硒干預(yù)對DEHP暴露下SD大鼠血細胞參數(shù)的作用

楊梅，曹乾， *，寧俊康，任雪丹，王民生

（1．東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京210009；2．江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇南京210009）

硒(selenium，Se)是一種人體必需微量元素，是過氧化物系統(tǒng)內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶發(fā)揮酶活性所需的必要元素[1]。相關(guān)動物實驗證明，Se可以保護肝細胞免受細胞毒性損傷，具有抗氧化作用，提高實驗動物的免疫能力[2-6]。

鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)是鄰苯二甲酸酯類(phthalates acid esters，PAEs)化合物的重要成員[7-8]。由于其實用性和成本效益，DEHP常被工業(yè)上用作增塑劑和改性劑于塑料(聚氯乙烯)生產(chǎn)中，還是一些驅(qū)蟲劑、化妝品、食品包裝袋、醫(yī)療用品和玩具的生產(chǎn)原料，被認為是廣泛的環(huán)境持久性有機污染物[2，9-11]。DEHP可以通過呼吸道、消化道、皮膚接觸或醫(yī)療過程進入機體，對人體具有潛在損害。有研究證明，其毒性作用主要表現(xiàn)為生殖毒性、免疫毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性、肝腎毒性等[11-12]。

本研究通過對SD大鼠進行不同劑量DEHP染毒，同時在不同劑量染毒下 給 予1mg/kg硒干預(yù)保護，測定各組SD大鼠血細胞參數(shù)，以研究硒干預(yù)對DEHP暴露SD大鼠血細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

酵母硒(有機硒含量≥99% ，江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供)；DEHP(純度≥99.5%，美國Sigma公司)。ADVIA2120i型全自動五分類血細胞分析儀(德國Siemens公司)。

1.2 動物分組與染毒

選擇健康清潔級雄性SPF級SD大鼠77只，體質(zhì)量70~90g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2012-0001，質(zhì)量合格證編號11400700158173；飼養(yǎng)于屏障動物實驗室，實驗動物環(huán)境使用許可證號SYXK(蘇)2017-0031。動物實驗室溫度控制在20~26℃，濕度為40%~70%，單籠飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，將受試SD大鼠按體質(zhì)量隨機分為7組，即對照組、3個DEHP染毒組(分別為300、600和900mg/kg)、3個Se干預(yù)組(在3個DEHP染毒組飼料中分別添加1mg/kg酵母硒)，每組11只。DEHP和酵母硒均按相應(yīng)比例均勻拌入基礎(chǔ)飼料中，制成顆粒飼料，將飼料以平均每日動物體質(zhì)量10%的攝食量按組別給予大鼠，連續(xù)飼喂染毒90d。染毒期間，大鼠可自由飲水、攝食。

1.3 染毒前后體質(zhì)量和一般情況觀察

試驗期間觀察并記錄大鼠的一般情況，如日常行為表現(xiàn)、中毒體征(精神亢奮、被毛蓬松、局部脫毛現(xiàn)象)和死亡情況等；染毒干預(yù)90d時，大鼠空腹16h后稱取最終體質(zhì)量，采股靜脈血。

1.4 血細胞參數(shù)的檢測

對SD大鼠采血，用滴加EDTA抗凝劑的1.5mL EP管取SD大鼠全血1.0mL，全自動血細胞分析儀進行血細胞參數(shù)分析。檢測紅細胞數(shù)(red blood cell，RBC)、血紅蛋白含量(hemoglobin，HGB)、紅細胞壓積(hematocrit，HCT)、平均紅細胞體積(mean corpuscular volume，MCV)、平均血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)、平均細胞血紅蛋白濃度(mean cellular hemoglobin concentration，MCHC)、紅細胞體積分布寬度(red blood cell distribution width，RDW)、血紅蛋白含量分布寬度(hemoglobin content distribution width，HDW)；白細胞數(shù)(white blood cell，WBC)、中性粒細胞比例(neutrophil ratio，NEUT)、淋巴細胞比例(lymphocyteratio， LYM)、 單 核 細 胞 (monocytes，MONO)、嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)、嗜堿性粒細胞 (basophilic granulocyte， BASO)； 血 小 板 總 數(shù)(platelet，PLT)、平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)、血小板分布寬度(platelet distribution width，PDW)、血小板壓積(plateletcrit，PCT)等指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間均數(shù)比較經(jīng)方差齊性檢驗后采用單因素方差分析，各實驗組與對照組用Dunnett’s法比較，所有結(jié)果用±s表示，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 硒干預(yù)對不同劑量DEHP染毒SD大鼠體質(zhì)量和體征的影響

與對照組比較，600和900mg/kg DEHP染毒組SD大鼠體質(zhì)量顯著下降(P<0.05或 P<0.01)，且隨著劑量的增加，體質(zhì)量差異越明顯。此 2組動物均表現(xiàn)出精神亢奮、被毛蓬松、局部脫毛(頭頸部、四肢及腹部)等中毒體征。將實驗過程中出現(xiàn)上述陽性癥狀的大鼠視為中毒，結(jié)果顯示不同劑量DEHP染毒SD大鼠中毒體征差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。試驗期間無大鼠死亡。與相同DEHP劑量染毒組相比，1mg/kg Se+各劑量DEHP干預(yù)組大鼠體質(zhì)量均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，且1mg/kg Se+300和600mg/kg DEHP干預(yù)組大鼠體質(zhì)量與對照組相當(dāng)(P均>0.05)。與相同劑量DEHP染毒組比較，1mg/kg Se+300和600 mg/kg DEHP干預(yù)組大鼠中毒體征差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。提示硒干預(yù)改善了300和600mg/kg DEHP染毒組大鼠的中毒癥狀。見表1。

表 1 硒干預(yù)對不同劑量DEHP 染 毒 S D大鼠體質(zhì)量和中毒體征的影響(±s， n =11)

表 1 硒干預(yù)對不同劑量DEHP 染 毒 S D大鼠體質(zhì)量和中毒體征的影響(±s， n =11)

與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與相同劑量DEHP染毒組相比，#P < 0.05，## P<0.01.

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2.2 硒干預(yù)對不同劑量DEHP染毒SD大鼠白細胞參數(shù)的影響

見表2。結(jié)果顯示，600和900mg/kg DEHP染毒情況下，大鼠白細胞總數(shù)顯著下降，單核細胞比例顯著升高，與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。1mg/kg Se+600mg/kg DEHP干預(yù)組與600mg/kg DEHP染毒組相比較，白細胞總數(shù)增加而單核細胞比例下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，而與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

表2 硒干預(yù)對不同劑量DEHP 染 毒 S D 大 鼠白細胞參數(shù)的影響(±s， n =11)

表2 硒干預(yù)對不同劑量DEHP 染 毒 S D 大 鼠白細胞參數(shù)的影響(±s， n =11)

與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與相同劑量DEHP組相比，# P <0.05，## P<0.01.

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2.3 硒干預(yù)對不同劑量DEHP染毒SD大鼠紅細胞參數(shù)的影響

見表3。結(jié)果顯示，300、600、900mg/kg DEHP染毒大鼠平均血紅蛋白量、血紅蛋白含量分布寬度水平均顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。600和900 mg/kg D EHP染毒組大鼠紅細胞總數(shù)和紅細胞壓積水平顯著下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。1mg/kg Se+300mg/kg DEHP干預(yù)組大鼠紅細胞壓積與對照組和DEHP染毒 組 相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 硒干預(yù)對不同劑量DEHP染毒SD大鼠血小板的影響

見表4。在DEHP染毒與Se干預(yù)期間，未發(fā)現(xiàn)大鼠各組血小板參數(shù)出現(xiàn)明顯差異。

3 討論

大鼠經(jīng)不同劑量DEHP染毒后造成了不同程度體質(zhì)量的下降和中毒體征，體質(zhì)量的下降和中毒大鼠的比例具有劑量依賴性，DEHP劑量越高，體質(zhì)量下降越明顯，中毒大鼠的比例越高。進行硒干預(yù)后，300和600mg/kg劑量組大鼠體質(zhì)量和中毒體征比同劑量單獨DEHP染毒組有明顯改善，與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可見硒干預(yù)對低中劑量DEHP染毒大鼠具有積極的保護作用[1，6]。

白細胞是機體內(nèi)的免疫細胞，具有防御和免疫的能力，參與對細菌、病毒等異物入侵時的免疫過程，白細胞各項指標(biāo)的變化是機體免疫力變化的標(biāo)志[13-14]。不同劑量DEHP染毒對大鼠NEUT、LYM、LUC、EOS、BASO指標(biāo)未見顯著影響，在600和900 mg/kg DEHP染毒情況下，大鼠WBC顯著下降，MONO顯著升高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明中高劑量DEHP暴露可能影響大鼠機體的免疫功能，破壞白細胞產(chǎn)生細胞毒性[15]。進行硒干預(yù)后，Se+600mg/kg DEHP干預(yù)組大鼠WBC和MONO水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而Se+900mg/kg DEHP干預(yù)組大鼠的WBC和MONO水平與對照組相比仍然存在顯著差異，可見 1mg/kg Se在高劑量染毒下干預(yù)并不能對白細胞起到保護作用，這可能是在高濃度DEHP暴露下，機體自由基產(chǎn)生增加，影響機體的抗氧化酶系及氧化損傷，該結(jié)果與相關(guān)研究報道結(jié)果一致[11，13]。傅晗等[14]2015年研究硒在大鼠肝臟氧化損傷中作用研究中表明，Se元素作為人體必需的微量元素具有抗氧化作用，一定劑量情況下能夠保護細胞免受染毒暴露侵害，與本研究硒的作用結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示一旦DEHP劑量過高，造成的氧化損傷過強，此時Se干預(yù)并不能再對白細胞起到保護作用[1]。

表3 硒的干預(yù)對不同劑量DEHP 染 毒SD 大 鼠紅細胞相關(guān)指標(biāo)的影響(±s，n=11)

表3 硒的干預(yù)對不同劑量DEHP 染 毒SD 大 鼠紅細胞相關(guān)指標(biāo)的影響(±s，n=11)

度；RDW：紅細胞體積分布寬度；HDW：血紅蛋白含量分布寬度.與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與相同劑量DEHP組相比， #P <0.05，##P<0.01.

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表4 硒的干預(yù)對不同劑量DEHP 染 毒 S D大鼠血小板相關(guān)指標(biāo)的影響(x±s，n=11)

紅細胞是血紅鐵蛋白的重要載體，負責(zé)供給機體組織和細胞所需的氧氣，對機體的正常運行具有重要作用[12]。大鼠DEHP不同劑量染毒后紅細胞參數(shù)檢測結(jié)果顯示HGB、MCV、MCHC、HDW與對照組相比差異不顯著，各劑量DEHP染毒SD大鼠MCH、HDW水平顯著升高(P<0.05)。600和900mg/kg DEHP染毒劑量組SD大鼠RBC和HCT水平顯著下降(P<0.05)。RBC和HCT主要用來判斷有無貧血及貧血的程度，結(jié)果表明中高劑量DEHP染毒情況下機體產(chǎn)生貧血狀態(tài)，攜帶所需的氧氣能力也顯著下降[15-16]。進行硒干預(yù)后結(jié)果與DEHP染毒組未見顯著差異，說明硒在紅細胞受損傷的情況下并不能起到積極的保護作用[1，7，14，17]。趙春風(fēng)等[12]2014年對血細胞氧化應(yīng)激研究中亦證明DEHP染毒對紅細胞造成損傷。血小板的功能主要是促進止血和加速凝血，以及維護毛細血管壁完整性，在本實驗中，不同劑量的DEHP染毒組大鼠血小板相關(guān)指標(biāo)未見顯著差異。說明DEHP對大鼠的凝血止血功能無顯著影響。

綜上所述，300~900mg/kg DEHP染毒會對大鼠體質(zhì)量、中毒體征以及相關(guān)血細胞參數(shù)產(chǎn)生一定的影響，硒干預(yù)在300~600mg/kg DEHP染毒條件下對大鼠體質(zhì)量、中毒體征、血細胞參數(shù)產(chǎn)生積極的保護作用。

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