精子與腫瘤細胞融合模型的生物學特性研究

陳強 ， 靳廣毅 ， 林桂淼，劉好，許改霞，王曉梅，*

（1.深圳大學醫(yī)學院生理學教研室，廣東深圳518060；2.深圳大學光電子器件與系統(tǒng)教育部重點實驗室，廣東深圳518060）

早在上世紀70年代，一些科學家報道了精子與體細胞體外融合的生物現(xiàn)象[1-3]。然而，由于當時技術能力限制，這些實驗都沒有對精子與體細胞融合所形成的嵌合細胞的生物學性狀進行深入研究。直到本世紀初一些研究開始關注精子與體細胞融合所形成的嵌合細胞的生物學特征。目前可以證實的是精子染色體在嵌合細胞中能夠經(jīng)去致密過程而活化，并能夠表達其所攜帶的遺傳信息[1，4]。2004年Khosrotehrani等[5]報道：在同一婦女的多個不同組織和器官可同時存在含有Y染色體的嵌合細胞，說明了這些細胞的同源性，同時也證實了嵌合細胞的干細胞樣特征和較高的遷移能力。隨后的一些研究顯示，造血細胞較其他類型外周血細胞具有更高的嵌合細胞比例[6-7]，而新生的肝組織中嵌合細胞的比例也顯著高于非新生肝組織[8]，這些研究均提示嵌合細胞與正常體細胞在生物學性狀方面的差異和干細胞樣特征。

我們已采用體外共培養(yǎng)的方法[9]，建立了穩(wěn)定的精子與腫瘤細胞融合模型，并采用自主合成的精子與腫瘤細胞共培養(yǎng)基(sperm-tumor co-culture medium，STCM)，對融合模型進行了優(yōu)化。本項研究在體外以精子與宮頸癌HeLa細胞融合模型為主要研究對象，對精子與腫瘤細胞融合的時效性、細胞接種密度依賴性及細胞類型特異性進行了分析。在體內則以臨床收集的宮頸癌標本為主要研究對象，分析嵌合型細胞在宮頸癌組織中是否存在以及Y染色體特異編碼基因在嵌合型細胞的表達。本研究的目的在于探討精子與腫瘤細胞融合過程的生物學特征，為嵌合型腫瘤細胞生物學特征的研究奠定前期實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和實驗動物24孔板(Corning Costar)、35mm培養(yǎng)皿(Corning Costar)、濾孔直徑40 μm的過濾皿(Thermo Scientific)、嵌套式的培養(yǎng)皿/板(Corning Costar)、96孔板 (Corning Costar)、 石蠟 組 織DNA提取試劑盒(Thermo Scientific)。

8~10周齡雄性C57BL/6小鼠(購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物檢疫編號44007200016312)，飼養(yǎng)于SPF級動物房，半晝半夜，自由取食、取水。經(jīng)1周左右適應期后的動物用于精子獲取。

1.2 腫瘤細胞培養(yǎng)

實驗中所用細胞系(表1)均為深圳大學醫(yī)學院納米磁實驗室保存，細胞維持及凍存、復蘇均按照美國模式培養(yǎng)物集存庫(American TYPE Culture Collection，ATCC)推薦的方法進行。

表1 實驗中涉及的細胞系及其培養(yǎng)條件

1.3 細胞融合的時效性研究

小鼠精子獲取、精子與腫瘤細胞共培養(yǎng)以及精子與腫瘤細胞融合率估算方法均按照我們先前提供方法[9]進行。

將HeLa細胞接種于24孔板，待每個集落的細胞數(shù)為4~8個時進行共培養(yǎng)實驗。每30min設置1個取樣點，持續(xù)5h，共計10個取樣點。實驗同時設一個空白對照(不添加精子)和一個陰性對照(嵌套式培養(yǎng)體系)。實驗重復4次，結束后以四甲基噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl tetrazolium bromide，MTT)法估算各個取樣點殘存于孔板底部腫瘤細胞數(shù)量百分比(共培養(yǎng)組吸光度值/陰性對照吸光度值)。

1.4 細胞融合時細胞接種密度的研究

HeLa、HEp-2、H441和MCF-7細胞系(均為人類來源的腺癌細胞系)被用于細胞接種密度依賴性研究。每種細胞分別以30~40/mm2的密度接種于24孔板。待每個細胞集落的細胞數(shù)分別為1~2個、3~5個及8~12個時分別進行共培養(yǎng)實驗，持續(xù)4h。實驗結束后以MTT法估算各實驗組精子與腫瘤細胞的融合率。

1.5 細胞融合的細胞類型特異性研究

我們選取了HeLa、HEp-2、H441等十余種腫瘤細胞系進行與精子融合的細胞類型特異性研究。每種細胞均以30~40/mm2的密度接種于24孔板，每種細胞接種4孔，接種24h后進行精子的共培養(yǎng)實驗，持續(xù)4h。實驗結束后以MTT法估算各實驗組的精子與腫瘤細胞的融合率。為排除小鼠個體差異對融合率的影響，每次實驗均包含HeLa細胞，并根據(jù)不同實驗HeLa細胞與精子的融合率進行標準化。

1.6 嵌合型腫瘤細胞單克隆株的獲得及鑒定

利用自制吸卵針于超凈工作臺內倒置相差顯微鏡(IX71，Olympus)下吸取共培養(yǎng)2h后漂浮于培養(yǎng)基上層的單個腫瘤細胞，并迅速將細胞轉移至96孔板內進行培養(yǎng)。12h后對96孔板內各孔進行細胞計數(shù)，選取單個細胞孔為假定的嵌合型腫瘤細胞單克隆株。待假定的嵌合型腫瘤細胞單克隆株細胞達到 1×107個后，部分細胞進行凍存，取 1 ×106個細胞進行DNA的提取。DNA的提取使用Thermo Scientific公司試劑盒按操作說明書進行。提取的DNA先在紫外分光光度計下進行常規(guī)定量，然后以PCR進行小鼠Y染色體特異編碼的性別決定基因(sex-determinating region on theY chromosome， S RY)的擴增進行驗證。相關引物按照GenBank提供的基因序列自行設計，正向引物：5′-cat cggagggctaaagtgtca-3′；反向引物：5′-ctactccagtcttgcctgt atgtg-3′。小鼠 G APDH基因的PCR擴增反應作為本研究的內參照，相關引物按照GenBank提供的基因序列自行設計，正向引物：5′-tcaacggcacagtcaaggc-3′；反向引物：5′-tccacgacatactcagcacc-3′。PCR擴增反應按如下步驟進行：95℃、5min；95℃、5s，56℃、20 s，72℃、20s，35個循環(huán)； 72℃、 5min。

1.7 臨床宮頸癌組織中嵌合型腫瘤細胞的篩檢

20例宮頸癌石蠟切片標本由深圳市第一人民醫(yī)院病理科提供。石蠟組織DNA提取按照試劑盒(Thermo Scientific)使用說明進行。首先以PCR的方法進行βactin基因的擴增以鑒定提取的DNA質量。然后進行TSPY基因片段的擴增。擴增所需引物均根據(jù)GenBank提供的序列自行設計： β-actin正向5′-agcgcaagtactccgt gtg-3′，反向5′-a a gcaatgctatcacctccc-3′；TSPY正向5′-gggagggtaagggaaataa-3′， 反 向5′-t a ctgggcatcaaacagct-3′。PCR擴增反應步驟如上述PCR實驗方法進行。 TSPY基因的PCR擴增產(chǎn)物委托華大基因公司進行測序，測序結果由Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)在線軟件進行比對分析。

1.8 統(tǒng)計方法

精子與腫瘤細胞的融合率以x±s的形式表示，以方差分析(ANOVA)進行融合率的比較。所有數(shù)據(jù)分析均以SPSS16.0軟件進行，以 α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 精子與腫瘤細胞融合的時效特征

共培養(yǎng)的前1.5h殘存的腫瘤細胞數(shù)量迅速降低(圖1)，此后雖然可見共培養(yǎng)體系中運動活躍的精子，但殘存的貼壁細胞數(shù)量并未發(fā)生顯著改變。

圖1 精子與腫瘤細胞融合的時效特征

2.2 精子與腫瘤細胞融合的細胞密度依賴性

當接種的細胞密度較高(8~12個)時，我們發(fā)現(xiàn)不足10%的HeLa細胞能夠與精子融合，而當細胞接種密度較低(1~2個)時，超過50%的HeLa細胞能夠與精子融合(圖2)。而且我們在4種不同類型的細胞均發(fā)現(xiàn)隨細胞接種密度的升高，精子與腫瘤細胞的融合率呈明顯的下降趨勢(圖2)。

圖2 精子與腫瘤細胞融合的細胞密度依賴性

2.3 精子與腫瘤細胞融合的細胞類型特異性

我們的實驗結果(圖 3)顯示腺癌來源的腫瘤細胞系與精子的融合率顯著高于其他腫瘤細胞系和正常細胞系(P<0.01)；而除腺癌外的其他腫瘤細胞系與精子的融合率顯著低于正常細胞系(P<0.01)。

圖3 精子與腫瘤細胞融合的細胞類型特異性特征

2.4 精子與HeLa細胞融合形成的嵌合細胞的分離和鑒定

利用顯微注射系統(tǒng)抓取和單克隆培養(yǎng)的方法，我們目前共獲得4個精子與HeLa細胞融合單克隆株。經(jīng)小鼠Y染色體特異編碼的性別決定基因(S RY ) 和GAPDH的PCR擴增實驗證實其中的2個單克隆株為含有小鼠X染色體的嵌合細胞(GAPDH擴增陽性而SRY擴增陰性，稱為X型單克隆，圖4A)，2個單克隆株為含有小鼠Y染色體的嵌合細胞(GAPDH和SRY雙陽性，稱為Y型單克隆，圖4B)。

2.5 臨床宮頸癌組織中嵌合型腫瘤細胞的篩檢和鑒定

通過對20例臨床宮頸癌病理組織切片的PCR分析，我們在其中一例(5%，1/20)發(fā)現(xiàn) TSPY基因擴增陽性(圖5A)。此外，我們在 TSPY基因的擴增片段中發(fā)現(xiàn)1處有義突變[天門冬氨酸(GAC)突變?yōu)榻M氨酸(CAC)，圖5B]。

圖4 精子與HeLa嵌合細胞的鑒定

3 討論

精子與除卵細胞外的其他細胞的融合是一種奇特的生物學現(xiàn)象。我們推測相對于體細胞，精子可能更容易與腫瘤細胞發(fā)生融合，因為：①一些臨床研究發(fā)現(xiàn)：相對于周邊的正常組織，女性肺腺癌[10]和甲狀腺癌[11]組織中存在更高比例的嵌合細胞；②腫瘤細胞與正常細胞的膜結構有很大差別，這主要表現(xiàn)為細胞膜糖蛋白、糖脂、黏蛋白及膽固醇水平變化、結構異常及特殊修飾(如糖基化)程度的改變，最終導致腫瘤細胞膜荷電量顯著升高，細胞間接觸抑制消失；細胞膜流動性及通透性升高以及細胞表面蛋白水解酶濃度升高等[12-15]；③整合素(integrin)和受精素的相互識別和作用是精卵細胞膜相互融合的必要條件，而多數(shù)腫瘤細胞表面高表達整合素，整合素能夠激發(fā)跨膜轉運信號，從而改變細胞膜局部細胞骨架結構及跨膜信號轉導分子的活性，介導外源物質進入細胞內[16]。

圖5 宮頸癌組織中 TSPY基因的擴增和測序

我們前期的研究結果建立了穩(wěn)定的精子與腫瘤細胞體外融合模型，并證實了精子在體外可以與腫瘤細胞相互融合[9]。在本項研究中我們發(fā)現(xiàn)：精子與腫瘤細胞共培養(yǎng)的前1.5h， 殘存的貼壁腫瘤細胞數(shù)急劇下降，此后殘存的貼壁腫瘤細胞數(shù)未見顯著變化(圖1)。鑒于嵌合型腫瘤細胞離壁漂浮生長的特性，故可以認為精子與腫瘤細胞的融合事件大多發(fā)生于共培養(yǎng)的1.5 h內。而且精子與腫瘤細胞的融合率在很大程度上取決于腫瘤細胞的接種密度，隨著細胞接種密度的升高，精子與腫瘤細胞的融合率呈現(xiàn)明顯降低的趨勢。我們認為這可能是因為較低的細胞密度增大了精子與腫瘤細胞膜的接觸面積，使更多的精子有可能與腫瘤細胞膜相接觸，從而增大了精子與腫瘤細胞融合的可能性[17]。更為重要的是我們的研究發(fā)現(xiàn)：精子與腺癌來源的腫瘤細胞的融合率顯著高于其他類型腫瘤細胞和正常細胞(圖3)，這一研究結果與先前所報道的女性腺癌組織[9-10]相對于周邊正常組織 有 較高的嵌合細胞比例相一致，而體外發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象在國際上尚屬首次。

利用顯微操作及單克隆培養(yǎng)的方法我們獲得了4個精子與HeLa細胞融合所形成的嵌合型單克隆細胞株，并進行了生物學鑒定(圖4)。雖然以目前的研究方法我們尚不能確定嵌合型HeLa是由單個或者多個精子嵌合而成，但我們較為關注的是Y染色體編碼的基因，尤其是具有原癌或者抑癌基因性質的基因在腫瘤細胞內的表達情況，從這點來說，我們獲得的單克隆株足以勝任嵌合型腫瘤細胞生物學性質的相關研究。

雖然我們體外實驗證實了精子與腫瘤細胞融合的可能性，但體內的實際情況往往更加復雜，那么在體內精子是否也可以和腫瘤細胞發(fā)生融合呢？我們的研究結果給出了肯定的答案。我們以20例宮頸癌蠟塊標本為研究對象，體外擴增Y染色體特異編碼的 TSPY基因，結果在1例標本中得到了陽性擴增產(chǎn)物，提示宮頸癌組織中嵌合型腫瘤細胞的存在?？紤]到嵌合型腫瘤細胞只是腫瘤組織的一小部分，而我們的標本只是取自于一個蠟塊標本，而且我們檢測的只是含有Y染色體的嵌合細胞，含有X染色體的嵌合細胞的情況以目前的實驗手段尚不能檢出，因此，實際宮頸癌組織中嵌合細胞的比例應該遠高于本次實驗所得到的數(shù)據(jù)。此外我們發(fā)現(xiàn)檢測到的宮頸癌組織中的 TSPY基因存在1處有義突變，該突變的發(fā)生是否會導致 TSPY這一具有原癌基因性質的基因表達蛋白量或者結構的變化，并進而導致腫瘤的惡化尚需進一步的實驗驗證。

結合我們前期 的 研究結果，我們以多種方式證實了精子與腫瘤細胞融合的可能性。而且我們證實：精子與腫瘤細胞的體外融合通常發(fā)生于共培養(yǎng)的1.5h內，較低的接種密度更有利于精子與腫瘤細胞的融合，而且腺癌來源的腫瘤細胞更容易與精子發(fā)生融合。

我們的體內研究提示精子有與宮頸癌細胞融合而形成嵌合型腫瘤細胞的可能，那么，這種新形成的腫瘤細胞將具有怎樣特殊的、不同于融合前腫瘤細胞的性質？根據(jù)嵌合型體細胞所表現(xiàn)出的干細胞樣特征和較高的遷移能力，我們推測嵌合型腫瘤細胞應該具有除惡性表型外的干細胞樣特征和較高的遷移能力，即腫瘤干細胞樣特征和更高的轉移能力。如果這樣，無回避措施的性生活將成為宮頸癌患者病情進展的危險因素。因此，嵌合型腫瘤細胞單克隆株生物學特性的研究將為宮頸癌患者能否進行無回避措施的性生活提供實驗依據(jù)。

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