病因之一。大量的臨床和動物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，Cj感染后血清中出現(xiàn)被激發(fā)抗GM1和抗GDla等抗神經(jīng)節(jié)苷脂自身抗體，從而導(dǎo)致周圍神經(jīng)損傷，認(rèn)為自身免疫性炎癥是GBS病變機(jī)制之一[1]。目前尚不清楚空腸彎曲菌脂多糖(Cj-LPS)是否會引起髓鞘損傷。本研究中，我們分別用Cj-LPS和特異性LPS抗體免疫大鼠，觀察大鼠脊髓形態(tài)學(xué)變化，神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)及其受體TrkC和神經(jīng)生長抑制因子NogoA及其受體NgR mRNA的表達(dá)，探討Cj-LPS對大鼠脊髓髓鞘損傷的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 60只SPF級雄性Wistar大鼠，體重200～300 g，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SYXK(浙)2012-0178。將大鼠隨機(jī)分為對照組(NC組)，脂多糖組(Cj-LPS組)，及LPS抗體組(Anti-LPS組)。每組各20只大鼠。

1.2Cj-LPS，抗LPS試劑的制備及動物免疫 Pennor O∶19型空腸彎曲菌菌種購于美國菌種保藏中心(ATCC)，厭氧培養(yǎng)。使用Westphal熱酚水法提取LPS，其純度通過考馬斯亮藍(lán)染色鑒定達(dá)到99%。通過親和層析法制備LPS抗體。稱取2 g環(huán)氧樹脂活化的瓊脂糖凝膠6B和8 mg LPS填充制備層析柱，將硫酸銨處理的Cj特異性免疫血清上柱層析，收集洗脫液并立即透析，濃縮儲存待用。

Cj-LPS組以LPS、完全弗氏佐劑、生理鹽水溶液混勻充分乳化后，腹股溝、背部皮下多點(diǎn)注射。對照組以等容的完全弗氏佐劑、生理鹽水和生理鹽水皮下注射。分別在初次免疫后1周、2周時(shí)，同樣方法加強(qiáng)免疫。LPS抗體組分別于實(shí)驗(yàn)2、3周，取大鼠特異性抗CjLPS IgG加等量不完全弗氏佐劑，乳化后，于小腦延髓池注射。

1.3樣品采集 隨機(jī)抽取每組大鼠中的10只，在第4周即免疫誘導(dǎo)后的急性期進(jìn)行處死，另外10只則在第6周通過腹腔注射水合氯醛進(jìn)行麻醉，打開胸腔暴露心臟，由左心室插入導(dǎo)管致主動脈，快速注入200 mL生理鹽水，然后緩慢注入200 mL多聚甲醛(40 g/L)。之后取脊髓組織，固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片。進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察其組織形態(tài)變化。

1.4實(shí)時(shí)定量PCR 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行RNA提取及cDNA合成(表1)。如文獻(xiàn)[2]所述進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)來檢測分析NT-3/TrkC和NogoA/NgR mRNA的表達(dá)。

使用RNA提取試劑盒從大鼠脊髓中提取總RNA，并通過市售試劑盒逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，操作方法遵循試劑盒說明書(北京天根生化科技限公司)。使用ABI 7300 PCR儀(美國Applied Biosystems)及SYBR Green PCR Master Mix(北京天根生化科技限公司)進(jìn)行qRT-PCR測定。20 μL實(shí)時(shí)反應(yīng)混合液中含有：實(shí)時(shí)PCR SYBR混合液(2×)10 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，模板0.5 μL，以及DEPC水。反應(yīng)條件如下：NT-3/TrkC：95 ℃初始變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，每兩個(gè)循環(huán)降溫1 ℃，共40個(gè)循環(huán)，然后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。NogoA/NgR：95 ℃初始變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共40循環(huán)；然后4 ℃保存。使用△△Ct分析法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用delta循環(huán)時(shí)間法進(jìn)行定量分析。使用比較(2-△△Ct)法對每個(gè)樣品中的目標(biāo)基因相對于β-actin基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理[3]。

表1 qRT-PCR引物序列

Tab.1 Primer sequences used for qRT-PCR

基因引物序列產(chǎn)物大小/bpβ-actin上游5′CATCCGTAAAGACCTCTATGC-CAAC3′171下游5′ATGGAGCCACCGATCCACA3′NT-3上游5′CATGTCGACGTCCCTGGAA-AT-AG3′124下游5′GGATGCCACGGAGATAAG-CAA3′TrkC上游5′ATCACTGTGACCCACAAAC-CAGAG3′124下游5′ACCGGCGACCATACTTGTTGA3′NogoA上游5′CTTGGTCATGTGAACAGCA-CAATAA3′124下游5′CATTGAACAAGGCACCAAC-GTAA3′NgR上游5′TCCAGTCATGCCGAAATCT-CAC3′144下游5′TGGTAGGGTCCACGACATG-AAG3′

2 結(jié) 果

2.1大鼠脊髓HE染色結(jié)果 NC組大鼠脊髓無可見異常變化(圖1A和D)。而Cj-LPS組則在第4周和第6周時(shí)發(fā)現(xiàn)病理變化，主要表現(xiàn)為小靜脈及毛細(xì)血管周圍不同程度的炎性細(xì)胞浸潤，呈套袖狀變化；并出現(xiàn)脫髓鞘改變，神經(jīng)細(xì)胞核固縮、變性及壞死(圖1B和E)。與Cj-LPS相比，LPS抗體組的病理變化有不同程度緩解，例如浸潤細(xì)胞數(shù)量較少，套袖狀變化程度較低，神經(jīng)元損傷有所恢復(fù)(圖1C和F)。

圖1 大鼠脊髓組織病理學(xué)圖(HE染色，×200)Fig.1 Histopathologic of the spinal cord in rats (HE staining, ×200)

2.2NT-3/TrkC mRNA的表達(dá) 與NC組相比，第4周時(shí)Cj-LPS組和Anti-LPS組NT-3 mRNA的表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.01)。與Cj-LPS組比較，第4周時(shí)Anti-LPS組NT-3 mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但第6周時(shí)Anti-LPS組NT-3 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)(圖2A)。

第4周及第6周時(shí)，Cj-LPS組大鼠脊髓TrkC mRNA的表達(dá)均低于NC組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而第6周時(shí)Anti-LPS組TrkC mRNA的表達(dá)顯著增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2B)。

A：大鼠脊髓中NT3 mRNA的表達(dá)；B：大鼠脊髓中TrkC mRNA的表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為與NC組比較。#P<0.05，##P<0.01，與Cj-LPS組比較。圖2 第4周和6周時(shí)大鼠脊髓中NT-3 mRNA和TrkC mRNA的表達(dá)Fig.2 Expressions of NT-3 mRNA and TrkC mRNA in rat spina cord after 4 weeks and 6 weeks

2.3NogoA/NgR mRNA的表達(dá) 與NC組相比，Cj-LPS組大鼠脊髓NogoA mRNA的表達(dá)在第4周和第6周均有所增加。第6周時(shí)Anti-LPS組NogoA mRNA的表達(dá)則明顯低于Cj-LPS組(圖3A)。

與NC組相比，Cj-LPS組NgR mRNA的表達(dá)在第4周和第6周均有有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。第6周時(shí)Anti-LPS組與NC組間NgR mRNA的表達(dá)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。但第4周和第6周時(shí)，Cj-LPS組與Anti-LPS組間NgR mRNA的表達(dá)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3B)。

A：大鼠脊髓中NogoA mRNA的表達(dá)；B：大鼠脊髓中NgR mRNA的表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為與NC組比較。#P<0.05，##P<0.01，與Cj-LPS組比較。圖3 第4周和6周后大鼠脊髓中NogoA mRNA和NgR mRNA的表達(dá)(RT-PCR)Fig.3 Expressions of NogoA mRNA and NgR mRNA in rat spinal cord after 4 weeks and 6 weeks

3 討 論

空腸彎曲菌的細(xì)胞壁主要由LPS組成，即多糖O抗原、核心多糖及類脂A，具有內(nèi)毒素特性。多糖O抗原是空腸彎曲菌的主要表面抗原，國際上空腸彎曲菌penner血清學(xué)分型方法就是來源于此。研究發(fā)現(xiàn)，penner O∶19型空腸彎曲菌的LPS成分與人類周圍神經(jīng)的神經(jīng)節(jié)苷脂間存在分子模擬現(xiàn)象，由各種類型的神經(jīng)節(jié)苷脂抗體特異性地出現(xiàn)在相應(yīng)的GBS亞型中[4]。

P2堿性蛋白為中樞和周圍神經(jīng)髓鞘的共有成分，用P2堿性蛋白免疫動物可同時(shí)誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性神經(jīng)炎(EAN)和實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)，有研究發(fā)現(xiàn)可能是針對P2堿性蛋白產(chǎn)生的自身免疫性T細(xì)胞和自身抗體會在周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)均引起免疫應(yīng)答，導(dǎo)致周圍和中樞的共同脫髓鞘，并在局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，破壞血腦屏障，引起腦水腫及腦脊髓損害[5]。本研究首先表明Cj-LPS可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓的病理組織學(xué)變化，并發(fā)現(xiàn)抗LPS抗體可改善這一病理組織學(xué)變化。至今已有眾多基礎(chǔ)研究結(jié)果表明Cj-LPS是一種最常見的感染試劑，Cj-LPS也被歸類為致神經(jīng)病變試劑[6]。本研究中，我們檢測了神經(jīng)營養(yǎng)因子NT-3及其受體TrkC mRNA的表達(dá)及神經(jīng)過度生長抑制因子NogoA/NgR mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Cj-LPS可降低NT-3/TrkC mRNA的表達(dá)并增加NogoA/NgR mRNA的表達(dá)。

神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFs)和神經(jīng)生長抑制劑都可影響神經(jīng)再生。NTFs屬于分泌性多肽生長因子家族，其具有神經(jīng)系統(tǒng)的各種生理功能。它們可參與神經(jīng)的可塑性調(diào)節(jié)及神經(jīng)傳遞，促進(jìn)受傷髓鞘的修復(fù)和再生，以此減輕脊髓損傷后的繼發(fā)性損傷程度。NT-3在神經(jīng)元髓鞘發(fā)育中起著非常重要的作用。NT-3可促進(jìn)神經(jīng)損傷之后髓鞘磷脂的分化和延伸，并在髓鞘生長中發(fā)揮引導(dǎo)性作用[7]。NT-3可與位于靶細(xì)胞表面并具有酪氨酸激酶活性高親和力受體TrkC相結(jié)合，建立具有生物作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[8]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cj-LPS可降低NT-3/TrkC mRNA的表達(dá)，這一作用從第4周到第6周表現(xiàn)尤為顯著，可見Cj-LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)生了不可逆髓鞘損傷。

NogoA是與髓鞘相關(guān)的神經(jīng)突增生抑制劑，其家族包含3種亞型[9]。有研究表明，31%的感染性疾病歸均由Cj-LPS所致，而它也可能是GBS的病因之一[10]。近一個(gè)世紀(jì)來學(xué)者們公認(rèn)GBS與急性多發(fā)性神經(jīng)炎相關(guān)。急性多發(fā)性神經(jīng)炎是一種涉及外周神經(jīng)和神經(jīng)根的脫髓鞘病，具有小血管的炎性細(xì)胞浸潤這種自身免疫性外周神經(jīng)病變的病理特征之一。它被稱為急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病。通過文獻(xiàn)檢索我們發(fā)現(xiàn)NogoA與中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性脫髓鞘性疾病密切相關(guān)[11]。由NgR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)取決于其與低親和力神經(jīng)生長因子受體p75NTR的關(guān)聯(lián)，該受體p75NTR也是神經(jīng)營養(yǎng)因子受體Trk家族的共受體。最近的研究表明，髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)和髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(OMgp)和Nogo-66一樣，都可結(jié)合NgR并激活RhoA，通過p75NTR來轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)突生長抑制信號[12]。通過中和抗NogoA抗體，使用NgR競爭性拮抗肽或截短的可溶性NgR，均可在體內(nèi)阻斷NgR與其受體之間的相互作用，因而誘導(dǎo)遠(yuǎn)距離軸突再生、補(bǔ)償性生長、及上調(diào)生長相關(guān)基因；同時(shí)也可加強(qiáng)損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)[13]。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)Cj-LPS可減少神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)、增加神經(jīng)抑制因子的表達(dá)，以此誘導(dǎo)髓鞘損傷；而特異性抗LPS抗體可改善脊髓髓鞘病理變化。

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