30株水禽沙門菌的分離鑒定與血清型分析

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水禽沙門氏菌病(Waterfowl Salmonellosis)是由沙門氏菌引起水禽以腹瀉、生長受阻、生產(chǎn)性能下降、內(nèi)臟器官(尤其是肝臟和脾臟)不同程度地變性與壞死等為主要臨床特征的細(xì)菌性傳染病。沙門菌為革蘭氏陰性菌，依據(jù)沙門菌O抗原、H抗原和K抗原組成不同，可以將沙門菌分為不同的血清型，是腸桿菌科中引起胃腸炎、菌血癥和腸外感染等急性或慢性疾病的人獸共患病重要病原菌之一[1-3]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，細(xì)菌性疾病發(fā)病率與死亡率呈上升趨勢，沙門菌病是現(xiàn)今嚴(yán)重危害水禽的細(xì)菌病之一，主要危害3周齡以內(nèi)的雛鵝，使之出現(xiàn)傷寒、副傷寒等急性或慢性敗血性疾病，嚴(yán)重影響了我國水禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[4]。畜禽呈現(xiàn)慢性感染時(shí)不易發(fā)現(xiàn)，使其常成為沙門菌的攜帶者，致使畜禽產(chǎn)品被污染，從而使得沙門菌通過動(dòng)物產(chǎn)品進(jìn)入食物鏈，最終導(dǎo)致人類感染沙門菌病，表現(xiàn)為急性腸胃炎，尤以鼠傷寒沙門菌感染為典型，常以腹瀉、高熱為主，膿血便多見[5]。本試驗(yàn)主要是對(duì)分離自水禽的30株沙門菌鑒定血清型，實(shí)時(shí)跟蹤本區(qū)域患病水禽沙門菌的血清型分型及了解污染來源和危害評(píng)估，為水禽沙門菌病的防控提供一定的參考資料；并探討禽源沙門菌、人源沙門菌及食源性沙門菌三者間血清型分布的相關(guān)性，為公共衛(wèi)生安全提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源 于2015 -2017年自佛山市及周邊地區(qū)的30例疑似患病水禽中分離純化所得。

1.1.2主要儀器 超凈工作臺(tái)，ZHJH-C1209C(蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司)；生化培養(yǎng)箱，SPX-250B-Z(上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；電熱恒溫水槽，DK-8D型(上海一恒科技有限公司)；T-cycles PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司產(chǎn)品)。

1.1.3主要試劑原材料 丹麥SSI沙門菌診斷血清、丹麥SSI相誘導(dǎo)血清、軟瓊脂、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基購自廣州迪景生物有限公司；LB肉湯、RVS增菌肉湯、麥康凱培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、沙門菌生化鑒定盒購自廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司。

1.1.4引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank的沙門菌ivnE基因序列，使用oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)引物，ivnE-F: 5′-TCGCACCGTCACGAAGGCCGTAGAGC-3′,ivnE-R:5′-GCATTATCGACGAGTACCAGCCGTCT-3′，預(yù)期片段大小為279 bp，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1菌株的分離純化 無菌條件下，挑取疑似感染沙門菌的患病水禽少許肝、膽、脾于RVS增殖肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12～24 h，以接種環(huán)取少許增菌液分別劃線于麥康凱培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基和顯色培養(yǎng)基等選擇或鑒別培養(yǎng)基，置于37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h，觀察各培養(yǎng)基上菌落生長情況，釣取單個(gè)典型菌落作純培養(yǎng)，待進(jìn)一步鑒定。

1.2.2生化特性鑒定 將純培養(yǎng)物用滅菌生理鹽水制成0.5個(gè)麥?zhǔn)媳葷釂挝患?xì)菌懸液，接種于沙門氏菌生化鑒定盒，35 ℃培養(yǎng) 24～72 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3PCR鑒定 按照rTaq酶說明書對(duì)熱裂解法制備的沙門菌總DNA進(jìn)行ivnE基因的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min后4 ℃保存，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，在凝膠成像分析儀上觀察電泳結(jié)果。

1.2.4血清型鑒定 根據(jù)丹麥國家血清研究院沙門菌血清分型方法，采用玻片凝集法鑒定水禽沙門菌血清型。根據(jù)考夫曼-壞特表(Kauffmann-White-scheme，簡稱K-W表)對(duì)測定的O抗原、H抗原結(jié)果確定具體的血清型[6]。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)菌分離純化 從30例疑似水禽沙門菌感染病例分離獲得30株疑似沙門菌分離株；將30株疑似水禽沙門菌分離株的純培養(yǎng)物，經(jīng)過選擇和鑒別培養(yǎng)，初步鑒定為沙門菌分離株。30株分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果符合沙門菌的生化特性，其中鴨源沙門菌有7株分離株，鵝源有23株分離株，具體情況如表1。

表1 分離菌株情況

Tab.1 Thirty isolates of Salmonella

菌株號(hào)地區(qū)來源品種來源鴨源/株鵝源/株F1-F13佛山411Z1-Z8肇慶26J1-J4江門13Y1陽江01Q1清遠(yuǎn)01

2.2PCR鑒定 對(duì)30株分離菌株進(jìn)行PCR特異基因的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增目的條帶大小與預(yù)期片段一致。部分菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

2.3血清型鑒定結(jié)果 30株水禽沙門菌分離株的血清型分屬B、D、C1、E14個(gè)群7種血清型，其中B群為優(yōu)勢血清群，包括19株鼠傷寒沙門菌、3株乙型副傷寒沙門菌、2株印第安納沙門菌、1株斯坦利沙門菌；D群有腸炎沙門菌1株分離株；C1群有2株波茨坦沙門菌，E1群有2株明斯特沙門菌。結(jié)果見表 2。

表2 30株沙門菌的血清型分型情況

Tab.2 Serotype typing of 30 isolates of Salmonella

血清群名稱血清型抗原式動(dòng)物來源百分比(%)B鼠傷寒沙門菌S.Typhimurium1,4,[5],12∶i∶1,2鴨源5株,鵝源14株63.33乙型副傷寒沙門菌S.Paratyhi1,4,[5],12∶b∶1,2鵝源3株10.00印第安納沙門菌S.Indiana1,4,12∶z∶1,7鵝源2株6.67斯坦利沙門菌S.Stanley1,4,[5],1,[27]∶d∶1,2鵝源1株3.33D腸炎沙門菌S.Enteritidis1,9,12∶g,m∶-鴨源1株3.33C1波茨坦沙門菌S.Potsdam6,7;14∶l,v∶e,n,z15鴨源1株,鵝源1株6.67E1明斯特沙門菌S.Muenster3,10,[15][15,34]∶e,h∶1,5鵝源2株6.67

M：DL2000DNA Marker；1-4：待測菌株；5：陽性對(duì)照；6：陰性對(duì)照?qǐng)D1 部分沙門菌ivnE基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of invE gene from some Salmonella isolates

3 討 論

沙門菌病是嚴(yán)重危害畜禽與公共衛(wèi)生安全的細(xì)菌性疾病，血清型眾多，其O抗原和H抗原種類多而復(fù)雜，且常常存在交叉凝集，鑒定其血清型時(shí)極易出錯(cuò)，因此沙門菌診斷血清的選用非常關(guān)鍵。通過比對(duì)國產(chǎn)與進(jìn)口沙門菌診斷血清間的結(jié)果差異，丹麥 SSI對(duì)沙門菌的分型率準(zhǔn)確性可達(dá)97%，優(yōu)于國產(chǎn)血清[7]，因此本試驗(yàn)選用特異、靈敏、簡便的丹麥SSI沙門菌診斷血清。

本試驗(yàn)從30例水禽患病病例中均分離到沙門菌，患禽主要癥狀為精神沉郁、消瘦下痢、生產(chǎn)性能下降及內(nèi)臟器官不同程度的變性壞死，部分患禽呈敗血癥死亡，具有較高的發(fā)病率與死亡率，嚴(yán)重制約水禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。30株水禽沙門分離株均來自佛山及其周邊城市，分離株以B群(83.33%)占優(yōu)勢，其次為E群(6.67%)和C1(6.67%)群，與佛山市48株食源性和人源沙門菌血清型分布研究中血清型以B群(食源性占21.7%、人源占40%)為主[8]的結(jié)果相一致，表明水禽源、食源性、人源沙門菌均存在B群沙門菌高比例感染的現(xiàn)象，三者之間是否存在傳染源、傳播途徑等的相關(guān)關(guān)系，值得繼續(xù)深入研究。

本試驗(yàn)中，鼠傷寒沙門菌(63.33%)為優(yōu)勢血清型，乙型副傷寒沙門菌(10.00%)、波茨坦沙門菌(6.67%)、明斯特沙門菌(6.67%)、印第安納(6.67%)次之，腸炎沙門菌(3.33%)與斯坦利沙門菌(3.33%)少量存在。從中國各地區(qū)分離出的鴨源沙門菌中鼠傷寒沙門菌、腸炎型沙門菌分別占31.9 %和 61.8%[9]；四川地區(qū)分離到鴨源鼠傷寒沙門菌和腸炎型沙門菌占37.5%和14.6%[10]；華東地區(qū)禽源沙門菌以雞白痢沙門菌為主，鼠傷寒沙門菌次之[11]；表明禽源沙門菌優(yōu)勢血清型在不同地區(qū)有不同的比例差異。據(jù)調(diào)查，廣州市2013 年腹瀉病人中的沙門菌血清分型中，常見的沙門血清型以鼠傷寒沙門菌(42.6%)、腸炎沙門菌(15.8%)、斯坦利沙門菌(8.0%)為主[12]；東莞地區(qū)2歲以下嬰幼兒沙門菌感染血清型排名前三位的為鼠傷寒沙門菌、斯坦利沙門菌和腸炎沙門菌，共占68.7%[13]；表明鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌與斯坦利沙門菌血清型都屬于引起人群感染率高的血清型，其比例與本研究的結(jié)果基本相同。大量數(shù)據(jù)表明，明斯特沙門菌、印第安納沙門菌及波茨坦沙門菌在患病水禽中分離率極低，但佛山市食源性沙門菌血清型的研究中，明斯特沙門菌的感染率最高[8]，并且在佛山市高明區(qū)農(nóng)貿(mào)市場生禽肉中，印第安納沙門菌與明斯特沙門菌的分離率排名前四[14]，為禽源與食源性沙門菌在區(qū)域分布中建立了聯(lián)系。

綜上所述，本研究的沙門氏菌分離株血清型均在禽源、人源及食源樣品上可分離得到，三者間的流行病學(xué)關(guān)系與血清型分布具有相關(guān)性，其中鼠傷寒沙門菌與腸炎沙門菌具有廣泛感染的宿主譜，尤其鼠傷寒沙門致病性最強(qiáng)，能引起人和各種動(dòng)物的沙門氏菌感染，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

[1] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2006: 119-120.

[2] Severi E, Booth L, Johnson S, et al. Large outbreak ofSalmonellaEnteritidisPT8 in Ports-mouth, UK, associated with a restaurant[J]. Epidemiol Infect, 2012, 140(10): 1748-1756. DOI: 10.1017/S0950268811002615

[3] Voetsch AC, Van Gilder TJ, Angulo FJ, et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidalSalmonellainfections in the United States[J]. Clin Infect Dis, 2004, 38(3): S127-S134. DOI: 10.1086/381578

[4] Bucher O, Holley RA, Ahmed R. Occurrence and characterization ofSalmonellafrom chicken nuggets, strips, and pelleted broiler feed[J]. J Food Prot, 2007, 70(10): 2251-2258. DOI: 10.4315/0362-028X-70.10.2251

[5] 柴同杰,王海榮,林海,等.畜禽傳染病病原在環(huán)境中的傳播途徑[J].畜牧與獸醫(yī), 2000, 32(S1): 121-125. DOI: 10.3969/j.issn.0529-5130.2000.z1.028

[6] Patrick AD. Grimont & Francois-Xavier Weill. Antigenic formulae of the salmonella serovars[M]. WHO Collaborating Centre for Reference and Research onSalmonella, 2007: 9.

[7] 許學(xué)斌,冉陸.沙門菌分型血清對(duì)比研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2010,25(1):21-25.DOI: 10.3969/j.issn.1673-8640.2010.01.011

[8] 陳耀能,梁景濤,陳愛貞,等.佛山市食源性和人源沙門氏菌血清型分布與耐藥性研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2012,12(8): 955-958.

[9] 鐘傳德.我國部分省市雛鴨致病性沙門氏菌分離鑒定、耐藥譜調(diào)查及攜帶質(zhì)粒特性的初步研究[D]. 雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[10] 余曉龍.四川地區(qū)鴨源沙門氏菌分離與血清型分析及其藥敏性與耐藥基因相關(guān)性研究[D].雅安: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[11] 查華,石火英,吉貞穎,等.華東地區(qū)禽源沙門菌的分布及血清型分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2013, 44(2): 329-332.

[12] 黃冰,周勇,龍佳麗,等. 2013年廣州市腹瀉病人沙門菌血清分型及耐藥性分析[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 15(7): 975-977

[13] 修寧寧,潘俊均,鄧沛汶,等.東莞地區(qū)2歲以下嬰幼兒沙門菌感染血清型分布特征研究[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 38(11): 1502-1504. DOI: 10.3969/j.issn.1673-4130.2017.11.022.

[14] 黃志廣,莫嘉延,李鳳貞.佛山市高明區(qū)農(nóng)貿(mào)市場中食源性沙門氏菌血清型與耐藥性現(xiàn)狀[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué), 2012, 23(6): 6-9.