戊唑醇對(duì)秀麗線蟲(chóng)的生殖毒性作用

呂榮榮，屈滿，岳營(yíng)，邱月秀，尹立紅，李云暉*

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009）

戊唑醇(tebuconazole，TEB)是一種羥乙基三唑衍生物，屬于三唑類內(nèi)吸收性殺菌劑，全球生產(chǎn)量大，在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用廣泛，并在農(nóng)作物、水體、土壤中有大量的殘留，在小溪中的最大殘余量為9.1μg/L[1]，對(duì)人類以及動(dòng)物的健康造成了威脅。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明三唑類殺菌劑具有哺乳動(dòng)物生殖毒性[2]，可降低附睪和前列腺的質(zhì)量，導(dǎo)致前列腺組織形態(tài)學(xué)的改變，精子數(shù)量的降低[3]。目前的研究表明，戊唑醇有生物富集性，有明顯的肝毒性，并可以導(dǎo)致甾類激素合成障礙，損害內(nèi)分泌相關(guān)器官，可以導(dǎo)致雄性生物雌性化[4]。

秀麗線蟲(chóng)(簡(jiǎn)稱線蟲(chóng))，是研究生殖毒性的優(yōu)秀模式動(dòng)物[5]。線蟲(chóng)蟲(chóng)體比較小，易于飼養(yǎng)，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的實(shí)驗(yàn)樣本，全身透明，易于進(jìn)行熒光觀察，基因與人具有40%的同源性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有很好的外推性。包括哺乳動(dòng)物與線蟲(chóng)在內(nèi)的有性生殖生物，生殖細(xì)胞從生殖干細(xì)胞到有活性的生殖細(xì)胞的過(guò)程具有高度的保守性。在雄性中，生殖細(xì)胞通過(guò)有絲分裂進(jìn)行生殖干細(xì)胞的自我更新，經(jīng)過(guò)兩次減數(shù)分裂形成單倍體配體，精細(xì)胞活化后成為可以受精的精子。與生殖相關(guān)的基因，線蟲(chóng)與哺乳動(dòng)物也具有高度同源性[6]。所以用秀麗線蟲(chóng)作為模式生物研究環(huán)境毒物對(duì)精子發(fā)生過(guò)程的毒性作用具有較高的可靠性。本研究主要是利用秀麗線蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)探討戊唑醇對(duì)于精子發(fā)生和精子形成過(guò)程的影響以及潛在的毒作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 秀麗線蟲(chóng)蟲(chóng)株與培養(yǎng)方法

野生型N2、him-5(e1490)和fog-2(q71)蟲(chóng)株均購(gòu)于美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)線蟲(chóng)遺傳中心(Caenorhabditis Genetic Center，CGC)。him-5(e1490)，雄蟲(chóng)突變體，有33%的雄蟲(chóng)可以用于雄性生殖毒性方面的研究；fog-2(q71) 是雌蟲(chóng)突變體，本身不產(chǎn)生精子，可與雄蟲(chóng)進(jìn)行雜交產(chǎn)生后代。本研究所用的所有基因型的秀麗線蟲(chóng)均培養(yǎng)于加有大腸桿菌(OP50)的線蟲(chóng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(nematode growth media，NGM)，恒溫20℃培養(yǎng)。

1.2 主要試劑以及配制方法

戊唑醇，純度99.999%，購(gòu)于百靈威科技公司；瓊脂糖、瓊脂 、 多聚蛋白胨、 膽固醇和二甲基亞砜均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；二脒基苯基吲哚(DAPI)，購(gòu)于中國(guó)Sigma-Aldrich公司；Pronase購(gòu)于瑞士Roche公司；Trizol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；SYBR Green I購(gòu)于日本Toyobo公司。

M9緩沖液：氯化鈉2.5g、磷酸氫二鈉3g、磷酸二氫鉀1.5g，加蒸餾水定容到500mL，高壓滅菌結(jié)束后加入0.5mL濃度為1mol/L的硫酸鎂，搖勻備用。

SM緩沖液：25mmol/L氯化鉀 、 45mmol/L氯化鈉 、 5mmol/L氯化鈣 、1 m mol/L 硫 酸鎂 、 50mmol/L HEPES，調(diào)整pH至7.6左右，過(guò)濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配加入BSA或PVP，終濃度分別為1和10mg/mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 染毒方法將戊唑醇溶解于DMSO中，配制成1 mg/mL的儲(chǔ)備液，然后用無(wú)菌M9溶液稀釋成所需染毒濃度，設(shè)3個(gè)濃度組分別為0.1、1.0和10.0μg/L，并設(shè)定M9溶液為對(duì)照組。提前1d制作用于染毒的帶有NGM培養(yǎng)基的24孔板中，并加入OP50。將400μL配制好的染毒液滴至24孔板內(nèi)，然后將L2期的秀麗線蟲(chóng)[N2或者h(yuǎn)im-5(e1490)]加入染毒皿中，在20℃恒溫培養(yǎng)箱中染毒直到L4期。

1.3.2 生育力和發(fā)育水平的測(cè)定染毒后的野生型N2線蟲(chóng)用挑針隨機(jī)分別挑到10個(gè)新的并預(yù)置OP50的NGM培養(yǎng)基上，每24h轉(zhuǎn)一次板，直到線蟲(chóng)不再產(chǎn)卵。對(duì)每個(gè)平板中的秀麗線蟲(chóng)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算出每個(gè)線蟲(chóng)的總后代數(shù)目。染毒后的秀麗線蟲(chóng)挑到新的NGM培養(yǎng)基上，觀察產(chǎn)第1只卵的時(shí)間記為 t0，第1只卵孵化后挑入新的NGM培養(yǎng)基上，子一代產(chǎn)第1只卵的時(shí)間記為t1，世代時(shí)間為 t1-t0。

同時(shí)培養(yǎng)him-5(e1490)雄蟲(chóng)突變株與fog-2(q71)雌蟲(chóng)突變株。突變體fog-2(q71)發(fā)育到雌雄蟲(chóng)株可以分辨時(shí)，將雌蟲(chóng)挑入新的培養(yǎng)皿中單獨(dú)培養(yǎng)。him-5(e1490)雄蟲(chóng)按照1.3.1的方法染毒結(jié)束后與fog-2(q71)雌蟲(chóng)(young adult期)按1∶1的比例挑入提前加有 1滴OP50的新的NGM培養(yǎng)基上，12h雜交結(jié)束后將fog-2(q71)雌蟲(chóng)挑入新的、加有OP50的NGM培養(yǎng)基上，每隔24h轉(zhuǎn)一次板，直至線蟲(chóng)不再產(chǎn)卵，計(jì)算每個(gè)線蟲(chóng)的總產(chǎn)卵數(shù)。每組至少計(jì)數(shù)10條。

1.3.3 生殖細(xì)胞計(jì)數(shù)[7]染毒后的him-5雄性秀麗線蟲(chóng)用M9溶液洗滌3次，用挑針將線蟲(chóng)挑至玻片上，用90%的酒精洗滌3次，加2μg/mL的DAPI染液，蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡進(jìn)行拍照觀察，經(jīng)染色后生殖細(xì)胞核呈藍(lán)色，并整齊的排列在生殖腺內(nèi)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程在恒溫環(huán)境下進(jìn)行，并避光。將一列細(xì)胞中至少有2個(gè)或以上的具有新月形細(xì)胞核的細(xì)胞區(qū)域定義為過(guò)渡區(qū)(transition zone，TZ)[8]，頂體末梢細(xì)胞(distal tip cell，DTC)與TZ之間的細(xì)胞為有絲分裂細(xì)胞，TZ之后的細(xì)胞為減數(shù)分裂細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞核的形態(tài)確定區(qū)域后，計(jì)算有絲分裂區(qū)和減數(shù)分裂區(qū)生殖細(xì)胞的數(shù)目。

1.3.4 精細(xì)胞形態(tài)和大小的測(cè)定染毒結(jié)束后的him-5(e1490)雄蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到不含OP50的NGM培養(yǎng)基上，除去線蟲(chóng)表面黏附的OP50。然后將線蟲(chóng)挑入提前加有1滴精子緩沖液(sperm medium buffer，SMB)的玻片上，在顯微鏡下用1mL注射器輕劃線蟲(chóng)尾部1/3處，釋放出精子。利用微分干涉相差顯微鏡進(jìn)行精子形態(tài) 觀 察，并隨機(jī)選取視野進(jìn)行拍照。每條線蟲(chóng)不少于200個(gè)精細(xì)胞，每組不少于10條。利用Image-pro Plus，測(cè)量精細(xì)胞的直徑以及橫截面積。

1.3.5 精細(xì)胞體外活化能力的測(cè)定在載玻片上滴10 μL含Pronase E(200μg/mL)的SM緩沖液，挑入5~10條染毒結(jié)束后除去OP50的him-5(e1490)雄蟲(chóng)至緩沖液中，用1mL注射器從線蟲(chóng)尾部1/3處劃開(kāi)，釋放精細(xì)胞，10 min后用微分干涉差顯微鏡隨機(jī)選取視野，觀察精細(xì)胞能否形成正常偽足(應(yīng)保證液體不會(huì)干)，出現(xiàn)正常偽足即可視為活化；隨機(jī)選取若干視野計(jì)數(shù)，每條線蟲(chóng)計(jì)數(shù)不少于100個(gè)精細(xì)胞，并計(jì)算其活化率。每個(gè)濃度組10條，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 RNA的提取以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR用Trizol法提取him-5(e1490)線蟲(chóng)的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitativereal-time PCR，qPCR)。引物根據(jù)線蟲(chóng)數(shù)據(jù)庫(kù)的序列(http://www.wormbase.org)以及美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)進(jìn)行設(shè)計(jì)，具體的引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為：SYBR GreenIMasterMix8μL，SYBR GreenIMaster Plus2μL，上、下游引物(10μmol/L)各1.2μL，去離子水6.6μL，cDNA 1μL，組成20μL反應(yīng)體系。根據(jù)引物序列確定退火溫度，擴(kuò)增步驟為94℃預(yù)變性5min，94℃、 5s，52℃退火30s(a ge-1， d af-2， d af-16基因)；或54℃退火30 s(s w m-1， spe-6， a kt-1， spe-4， tr y-5， fer-1基因)，采集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)；72℃、10min延伸，act-1作為內(nèi)參照，采用相對(duì)定量法測(cè)定精子發(fā)生相關(guān)nsulin/IGF信號(hào)通路基因daf-2， a kt-1， a kt-2， d af-16以及SWM-1信號(hào)通路基因try-5， s pe-4， s pe-6，fer-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。每個(gè)基因設(shè)定3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 精子發(fā)生與精子形成相關(guān)基因的引物序列(5′- 3 ′)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利- 用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，結(jié)果采用x±s 表示，后代數(shù)目、生殖細(xì)胞數(shù)、精細(xì)胞直徑、精細(xì)胞橫截面積以及相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平組間的比較采用單因素方差分析，不同染毒劑量組分別與對(duì)照組之間差異的分析采用Dunnet’s t檢驗(yàn)，其中檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。精細(xì)胞活化率的差異分析采用 χ2檢驗(yàn)，不同染毒劑量組分別與對(duì)照組之間差異的分析采用四格表 χ2檢驗(yàn)，并校準(zhǔn)α 值。

2 結(jié)果

2.1 戊唑醇對(duì)秀麗線蟲(chóng)生育力與發(fā)育水平的影響

為了探討戊唑醇是否對(duì)秀麗線蟲(chóng)具有生殖毒性，我們觀察了野生型N2染毒后的后代數(shù)目，結(jié)果見(jiàn)圖1A，可以看出戊唑醇劑量為10.0μg/L時(shí)可以引起野生型秀麗線蟲(chóng)后代數(shù)目的降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。染毒后N2的世代時(shí)間無(wú)明顯差異(圖1B)，表明這種后代數(shù)目的差異是由染毒后線蟲(chóng)生育力降低引起的，而非線蟲(chóng)發(fā)育不良所導(dǎo)致。為了進(jìn)一步探討這種后代數(shù)目的差異是否是由于精子受損引起的，我們觀察了him-5(e1490)染毒后雜交后代數(shù)目，結(jié)果如圖1C所示，戊唑醇染毒后 ， 1.0和10.0μg/L劑量組均表現(xiàn)為后代數(shù)目的降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0 .05)，表明戊唑醇染毒后可以導(dǎo)致精子的產(chǎn)生過(guò)程受損。

2.2 戊唑醇對(duì)精子發(fā)生過(guò)程的毒作用

2.2.1 戊唑醇對(duì)線蟲(chóng)生殖腺生殖細(xì)胞數(shù)目的影響見(jiàn)圖2。him-5(e1490)秀麗線蟲(chóng)戊唑醇染毒后，與對(duì)照組相比，戊唑醇在1.0和10.0μg/L劑量組有絲分裂細(xì)胞數(shù)(圖2A)，減數(shù)分裂細(xì)胞數(shù)(圖2B)，總生殖細(xì)胞數(shù)(圖2C)均明顯減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。說(shuō)明戊唑醇可以影響精子的發(fā)生過(guò)程，導(dǎo)致生殖毒性。

圖2 戊唑醇染毒后對(duì)秀麗線蟲(chóng)生殖腺生殖細(xì)胞的影響

2.2.2 戊唑醇對(duì)精細(xì)胞數(shù)目的影響見(jiàn) 圖 3。1.0和10.0μg/L戊唑醇染毒后，精細(xì)胞的數(shù)目與對(duì)照組相比明顯降低(P均<0.05)。進(jìn)一步表明戊唑醇對(duì)精子發(fā)生過(guò)程產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致精細(xì)胞數(shù)目的降低，從而產(chǎn)生生殖毒性。

圖3 戊唑醇染毒后對(duì)精細(xì)胞數(shù)目的影響

2.3 戊唑醇對(duì)精子形成過(guò)程的毒作用

戊唑醇染毒后，秀麗線蟲(chóng)精細(xì)胞的形態(tài)并未發(fā)現(xiàn)明顯異常，非圓細(xì)胞的數(shù)量并未見(jiàn)明顯增多，但戊唑醇染毒后精細(xì)胞的大小明顯受到影響，精細(xì)胞的直徑與面積都較對(duì)照組有明顯的降低 (P 均<0.01)；利用pronase對(duì)染毒后him-5(e1490)秀麗線蟲(chóng)的精細(xì)胞進(jìn)行體外活化，不能正常伸出偽足的精細(xì)胞視為未能正常活化的精細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)1 .0 和 1 0 μg/L戊唑醇染毒后未活化的精細(xì)胞數(shù)目明顯增多，精細(xì)胞的活化率明顯降低(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)表2。

2.4 戊唑醇對(duì)秀麗線蟲(chóng)精子發(fā)生以及精子形成相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4.1 戊唑醇對(duì)精子發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)的影響戊唑醇暴露后對(duì)秀麗線蟲(chóng)精子發(fā)生相關(guān)的4種mRNA表達(dá)水平的影響見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，daf-2、akt-1、daf-16mRNA在1.0和10.0μg/L染毒劑量組的表達(dá)量均上升(P均<0.01)；age-1mRNA在 0.1~10.0μg/L染毒劑量組的表達(dá)量均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表2 不同濃度戊唑醇暴露后秀麗線蟲(chóng)精細(xì)胞大小及活化能力的影響

2.4.2 戊唑醇對(duì)精子形成相關(guān)基因表達(dá)的影響戊唑醇染毒后對(duì)秀麗線蟲(chóng)精子形成相關(guān) 5種基因mRNA表達(dá)水平的影響見(jiàn)表4。戊唑醇暴露后與對(duì)照組相比精子形成相關(guān)基因 tr y-5、 spe-4、 spe-6、 fer-1的mRNA表達(dá)量均明顯上升(P <0.05或P<0.01)；swm-1mRNA在1.0 μg/L劑量組表達(dá)量上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表3 戊唑醇暴露后秀麗線蟲(chóng)精子發(fā)生相關(guān)基因 m RNA的相對(duì)表達(dá)水平

表4 不同濃度戊唑醇暴露后秀麗線蟲(chóng)精子形成相關(guān)基因 m RNA的相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

三唑類殺菌劑是全球十大農(nóng)藥之一，通過(guò)抑制麥角固醇的合成而達(dá)到殺菌的目的[9]，與其他農(nóng)藥相比，三唑類殺菌劑在全球有更大的消費(fèi)量[10]。戊唑醇是一種常見(jiàn)的三唑類殺菌劑，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物、蔬菜、水果的菌害控制。殘留在蔬菜水果中的戊唑醇的半衰期大約是6d[11]，人可以通過(guò)進(jìn)食攝入殘留的戊唑醇以及在從事相關(guān)職業(yè)時(shí)通過(guò)呼吸和皮膚攝入戊唑醇。在從事農(nóng)業(yè)生產(chǎn)人的尿中檢測(cè)出戊唑醇的兩個(gè)代謝產(chǎn)物TEB-OH以及TEB-COOH的量分別是8.0~387.8 g/L(0.025~1.198mol/L)以及5.7~102.9g/L(0.017~0.305 mol/L)[12-13]。因?yàn)槲爝虼嫉沫h(huán)境殘留量以及職業(yè)暴露可能會(huì)對(duì)人類的健康造成威脅，目前對(duì)戊唑醇的毒性研究越來(lái)越多。

目前的研究表明，三唑類殺菌劑的重要作用靶點(diǎn)是肝臟，可以引起肝臟毒性[14]。也有研究表明三唑類殺菌劑會(huì)抑制甾醇類化合物的合成或者釋放從而損傷內(nèi)分泌相關(guān)器官[15]。哺乳動(dòng)物研究表明三唑類殺菌劑具有生殖毒性[3]，表現(xiàn)為前列腺和附睪組織質(zhì)量的減輕，前列腺組織形態(tài)學(xué)的改變以及后代精子數(shù)量的降低。本文以秀麗線蟲(chóng)作為模式生物，研究戊唑醇的生殖毒性及其潛在的影響基因。

秀麗線蟲(chóng)身體小，易于飼養(yǎng)，全身透明易于熒光觀察，短時(shí)間內(nèi)可以獲得大量的實(shí)驗(yàn)樣本以及突變體易于獲得等優(yōu)點(diǎn)使線蟲(chóng)成為研究化學(xué)物質(zhì)毒性的優(yōu)秀模式動(dòng)物。秀麗線蟲(chóng)野生型N2有兩個(gè)U型性腺臂，每個(gè)性腺含有143個(gè)體性腺細(xì)胞以及大于1000個(gè)生殖細(xì)胞，秀麗線蟲(chóng)雄蟲(chóng)突變體只有1個(gè)性腺，包含56個(gè)體性腺細(xì)胞以及大于1 0 00個(gè)生殖細(xì)胞[16]，大量的生殖細(xì)胞易于進(jìn)行生殖毒性的研究。秀麗線蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞均是從生殖干細(xì)胞開(kāi)始經(jīng)過(guò)有絲分裂與減數(shù)分裂，由二倍體生殖干細(xì)胞形成單倍體配子，再完成受精等一系列的生殖過(guò)程并形成新的生命體。秀麗線蟲(chóng)生殖細(xì)胞從頂體末梢細(xì)胞開(kāi)始隨時(shí)間在性腺上向納精囊方向遷移，所以位于不同發(fā)育狀態(tài)的生殖細(xì)胞定位在性腺的不同部位，易于區(qū)分與觀察。因此，我們選擇秀麗線蟲(chóng)作為模式生物研究戊唑醇的雄性生殖毒性。

首先我們用野生型秀麗線蟲(chóng)N2的后代數(shù)目作為指標(biāo)探討戊唑醇是否具有生殖毒性，世代時(shí)間作為發(fā)育指標(biāo)探討發(fā)育毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明戊唑醇可以導(dǎo)致秀麗線蟲(chóng)后代數(shù)目的減少，世代時(shí)間并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明此劑量下，戊唑醇導(dǎo)致的秀麗線蟲(chóng)生育力的降低很有可能是生殖細(xì)胞受損導(dǎo)致的并不是由于發(fā)育低下引起的。目前的研究表明戊唑醇具有雄性生殖毒性，可以導(dǎo)致睪丸和附睪質(zhì)量的降低，所以我們又觀察了him-5(e1490)雄蟲(chóng)染毒后與fog-2(q71)雜交之后的后代數(shù)目，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雜交之后的后代數(shù)目也較對(duì)照組降低，表明戊唑醇暴露后可以導(dǎo)致雄性生殖毒性。

生殖細(xì)胞攜帶遺傳信息完成生物信息的世代傳遞，是聯(lián)系有性生殖生物過(guò)去、現(xiàn)在和未來(lái)的紐帶。在這個(gè)過(guò)程中，含有兩份遺傳信息的生殖干細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的過(guò)程生成單倍體的配子，然后完成受精過(guò)程形成新的生物體。對(duì)于雄性來(lái)說(shuō)，雙倍體的精母干細(xì)胞歷經(jīng)精子的發(fā)生過(guò)程產(chǎn)生單倍體的配子，然后通過(guò)精子的形成過(guò)程產(chǎn)生有功能的、活化的、可以受精的精子[17]。在精子的發(fā)生過(guò)程中，生殖干細(xì)胞通過(guò)有絲分裂維持生殖細(xì)胞的數(shù)量，經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂進(jìn)行分化產(chǎn)生單倍體的配體。在這個(gè)過(guò)程中受多種信號(hào)通路的調(diào)控，Insulin/IGF信號(hào)通路是其中關(guān)鍵的調(diào)控通路之一[18]。并且有研究表明戊唑醇會(huì)導(dǎo)致激素合成障礙，所以我們懷疑Insulin/IGF信號(hào)通路可能是戊唑醇染毒后導(dǎo)致生殖毒性的作用機(jī)制之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，戊唑醇染毒后有絲分裂區(qū)的細(xì)胞以及減數(shù)分裂區(qū)的細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組相比均降低，提示戊唑醇損害精子發(fā)生過(guò)程，精子發(fā)生過(guò)程產(chǎn)生的精細(xì)胞數(shù)目染毒劑量組與對(duì)照組相比也降低，進(jìn)一步驗(yàn)證了精子發(fā)生過(guò)程的異常。IGF-1通路包括DAF-2/IGF-1受體(IGF-1R)、磷脂酰肌醇3-激酶(AGE-1/PI3K)、磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK1)、AKT-1/2和血清與糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶(SGK-1)5部分。細(xì)胞外信號(hào)通過(guò)DAF-2/IGF-1R轉(zhuǎn)導(dǎo)，刺激AGE-1/PI3K活化后產(chǎn)生次級(jí)信號(hào)激活PDK1、AKT-1/2及SGK，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Forkhead box class O(DAF-16/FOXO)的活性，最終調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞分裂周期[19]。與對(duì)照組相比，daf-2、akt-1、daf-16 mRNA在1.0和10.0μg/L戊唑醇染毒劑量組表達(dá)量均上升；age-1mRNA在各染毒組表達(dá)量均明顯下降。表明戊唑醇可能是通過(guò)影響IGF-1通路相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致精子發(fā)生過(guò)程的異常，從而產(chǎn)生生殖毒性。daf-16基因編碼線蟲(chóng)box O(FOXO)同系物蛋白；daf-16作為一種轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)秀麗線蟲(chóng)生命的很多過(guò)程，包括壽命、脂肪代謝 、 應(yīng)激反應(yīng)和先天免疫調(diào)節(jié)等并受多種基因調(diào)控[20-21]；daf-16可以響應(yīng)并且協(xié)同其他基因參與DNA損傷過(guò)程，減輕DNA損傷導(dǎo)致的發(fā)育停滯[22]；在我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，戊唑醇染毒后，位于不同時(shí)期的生殖細(xì)胞的數(shù)目都有不同程度的降低，但是細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程并沒(méi)有受損，生殖干細(xì)胞依然可以經(jīng)過(guò)有絲分裂、減數(shù)分裂等一系列的過(guò)程發(fā)育成精細(xì)胞，生殖腺的組織形態(tài)也沒(méi)有發(fā)生明顯的改變，所以 d af-16基因的高表達(dá)可能與其減輕DNA損傷有關(guān)。

生殖干細(xì)胞經(jīng)過(guò)精子的發(fā)生過(guò)程生成精細(xì)胞，精細(xì)胞必須經(jīng)過(guò)活化并具有一定的遷移能力才能到達(dá)子宮與卵子結(jié)合完成受精。精細(xì)胞成為有活力的可以受精的精子的這個(gè)過(guò)程稱為精子的形成。雄性家兔實(shí)驗(yàn)表明三唑類殺菌劑可以減少精子的數(shù)量，使精子的形態(tài)以及運(yùn)動(dòng)能力異常[23]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比戊唑醇并沒(méi)有導(dǎo)致秀麗線蟲(chóng)精子形態(tài)的改變，但是與對(duì)照組相比精子相對(duì)比較小，表現(xiàn)為精子直徑以及橫截面積的降低。精細(xì)胞體外活化的能力較對(duì)照組也降低，表明戊唑醇染毒后可以影響精子形成過(guò)程。SWM-1信號(hào)通路是調(diào)節(jié)精子形成過(guò)程的關(guān)鍵通路之一[24]。SWM-1蛋白酶抑制劑抑制TRY-5蛋白酶的活化后激活相應(yīng)的可傳入精子細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，進(jìn)而抑制SPE-6激酶的活性，激活SPE-4并與FER-1分離，之后MO和細(xì)胞膜融合，從而活化精子細(xì)胞，形成具有運(yùn)動(dòng)活力的精子[25]。我們的研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，戊唑醇暴露后精子形成相關(guān)基因try-5， spe-4，spe-6， fer- 1 的mRNA表達(dá)量均明顯上升， swm-1基因1μg/L 劑量組基因表達(dá)量上升，提示戊唑醇可能是通過(guò)SWM-1信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)影響精子形成過(guò)程，導(dǎo)致精子變小，并且活化能力降低。精子的形成過(guò)程是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，各種信號(hào)通路參與其中，相互調(diào)節(jié)，SWM-1蛋白可以抑制精子在交配前活化，從而確保雄性的生殖能力，因?yàn)闊o(wú)法成功的轉(zhuǎn)運(yùn)已經(jīng)活化的精子，swm-1突變體的雄蟲(chóng)不具有生殖能力[26]；精液蛋白酶TRY-5是秀麗線蟲(chóng)中精子的活化啟動(dòng)器可以啟動(dòng)精子的活化[27]，雌雄同體交配后，TRY-5蛋白從性腺釋放并伴隨著精子的遷移轉(zhuǎn)移到雌性秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)，使精子在合適的時(shí)間活化[27]。SPE-6是類酪蛋白激酶1蛋白，在精子發(fā)生過(guò)程中精細(xì)胞的分裂[28]以及精子的活化方面均發(fā)揮作用[29]， spe-6基因突變體雄蟲(chóng)的精子也會(huì)提早活化，從而導(dǎo)致生殖能力的降低[29]。SPE-6蛋白同時(shí)參與SPE-8信號(hào)通路的精子活化途徑，并且起負(fù)調(diào)控作用，而且精子形成的發(fā)動(dòng)需要下降的SPE-6蛋白的表達(dá)[30]，在我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，try-5、 spe-4、 fer-1基因表達(dá)量的上升，表明戊唑醇可以使精子在雄蟲(chóng)體內(nèi)過(guò)早的成熟，可能也是導(dǎo)致雄蟲(chóng)體內(nèi)儲(chǔ)存的精細(xì)胞數(shù)目降低的原因之一，而 spe-6基因表達(dá)量的上升，表明在交配后，戊唑醇影響了雄蟲(chóng)的精子在雌蟲(chóng)體內(nèi)激活SPE-8信號(hào)通路，從而使有幸生存下來(lái)的可以進(jìn)入雄蟲(chóng)體內(nèi)的精子的活化率降低，最終導(dǎo)致生殖能力的下降；此外，因?yàn)?spe-6基因同時(shí)參與精子發(fā)生的過(guò)程的調(diào)控， spe-6基因表達(dá)量的上升，可能還受其他基因的影響。

總的來(lái)說(shuō)，戊唑醇可以通過(guò)影響IGF-1通路相關(guān)基因的表達(dá)從而使生殖腺生殖細(xì)胞數(shù)目降低，減少精細(xì)胞的數(shù)量從而影響精子的發(fā)生過(guò)程；使SWM-1信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)量上升，降低其作用從而使MO與細(xì)胞膜無(wú)法融合，不但使精細(xì)胞變小，并且使精細(xì)胞的活化異常，從而產(chǎn)生生殖毒性。

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