線粒體關(guān)聯(lián)性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與細胞Ca2+依賴性死亡的研究進展

姚歡，林育純，林忠寧

(分子疫苗學和分子診斷學國家重點實驗室，廈門大學公共衛(wèi)生學院，福建廈門361102)

作為真核細胞極為重要的細胞器，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)在細胞生命活動中緊密聯(lián)系，已發(fā)現(xiàn)在線粒體外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜之間存在特殊的由特定蛋白質(zhì)經(jīng)由物理連接形成的亞細胞器結(jié)構(gòu)，即線粒體關(guān)聯(lián)性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes，MAM)[1]。研究表明，MAM的功能與鈣(Ca2+)信號調(diào)控、線粒體質(zhì)量控制(mitochondrial quality control，MQC)、ER應激和脂質(zhì)代謝等都有著密切聯(lián)系[1]；MAM已經(jīng)被鑒定為細胞命運的調(diào)節(jié)樞紐，其調(diào)控機制與MAM功能蛋白和Ca2+信 號密切相關(guān)[2]。

1 MAM的生物學特性

2006年Gy?rgy等[3]采用透射電子顯微鏡技術(shù)，確證了線粒體和ER之間MAM區(qū)域保持穩(wěn)定的膜間距，通常是25nm左右，不發(fā)生膜融合。MAM依賴其結(jié)構(gòu)中作為物理連接的特定蛋白質(zhì)組分，不僅為線粒體和ER相互作用提供了復雜多樣的結(jié)構(gòu)組成的空間基礎，而且為各種信號通路相關(guān)蛋白質(zhì)分子的“募集”或“組合”提供一個功能平臺。由此，MAM結(jié)構(gòu)及功能的協(xié)調(diào)穩(wěn)定是維持細胞正常生理功能的物質(zhì)基礎，經(jīng)由ER和線粒體的質(zhì)量控制及其動態(tài)調(diào)節(jié)、以及二者Ca2+流變化、ER應激、線粒體相關(guān)性細胞凋亡等方面的調(diào)控，介導外源性環(huán)境因素誘導的細胞毒性、致癌作用、神經(jīng)退行性變、代謝性疾病等細胞的轉(zhuǎn)歸和命運結(jié)局[1]。見圖1。

1.1 MAM的結(jié)構(gòu)組成

圖1 MAM的結(jié)構(gòu)組成及其功能

已有報告數(shù)十種蛋白質(zhì)可分布或招募在MAM上，形成和維持其結(jié)構(gòu)組成。MAM不同組分之間，可通過形成大的功能復合體、以及經(jīng)由結(jié)構(gòu)上或功能上復雜的相互影響，構(gòu)成多樣性功能的分子基礎。已明確的，分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75(glucoseregulated protein75，GRP75)連接位于ER膜的鈣釋放通道1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol1,4,5-trisphosphatereceptor，IP3R)和線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel1，VDAC1)上，形成復合物在MAM的二個膜之間起到物理連接作用[4]。見圖1。

隨著MAM研究的深入，不斷有新的蛋白組分被發(fā)現(xiàn)在MAM上，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶-1α、蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase2A，PP2A)、炎性小體NLRP3等被證實在MAM上發(fā)揮重要的物理連接作用?？傊?，MAM上這些各異的蛋白分子既是其物理結(jié)構(gòu)組成的分子基礎，又是其具體行使功能的承載者。已研究發(fā)現(xiàn)的MAM重要蛋白分子見表1；并且還有更多的MAM結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)蛋白需要進一步探究。

1.2 MAM的鈣信號調(diào)控功能

MAM中多種蛋白與Ca2+信號調(diào)控相關(guān)，除IP3R、VDAC、GRP75等結(jié)構(gòu)組分外，還包括鈣聯(lián)蛋白、MCU等特異性功能蛋白，見表1，共同形成有效的細胞器間Ca2+轉(zhuǎn) 運機制[1]。ER外膜上IP3R的激活可使ER腔內(nèi)Ca2+釋放出來，在分子伴侶GRP75的幫助下，由線粒體外膜上Ca2+通道VDAC1攝入和經(jīng)由線粒體內(nèi)膜的MCU進入線粒體基質(zhì)中。由此形成MAM中Ca2+信號流，經(jīng)由ER和線粒體進行嚴格的調(diào)控，行使Ca2+信號轉(zhuǎn)導功能，見圖1。

1.2.1 MAM功能中的ER相關(guān)Ca2+信號調(diào)控ER是細胞內(nèi)主要的Ca2+儲 存庫，是MAM功能性Ca2+流 的起始。胞漿Ca2+主要通過ER外膜上的SERCA進入ER，維持ER中正常Ca2+水 平[5]。SERCAs家族有 A TP2A1、 A TP2A2和ATP2A3三種不同的基因，各自轉(zhuǎn)錄和翻譯成不同的變異體；其中SERCA2b具有最高的Ca2+親和力，其功能對于ER正常的Ca2+攝取和細胞死亡的調(diào)節(jié)機制至關(guān)重要，是MAM行使Ca2+轉(zhuǎn) 運功能的源泉[5]。

表1 MAM結(jié)構(gòu)組成中的主要蛋白及其生物學作用[1]

ER的Ca2+可以通過尼丁受體(ryanodinereceptor，RyR)和IP3R兩個通道釋放到胞漿[6]，二者是維持ER中Ca2+穩(wěn)態(tài)不可缺少的另一類蛋白質(zhì)；其中RyR主要在滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達(通常用做平滑肌和橫紋肌細胞中的整個ER的標志物)，其與細胞死亡之間的聯(lián)系目前研究較少。IP3R則是在所有細胞類型中普遍表達的電導非選擇性陽離子通道，是MAM的結(jié)構(gòu)組成成分，其在細胞命運調(diào)控中的作用已有大量研究。IP3R通道存在3種不同的亞型(IP3R1、IP3R2和IP3R3)，都可以被第二信使IP3、Ca2+、Ca2+結(jié)合蛋白和ATP激活，并且受硫醇修飾和磷酸化的幾種蛋白(包括癌基因和抑癌基因編碼蛋白)等的調(diào)控[7]。由此構(gòu)成各種細胞MAM中Ca2+流轉(zhuǎn)運的基礎。

1.2.2 MAM功能中的線粒體相關(guān)Ca2+信號調(diào)控線粒體可以攝取從ER釋放的Ca2+、 并儲存少量的Ca2+以維持正常的功能。線粒體是MAM轉(zhuǎn)運Ca2+流 的終點；Ca2+主要通過VDAC1進入線粒體外膜，到達線粒體膜間隙，然后通過位于內(nèi)膜的MCU進入線粒體基質(zhì)中(見圖1)，發(fā)揮生物功能[8]。

VDAC在人體細胞內(nèi)有3個異構(gòu)體(VDAC1/2/3)， 其中VDAC1表達最多，在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，表現(xiàn)為VDAC1在MAM定位和選擇性地與IP3R相互作用，從而增強凋亡Ca2+信 號轉(zhuǎn)移到線粒體[2]；并且MAM中的GRP75結(jié)構(gòu)組分允許這個過程，而小干擾RNA(siRNA)沉默GRP75消除了IP3R和VDAC1之間的功能耦合，減少了激動劑(如組胺等)刺激后經(jīng)由MAM 的線粒體Ca2+吸 收[4]。

為了使MAM的Ca2+流達到線粒體基質(zhì)，位于膜間隙內(nèi)部的Ca2+必須通過MCU復合體。MCU是一個成孔亞基組成的孔道復合物[9]。MCU的表達與MAM的Ca2+流最終進入線粒體基質(zhì)發(fā)揮功能息息相關(guān)，其表達嚴格依賴于胞質(zhì)Ca2+水平，并涉及核因子環(huán)磷腺苷反應元件結(jié)合蛋白，后者直接結(jié)合于M CU基因啟動子而活化轉(zhuǎn)錄[10]，由此調(diào)控MCU參與MAM的結(jié)構(gòu)組分和Ca2+流的功能。

2 MAM與細胞Ca2+依賴性死亡

MAM相關(guān)Ca2+通 道在細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)功能中起著重要作用，它們活性的改變可能是細胞命運調(diào)節(jié)的關(guān)鍵原因。細胞Ca2+過載會引發(fā)活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的級聯(lián)反應，導致線粒體膜電位下降和損傷。MAM蛋白通過綁定Ca2+以及調(diào)節(jié)Ca2+的 釋放和攝取介導細胞內(nèi)Ca2+的流動影響細胞死亡。MAM介導大量Ca2+轉(zhuǎn)運可以促進細胞死亡，而且反應的強度和結(jié)果受存在于細胞器上的各種Bcl-2家族蛋白質(zhì)調(diào)控(見圖1)?？沟蛲龀蓡TBcl-2和Bcl-XL抑制Ca2+轉(zhuǎn) 運[11]；促凋亡成員Bax/Bak、Puma和Bik刺激Ca2+轉(zhuǎn) 運[12]。定位于線粒體和ER的Bax和Bak過表達促進凋亡相關(guān)Ca2+進程；而Bax/Bak雙敲除小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryo fibroblasts，MEFs)，則對Ca2+依賴性死亡刺激具有高度抗性[13]。

2.1 MAM相關(guān)ER鈣泵與細胞Ca2+依賴性死亡

MAM中ER鈣泵和Ca2+通 道控制的Ca2+流信號是生理和病理狀況下決定細胞命運的主要因素；有兩種主要的ER駐留蛋白參與這些過程。第一種是SERCA，其過表達不僅增加ER的Ca2+水平，而且在暴露于促凋亡物質(zhì)(如HBV)時也增加了肝癌Huh7細胞的凋亡敏感性[14]。兩個SERCA1剪接變異體編碼的截短蛋白在Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特征改變與ER中Ca2+穩(wěn) 態(tài)水平降低和Ca2+釋放增加有關(guān)，最終會導致Huh7細胞和宮頸癌HeLa細胞凋亡；而且SERCA1截短異構(gòu)體的過表達會誘發(fā)HeLa細胞中的ER應激，并通過增加MAM偶聯(lián)結(jié)構(gòu)和線粒體Ca2+積 累來放大凋亡反應[14]。

MAM中另一種維持ER鈣穩(wěn)態(tài)的蛋白IP3R通過其表達水平和磷酸化的變化，調(diào)節(jié)Ca2+從ER轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)其他地方(特別是線粒體內(nèi))，最終會改變細胞對死亡的敏感性。大量研究發(fā)現(xiàn)，MAM中IP3R在調(diào)控細胞命運和細胞死亡機制中起關(guān)鍵作用(見圖1)。IP3R敲除的雞淋巴瘤DT40細胞自噬增加，而IP3R穩(wěn)定表達可完全恢復這些IP3R敲除細胞的基本自噬水平[15]。IP3R水平的降低會減少Ca2+轉(zhuǎn)運，降低了線粒體代謝和ATP產(chǎn)生，從而觸發(fā)MEFs細胞自噬。腫瘤抑制因子早幼粒細胞白血病蛋白通過影響IP3R活性來調(diào)節(jié)自噬反應[16]。PP2A通過去磷酸化IP3R，促進ER的Ca2+外排和MEFs細胞凋亡的發(fā)生[17]。原癌基因和抑癌基因編碼蛋白通過調(diào)節(jié)IP3R表達和活性來發(fā)揮其作用，其中原癌基因編碼的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-αserine/threonineprotein kinase，Akt)介導以磷酸酶依賴方式抑制ER的Ca2+外排來調(diào)節(jié)人胚腎細胞(HEK-293)凋亡，而腫瘤抑制因子(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)通過去磷酸化IP3R來抑制Akt的作用，使得ER的Ca2+釋放增加，促進HEK-293細胞凋亡[18]。靶向MAM的Ca2+轉(zhuǎn)運可能是重建腫瘤細胞凋亡敏感性的有效方法，籍此開發(fā)的小肽BIRD-2 (Bcl-2-IP3受體抑制劑-2)可通過與Bcl-2結(jié)構(gòu)域BH4結(jié)合，防止Bcl-2與IP3R的相互作用[11]，誘導腫瘤細胞Ca2+介導的凋亡，并在小細胞肺癌細胞系中觸發(fā)細胞死亡[19]。Foskett等[20]采用IP3R抑制劑XeB對MAM中IP3R介導的Ca2+流的抑制，使得乳腺癌細胞大量自噬死亡。

2.2 MAM相關(guān)線粒體鈣泵與細胞Ca2+依賴性死亡

VDAC通道是線粒體攝取從ER釋放的Ca2+通過線粒體外膜進入膜間隙的重要MAM組成部分；3種不同的VDAC亞型在哺乳動物組織中表達和顯示相似的通道性質(zhì)，但對線粒體Ca2+過載的凋亡敏感性具有相反的影響。

有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠成纖維Rat1a細胞中，Akt增加了己糖激酶2(hexokinase2，HK2)的活性，HK2可以和VDAC1相互作用，抑制VDAC1通道，阻止MAM Ca2+轉(zhuǎn)運，減少了線粒體氧化磷酸化和細胞色素C的釋放，從而抑制凋亡；在抑制Akt后，HK2與VDAC1分離，導致VDAC1打開促進MAM的Ca2+流并增加線粒體膜電位[21]。骨髓細胞白血病因子1可以與VDAC1相互作用，增加線粒體Ca2+攝取，從而促進肺癌細胞遷移[22]。Bcl-2家族的抗凋亡成員Bcl-xL與VDAC1相互作用，通過限制Ca2+信號轉(zhuǎn)移到線粒體來保護MEFs細胞免受凋亡[8]。

與VDAC1不同，缺乏VDAC2的MEFs細胞更易發(fā)生凋亡[23]；VDAC2與Bcl-x(S)相互作用并導致Bak釋放而具有抗細胞凋亡作用[24]。研究發(fā)現(xiàn)，VDAC2特異性與Bak相互作用，VDAC2 過表達選擇性抑制Bak激活、并抑制線粒體凋亡；抑制VDAC2使Bak從線粒體轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)其他區(qū)域(如過氧化物酶體膜)[25]。

MCU作為MAM中Ca2+流的最后通道，其亞基和功能的調(diào)節(jié)，會影響線粒體攝取Ca2+，產(chǎn)生過多ROS，從而增加腫瘤細胞發(fā)生凋亡的可能性；MCU激活通路會被鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶依賴的磷酸化抑制，酪氨酸蛋白激酶可以阻止線粒體Ca2+過載、ROS產(chǎn)生以及隨后的大鼠肝細胞凋亡[26]。組胺刺激HeLa細胞時，MCU表達的細胞線粒體Ca2+攝 取增加，導致凋亡[27]；相反地，miR-25減少MCU表達，或者減少與MCU同型的內(nèi)源性復合物MCUb的表達，它們則減少線粒體Ca2+攝 取，從而減少Ca2+依賴性的HeLa細胞凋亡[28]。

MAM上還有許多蛋白涉及凋亡的調(diào)節(jié)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)p53通過控制MAM中Ca2+轉(zhuǎn)運來調(diào)節(jié)MEFs細胞凋亡[29]。在生長因子刺激MEFs中，定位在MAM上的雷帕霉素位點復合物2可磷酸化激活Akt，后者又磷酸化IP3R調(diào)節(jié)MAM的Ca2+功 能[30]。原癌基因編碼蛋白H-Ras則可通過減少MAM的Ca2+轉(zhuǎn)運，抑制小鼠胚胎成纖維3T3NIH細胞的凋亡過程[31]。

3 MAM結(jié)構(gòu)和Ca2+功能調(diào)節(jié)的生物學作用

3.1 MAM調(diào)節(jié)異常的相關(guān)性疾病

研究表明，在許多疾病的病理過程中都伴隨著MAM結(jié)構(gòu)和功能的改變，MAM的Ca2+功能紊亂可能是某些疾病發(fā)生的重要指標。

MAM是腫瘤細胞代謝和進程的重要調(diào)節(jié)樞紐。有研究表明，與正常肝細胞相比，人肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)細胞中MAM蛋白線粒體融合蛋白Mfn2表達降低，使得細胞對凋亡敏感性降低。而高表達Mfn2可以使HCC細胞中MAM的Ca2+轉(zhuǎn) 運增強，誘發(fā)凋亡[32]。在HeLa細胞中，敲低MAM蛋白中定位于ER的硫氧還蛋白相關(guān)性跨膜蛋白1，會減少MAM接觸位點，降低MAM的Ca2+轉(zhuǎn)運，抑制線粒體代謝，加快腫瘤的生長[33]。丙型肝炎病毒p7蛋白可以促進人肝癌Huh7.5細胞MAM結(jié)構(gòu)增強，導致MAM 的 Ca2+轉(zhuǎn)運水平升高，引發(fā)線粒體Ca2+過載，促進了線粒體ROS產(chǎn)生，導致線粒體功能障礙從而產(chǎn)生代謝適應性反應，最終降低線粒體氧化磷酸化水平，增強糖酵解和脂肪生成[34]。

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)與MAM的Ca2+功能失調(diào)有關(guān)。已知 α-突觸核蛋白(α-synuclein， α-Syn)在PD的病理過程中具有重要作用；Cali等[35]通過在HeLa細胞中高表達 α-Syn，發(fā)現(xiàn)從ER到線粒體的Ca2+轉(zhuǎn)運增加，證實 α-Syn通過增加MAM結(jié)構(gòu)蛋白含量來調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn) 態(tài)；線粒體Ca2+平衡的破壞，可能是MAM結(jié)構(gòu)功能失衡和神經(jīng)元功能紊亂的潛在因素。阿爾茨海默病病理過程中，也發(fā)現(xiàn)MAM上毒性淀粉樣蛋白水平增高，導致MAM結(jié)構(gòu)增強和Ca2+轉(zhuǎn) 運水平升高[36]。亨廷頓氏病(Huntington’s disease，HD)的特征是突變的亨廷頓蛋白，其導致二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)在MAM上積累并觸發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)損傷；使用小分子物質(zhì)LOC14調(diào)節(jié)MAM中的PDI水平，可顯著改善HD疾病模型小鼠的運動功能、減弱腦萎縮和延長存活[37]。

MAM在代謝性疾病中也發(fā)揮重要作用。在瘦素缺陷型ob/ob肥胖小鼠中研究表明，肥胖促進了肝臟MAM結(jié)構(gòu)形成，促使MAM的Ca2+轉(zhuǎn) 運功能增強，造成線粒體Ca2+過載及功能障礙[38]。肥胖癥和2型糖尿病模型小鼠的骨骼肌中顯示出明顯的MAM完整性破壞，這是線粒體功能障礙和胰島素抵抗之前的早期事件；肥胖癥患者肌管中胰島素抵抗與MAM完整性破壞相關(guān)；表明MAM完整性破壞是小鼠和人類肌肉胰島素抵抗相關(guān)的亞細胞改變[39]。MAM作為肝臟中激素和營養(yǎng)信號傳導的重要樞紐，在高糖飲食情況下，可以破壞胰島素抵抗 o b/ob小鼠肝臟MAM結(jié)構(gòu)，干擾MAM的Ca2+轉(zhuǎn)運功能，最終破壞糖代謝穩(wěn)態(tài)；提示MAM介導的ER-線粒體相互作用通路參與代謝性疾病，并指向MAM作為代謝紊亂的潛在治療靶點[40]。

3.2 MAM調(diào)節(jié)外源化學物誘導的細胞毒性

MAM在外源化學物暴露誘發(fā)的細胞或機體毒性損傷中有著極其重要的意義。Kyeong等[41]研究發(fā)現(xiàn)，人支氣管上皮16HBE14o細胞暴露于二氧化鈦納米顆粒時，可誘導細胞ER應激，破壞MAM結(jié)構(gòu)和Ca2+平衡，從而增加自噬。腎上腺皮質(zhì)癌的最有效抗癌藥物米托坦作用于人腎上腺皮質(zhì)H295R細胞，破壞了MAM結(jié)構(gòu)，造成MAM磷脂酰絲氨酸脫羧酶功能障礙，Drp1、乙酰輔酶A結(jié)合結(jié)構(gòu)域3蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白的表達水平明顯降低，最終誘發(fā)細胞凋亡[42]。在肝癌HepG2細胞中，棕櫚酸可以破壞MAM結(jié)構(gòu)，抑制MAM的Ca2+轉(zhuǎn)運，從而增強細胞中線粒體ROS產(chǎn)量，抑制胰島素信號；高表達Mfn2部分恢復了MAM 結(jié)構(gòu)并改善了棕櫚酸引起的胰島素信號抑制[43]。這些研究表明MAM組成結(jié)構(gòu)和功能的高度可塑性，是外源化學物作用的重要靶點，可能作為預防和治療外源化學物誘發(fā)的細胞和機體損傷的干預靶點。

4 結(jié)語與展望

ER和線粒體作為重要的亞細胞結(jié)構(gòu)，與細胞的功能狀態(tài)密切相關(guān)；環(huán)境因素誘發(fā)的細胞毒性是造成機體損傷和疾病的主要原因；已有研究證明外源化學物可以靶向作用于細胞器，如線粒體和ER造成應激反應和損傷，特別是二者特化接觸位點MAM的重要作用也越來越受到關(guān)注。MAM通過ER-線粒體結(jié)構(gòu)偶聯(lián)加強了兩者之間的聯(lián)系，在生理和病理狀態(tài)下通過調(diào)節(jié)固定或招募在MAM上的蛋白組分和結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，調(diào)控MAM的Ca2+轉(zhuǎn)運功能，影響細胞的轉(zhuǎn)歸和命運。

已報道MAM中存在大量結(jié)構(gòu)組成蛋白；外源化學物暴露的細胞中，定位于MAM的相關(guān)功能蛋白，如新鑒定發(fā)現(xiàn)MAM中環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase2，COX-2)的分布，及其動態(tài)變化和功能學作用的調(diào)節(jié)，將為闡明MAM相關(guān)毒性(如致癌作用)機制和篩選生物標志提供新的突破；同時，探討經(jīng)由靶向干預MAM關(guān)鍵組分蛋白表達和修飾介導的細胞(器)損傷和毒性效應的病理過程調(diào)控，有望為探索細胞器之間接觸位點的靶向干預，開展外源物(如環(huán)境誘變劑)暴露誘導毒性作用的評價和有害生物效應的預防控制策略提供新的視點。

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