副溶血性弧菌vpa0166基因與耐藥性相關(guān)性研究

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副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus，Vp)屬于弧菌科弧菌屬，是一種嗜鹽性細(xì)菌，革蘭氏染色為陰性。Vp是最重要的食源性致病菌之一，據(jù)國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示近年來由副溶血弧菌引起的食物中毒居微生物食源性疾病之首[1]。溶血素是副溶血性弧菌的重要毒力因子，是一種胞外產(chǎn)物，起溶解紅細(xì)胞的作用。其中耐熱溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)、耐熱相關(guān)溶血素(TDH-related hemolysin，TRH)、不耐熱溶血素(thermoliable hemolsin，TLH)是主要致病因子，分別由tdh、trh、tlh基因編碼。其中，tlh基因具有種屬特異性，在臨床分離株和環(huán)境分離株中都存在[2]，雖然環(huán)境分離株神奈川現(xiàn)象(Kanagawa phenomenon，KP)較少見，但只要攜帶tdh或trh基因就可被認(rèn)為是毒力株[3]。1996年起以O(shè)3∶K6血清型為代表的大流行株[4]在全球流行，其具有相同的基因型(tdh陽性，trh陰性，尿素酶陰性)，orf8是噬菌體f237 10個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)中獨(dú)特的一個(gè)，與O3∶K6血清型菌株大流行有關(guān)[5]，在超過96%的大流行株中存在。

隨著抗菌藥物在臨床和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不合理使用，導(dǎo)致副溶血性弧菌的耐藥程度日趨嚴(yán)重[6]。當(dāng)耐藥菌通過食物鏈傳遞到人類，將會(huì)導(dǎo)致臨床用藥的失效，從而嚴(yán)重威脅人類的健康。細(xì)菌抗藥性產(chǎn)生的機(jī)制復(fù)雜而多樣，目前研究的主要有靶位基因突變、外排泵作用及可移動(dòng)基因元件等方面。其中由外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)介導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生是重要機(jī)制之一，包括外膜通透性的降低[7]和主動(dòng)外排[8]兩種機(jī)制。本研究對(duì)江蘇省部分地區(qū)的副溶血性弧菌分離株進(jìn)行了分子鑒定，包括毒力基因、大流行株標(biāo)識(shí)基因及本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的推定外膜蛋白編碼基因，測定了對(duì)8種常見抗生素的耐藥性情況，并重點(diǎn)分析了VPA0166(編碼推測外膜蛋白)的分子多樣性與基因特征、耐藥性的相關(guān)性，為尋找副溶血性弧菌的耐藥機(jī)制提供重要線索，加強(qiáng)了對(duì)菌群的了解，有利于抗菌藥物的合理使用和新藥的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 副溶性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 33847(tdh+trh-)、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922均由本實(shí)驗(yàn)室保存；166株副溶血弧菌菌株分離收集于2006-2014年江蘇省部分地區(qū)海產(chǎn)品、熟食、醫(yī)院肛拭子等不同來源，經(jīng)VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定為副溶血性弧菌。

TCBS瓊脂、M-H瓊脂和3% NaCl堿性蛋白胨水 北京陸橋技術(shù)有限公司；8種抗生素藥敏紙片 杭州微生物試劑有限公司；PCR反應(yīng)試劑 寶生物工程(大連)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備 瑞士Kuhner Shaker公司ISF1-XC型恒溫振蕩培養(yǎng)箱；美國ABI公司Veriti PCR擴(kuò)增儀；美國BIO-RAD公司Model 3000Xi型電泳儀；美國BIO-RAD公司GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1引物設(shè)計(jì)與合成 本研究選擇種特異性基因不耐熱溶血素(tlh)[2]鑒定副溶血性弧菌，vpa0166-1引物序列根據(jù)GenBank已發(fā)表的V.parahaemolyticusRIMD 2210633全基因組(登錄號(hào)：BA000032.2)序列自行設(shè)計(jì)，另外，根據(jù)后期測序比對(duì)結(jié)果優(yōu)化設(shè)計(jì)更小目的片段引物vpa0166-2。對(duì)毒力基因耐熱溶血素(tdh)[9]、耐熱相關(guān)溶血素(trh)[10]及大流行株標(biāo)識(shí)基因(orf8)[5]進(jìn)行檢測，所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。具體引物序列如表1所示。

表1 副溶血性弧菌PCR檢測引物序列

Tab.1 Oligonucleotide primers for PCR

PrimerTarget geneSequence (5′-3′)Amplicon size/bptlh-FatlhAAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG450tlh-RbGCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGCVPA0166-1-Favpa0166-1ATGAAAATGAAAACTCTAGC1 050VPA0166-1-RbTTAGAAGTAGTAACGAGCGCVPA0166-2-Favpa0166-2AAYCTRGGTACTGGTCGTGC262VPA0166-2-RbTCTYAACATCACCGCCRCTGtdh-FatdhAGCTTCCATCTGTCCCTTTT434tdh-RbATTACCACTACCACTCTCATAtrh-FatrhGGCTCAAAATGGTTAAGCG250trh-RbCATTTCCGCTCTCATATGCorf8-Faorf8GTTCGCATACAGTTGAGG746orf8-RbAAGTACAGCAGGAGTGAG

注：a，上游引物；b，下游引物。

1.3.2PCR擴(kuò)增 采用熱裂解法粗提DNA：取新鮮培養(yǎng)物5 000 r/min離心5 min，用雙蒸水洗滌菌體2次，棄上清，加500 μL雙蒸水重懸菌體，100 ℃煮沸10 min；12 000 r/min離心10 min，取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

tlh、tdh、trh、orf8基因PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參考相應(yīng)文獻(xiàn)[2, 5, 9-10]進(jìn)行PCR擴(kuò)增；vpa0166基因PCR反應(yīng)體積為25 μL，循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30循環(huán)；最后72 ℃再延伸7 min，反應(yīng)結(jié)束。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳成像，拍照記錄結(jié)果。

1.3.3vpa0166基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序 將PCR反應(yīng)產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，將測序結(jié)果用BLAST、BioEdit等軟件參照GenBank(http://www. ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的V.parahaemolyticusRIMD 2210633 chromosome 2全基因組(登錄號(hào)：BA000032.2)中相應(yīng)序列比對(duì)分析。

1.4藥敏試驗(yàn) 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)CLSI推薦[11]的紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer)測定菌株對(duì)8種抗生素的敏感性。挑取TCBS平板上培養(yǎng)18-24 h的單菌落接種3% NaCl堿性蛋白胨水，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)6～8 h，以無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠞舛?OD625=0.08～0.13，約含1～2×108CFU/mL)。取100 μL菌懸液涂布于直徑90 mm，厚度4 mm的M-H瓊脂平板(約25 mL)上，靜置15 min后用滅菌鑷子把藥敏紙片平貼，并輕壓紙片使其與培養(yǎng)基緊貼不掉落，平皿邊緣距離紙片中心應(yīng)大于15 mm，紙片之間的間距應(yīng)大于24 mm，每種抗生素貼3個(gè)藥敏紙片。37 ℃培養(yǎng)16～18 h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，同時(shí)以大腸桿菌ATCC 25922做質(zhì)控。

1.5相關(guān)性分析 采用SPSS 16.0軟件對(duì)166株副溶血性弧菌菌株的耐藥性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1tlh、tdh、trh、orf8和vpa0166基因的PCR檢測結(jié)果 按所建立的DNA模板提取方法和PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。種特異性引物tlh基因陽性的菌株在450 bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，166株副溶血性弧菌菌株均出現(xiàn)tlh基因陽性條帶；毒力基因tdh、trh陽性率分別為21.1%(35/166)、9.6%(16/166)，大多分布于臨床株；大流行株標(biāo)識(shí)基因orf8檢出率為17.5%(29/166)，且orf8+菌株都為tdh+；編碼推測外膜蛋白基因vpa0166均為陽性，從電泳圖上可以看出該基因結(jié)果具有多樣性，呈現(xiàn)a型和b型兩個(gè)形態(tài)，有86株是a型陽性，80株是b型陽性。

注：M，DL2000 DNA Marker；N，陰性對(duì)照；1～5，副溶血性弧菌分離株圖1 副溶血性弧菌菌株tlh、tdh、trh、orf8和vpa0166基因的PCR檢測結(jié)果Fig.1 Detection of tlh, tdh, trh, orf8 and vpa0166 gene of V. parahaemolyticus isolates by PCR

圖2 vpa0166基因a型和b型擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果Fig.2 Sequencing result of type a and b amplified products of vpa0166

2.2vpa0166基因測序結(jié)果分析 通過測序結(jié)果與GenBank中已報(bào)道的序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，a型和b型序列同源性為94%，其中a型產(chǎn)物中在523至580 bp之間有54個(gè)堿基缺失，見圖2。b型序列與GenBank中登錄的BA000032.2相應(yīng)序列同源性為99%，表明b型菌株與測序菌株在進(jìn)化上更接近。毒力基因與vpa0166多樣性相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，vpa0166多樣性與毒力基因的攜帶沒有顯著的相關(guān)性，但是tdh+trh-orf8+菌株均屬于b型，大部分tdh-trh+orf8-菌株屬于a型。

2.3藥敏試驗(yàn)結(jié)果 用8種常見抗生素對(duì)166株副溶血性弧菌菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，總體耐藥情況見表2。結(jié)果顯示對(duì)頭孢西丁和四環(huán)素耐藥率為3%(5/166)，頭孢噻肟、慶大霉素和復(fù)方新諾明耐藥率分別為3.6%(6/166)、5.4%(9/166)、1.8%(3/166)。多重耐藥分析結(jié)果顯示多重耐藥現(xiàn)象不突出，僅有5株耐2種抗生素以及3株耐3種抗生素，其中有1株菌株對(duì)四環(huán)素和復(fù)方新諾明同時(shí)完全耐藥(藥敏試驗(yàn)無抑菌圈)，該菌株基因型為tdh-trh-orf8-，分離自無錫市。對(duì)同類抗生素的耐藥性有很大不同，如喹諾酮類的環(huán)丙沙星和萘啶酸敏感率分別為51.8%(86/166)、100%(166/166)；β-內(nèi)酰胺類的頭孢西丁和頭孢噻肟敏感率分別為6%(10/166)、81.9%(136/166)，所有菌株對(duì)氯霉素均敏感。

表2 166株副溶血性弧菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Drug resistance of V. parahaemolyticus strains

DrugSensitive% Intermediarysensitive%Resistant%QuinolonesCiprofloxacin8651.88048.200Nalidixic acid1661000000β-lactamsCefoxitin1061519153Cefotaxime13681.92414.563.6AminoglycosidesGentamicin1519163.695.4ChloramphenicolsChloramphenicol1661000000TetracyclinesTetracycline15090.4116.653SulfonamidesSulphamethoxazole/tri-methoprim 19:11619721.231.8

2.4耐藥性與vpa0166基因型相關(guān)性分析 2006-2014年菌株對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥性未出現(xiàn)明顯波動(dòng)，中敏感率在32.3%～53.6%之間。不同來源株耐藥分析顯示，臨床株和環(huán)境株對(duì)環(huán)丙沙星的中敏感率分別為46.6%(27/58)、49.1%(53/108)。菌株毒力基因攜帶與環(huán)丙沙星的敏感情況無必然聯(lián)系，tdh+trh-/tdh-trh+、tdh-trh-型對(duì)環(huán)丙沙星中敏感率分別為56.9%(29/51)、44.3%(51/115)。對(duì)8種抗生素的藥敏性與vpa0166多樣性的相關(guān)性分析結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明菌株vpa0166多樣性僅對(duì)環(huán)丙沙星的敏感率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，同時(shí)有部分a型菌株對(duì)環(huán)丙沙星表現(xiàn)中介耐藥，也有部分b型菌株表現(xiàn)為敏感，表明Vp對(duì)環(huán)丙沙星耐藥性產(chǎn)生過程中存在其他機(jī)制共同作用。

表3 vpa0166基因a型和b型耐藥性比較結(jié)果

Tab.3 Comparison result of type a and b drug resistance of vpa0166

Drugvpa0166-type B(n=80)vpa0166-type A(n=86)S(%)I(%)R(%)S(%)I(%)R(%)P valueCiprofloxacin9(11.3)71(88.7)0(0)77(89.5)9(10.5)0(0)<0.05Nalidixic acid76(95)4(5)0(0)83(96.5)3(3.5)0(0)>0.05Cefoxitin3(3.75)74(92.5)3(3.75)7(8.2)77(89.5)2(2.3)>0.05Cefotaxime62(77.5)15(18.75)3(3.75)74(86)9(10.5)3(3.5)>0.05Gentamicin73(91.25)2(2.5)5(6.25)78(90.6)4(4.7)4(4.7)>0.05Chloramphenicol80(100)0(0)0(0)86(100)0(0)0(0)>0.05Tetracycline72(90)5(6.25)3(3.75)78(90.7)6(7)2(2.3)>0.05Sulphamethoxazole/trime-thoprim 19∶176(95)2(2.5)2(2.5)85(98.8)0(0)1(1.2)>0.05

注：S，敏感率；I，中介敏感率；R，耐藥率。

3 討 論

副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus，Vp)是一種重要的食源性致病菌，被認(rèn)為是典型的海洋性細(xì)菌，但也有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)在淡水水體中有檢出，Sarkar等[12]通過在印度加爾各答淡水區(qū)域采集的樣品中分離得到副溶血性弧菌。Vp的致病機(jī)理較為復(fù)雜，目前公認(rèn)的主要致病因子是耐熱溶血素(TDH)、耐熱相關(guān)溶血素(TRH)。本研究表明在所有分離株中，tdh陽性率為21.1%(35/166)，trh陽性率為9.6%(16/166)，未發(fā)現(xiàn)tdh、trh雙陽性高毒力菌株，其中臨床分離株毒力基因攜帶率為63.8%(37/58)遠(yuǎn)超過環(huán)境分離株的攜帶率13.0%(14/108)，與國際報(bào)道一致[13]，但也有部分區(qū)域環(huán)境、食品分離株毒力基因陽性率也很高[14]。對(duì)于環(huán)境株中有毒力基因攜帶，臨床株中存在tdh-trh-型菌株的現(xiàn)象揭示了不同來源副溶血性弧菌分離株的毒力基因呈多態(tài)性分布，并進(jìn)一步說明的致病過程中存在與TDH或TRH共同作用的其他毒力因子，提示對(duì)于TDH和TRH陰性菌株不能忽視其致病性。自1996年O3∶K6大流行株以來，世界范圍內(nèi)相繼出現(xiàn)許多與O3∶K6有相似遺傳特征的血清型的O3∶K6克隆流行株，導(dǎo)致Vp的感染人數(shù)急劇上升。orf8是f237絲狀噬菌體上的片段，此噬菌體曾被認(rèn)為是1996年以來大流行株出現(xiàn)的最主要甚至是唯一的原因。本研究中orf8基因檢出率為17.5%(29/166)，且orf8+菌株都為tdh+trh-，有研究表明[15]在Vp進(jìn)化過程中丟失噬菌體f237部分或全部片段可導(dǎo)致orf8片段的缺失，從而造成假陰性，認(rèn)為orf8是確定大流行株的充分不必要條件，本研究僅僅將orf8基因作為參考基因研究，未將其作為判定大流行株的唯一標(biāo)準(zhǔn)。

本研究顯示2006～2014年采集的166株Vp分離株未發(fā)現(xiàn)3種以上抗生素多重耐藥的菌株，有1株無錫分離株對(duì)四環(huán)素和復(fù)方新諾明同時(shí)完全耐藥，與李薇薇[16]等發(fā)現(xiàn)的1株浙江分離株耐藥型一樣；對(duì)頭孢西丁(第二代頭孢菌素類)、環(huán)丙沙星(第三代喹諾酮類)的中敏感率分別為91%(151/166)、48.2%(80/166)，而黃銳敏[17]等檢測結(jié)果顯示對(duì)頭孢西丁耐藥率達(dá)83.9%，提示這兩種藥物有耐藥趨勢(shì)，養(yǎng)殖業(yè)及臨床用藥需引起重視。總體看來，近年來江蘇副溶血性弧菌對(duì)大部分抗生素有較好的敏感性，此次頭孢噻肟(第三代頭孢菌素類)的敏感率達(dá)81.9%(136/166)，與譚海芳[18]等報(bào)道的情況不同，但與秦思[19]等研究結(jié)果相吻合，這可能與地區(qū)養(yǎng)殖方式及醫(yī)院用藥習(xí)慣不同有關(guān)。環(huán)丙沙星耐藥性與毒力基因攜帶、不同來源株相關(guān)性分析結(jié)果顯示，tdh+trh-/tdh-trh+、tdh-trh-型對(duì)環(huán)丙沙星中敏感率分別為56.9%(29/51)、44.3%(51/115)，兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，與呂虹等[20]報(bào)道的結(jié)果相同，但可適當(dāng)添加一些毒力調(diào)控基因(toxR、toxS)以及毒力相關(guān)基因(UreR、FlaA、ompW)等做參考，進(jìn)一步分析毒力基因分布與耐藥性的相關(guān)性。另外，臨床株和環(huán)境株對(duì)環(huán)丙沙星的中敏感率分別為46.6%(27/58)、49.1%(53/108)，也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

vpa0166是位于副溶血性弧菌染色體Ⅱ上的基因，本研究利用生物學(xué)軟件PSORTb和PSLpred進(jìn)行定位分析，確定該蛋白位于外膜，推測其為外膜蛋白。通過PCR方法鑒別出該基因存在兩種基因型(a型和b型)，測序結(jié)果表明a型(996 bp)和b型(1 050 bp)序列同源性為94%，且a型較b型產(chǎn)物有54個(gè)堿基缺失，與NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的V.parahaemolyticusRIMD 2210633的相應(yīng)蛋白序列同源性比對(duì)結(jié)果分別為94%和99%，可以看出b型更接近于測序菌株。另外，tdh+trh-orf8+菌株均屬于b型，大部分tdh-trh+orf8-菌株屬于a型，提示vpa0166基因的多樣性為菌株分子分型和分析大流行株的親緣關(guān)系提供了靶分子。通過Blasten結(jié)果發(fā)現(xiàn)還有24個(gè)相關(guān)的比對(duì)結(jié)果，其中有3個(gè)關(guān)于溶藻性弧菌(Vibrioalginolyticus，Va)也存在兩種型，與RIMD 2210633同源性為86%，而溶藻弧菌與副溶血性弧菌在生物學(xué)特性等方面極其相似，同屬于嗜鹽性海生弧菌；另有2個(gè)是哈維氏弧菌(Vibrioharveyi，Vh)，但比對(duì)結(jié)果覆蓋度只有前50%，且相似度只有82%，說明vpa0166基因在弧菌屬(Vibrio)中可被檢測到，而在副溶血性弧菌中分布特性較好。細(xì)菌對(duì)喹諾酮類耐藥機(jī)制的產(chǎn)生主要通過3種方式：靶位改變、膜通透性改變和主動(dòng)外排。外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁特有成分，具有控制小分子如抗生素進(jìn)出的功能，其介導(dǎo)耐藥性包括外膜通透性的降低和主動(dòng)外排兩種機(jī)制。有研究表明[21]，大腸埃希菌膜孔蛋白OmpF與喹諾酮類藥物抗菌作用有直接關(guān)聯(lián)；肺炎克雷伯菌[22]、銅綠假單胞菌[23]中已發(fā)現(xiàn)多種主動(dòng)外排系統(tǒng)，并已證實(shí)其發(fā)揮重要作用。本研究8種抗生素藥敏結(jié)果顯示，vpa0166 a型和b型僅對(duì)環(huán)丙沙星的敏感率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其中b型(1 050 bp)更趨于耐藥，a型(996 bp)趨于敏感，表明Vp對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥性與外膜蛋白編碼基因vpa0166的多樣性存在密切相關(guān)，為繼續(xù)研究耐藥機(jī)制提供理論依據(jù)。

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