紡錘體檢查點(diǎn)功能復(fù)合物基因MAD1L1遺傳變異與潮汕地區(qū)女性乳腺癌易感性研究

楊少宜，張慶英，*，吳俊東，林秋強(qiáng)，王銳鋒，鄭慶元，蔡奮

（1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，廣東汕頭515041；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，廣東汕頭515041；3．汕頭市澄海區(qū)人民醫(yī)院，廣東汕頭515899；4．汕頭市金平區(qū)婦幼保健院，廣東汕頭515041）

乳腺癌是嚴(yán)重威脅世界女性健康的常見惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)，每年有超過100萬人被確診患乳腺癌，至少40萬人死于該疾病，占全部腫瘤死因的14%，位居女性死因榜首[1]。近30年來中國乳腺癌的發(fā)病率增長了20%~30%，并以每年3%~5%的速度增長且呈現(xiàn)出年輕化的趨勢[2-3]，已成為突出的公共衛(wèi)生問題。因此，探究與乳腺癌發(fā)病相關(guān)的環(huán)境及遺傳因素及其作用機(jī)制對于乳腺癌的防治有著重要意義。

染色體非整倍性是人類實(shí)體腫瘤最為普遍的特征，被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。有絲分裂阻滯缺陷1類似物1(mitotic arrest deficient1-like1，MAD1L1)作為紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)(the spindle-assembly checkpoint，SAC)的重要組成成員，在細(xì)胞周期調(diào)控中通過與有絲分裂阻滯缺陷2類似物1(MAD2L1)結(jié)合形成四聚體復(fù)合物共同在啟動檢驗(yàn)點(diǎn)信號中發(fā)揮作用，MAD1L1結(jié)構(gòu)上的異常均可能導(dǎo)致SAC功能失活，進(jìn)而導(dǎo)致染色體非整倍性或癌變[6-9]。在前期的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)定位于染色體7p22.3區(qū)域內(nèi)存在著一個(gè)MAD1L1基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點(diǎn)，即rs1801368，該位點(diǎn)上堿基的突變會導(dǎo)致所編碼的氨基酸由精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸，進(jìn)而削弱其在執(zhí)行有絲分裂阻滯功能上的作用，可能導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定的發(fā)生[8-9]。相關(guān)研究報(bào)道亦證實(shí)該位點(diǎn)的突變與肺癌及結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[6，10]，但目前關(guān)于該位點(diǎn)的變異與乳腺癌的關(guān)系尚未見報(bào)道。據(jù)此，本研究通過分析潮汕地區(qū)女性乳腺癌患者及對照人群中的M AD1L1rs1801368位點(diǎn)的基因變異情況，結(jié)合生理指標(biāo)、臨床指標(biāo)、疾病史、生活方式等指標(biāo)，揭示環(huán)境與M AD1L1rs1801368遺傳變異與乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采用病例-對照研究，入選2015年12月—2017年12月就診于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院初診為乳腺癌、未經(jīng)化療和放療的住院患者作為病例，選取同期居住在潮汕地區(qū)的健康居民作為對照。所有患者的確診均以組織病理學(xué)檢查結(jié)果為依據(jù)，同時(shí)排除患兩種或兩種以上惡性腫瘤、既往有腫瘤史及乳腺癌非原發(fā)腫瘤患者。健康對照的納入標(biāo)準(zhǔn)為：與乳腺癌患者無親緣關(guān)系；無腫瘤史或乳腺疾病史；經(jīng)乳腺彩超、乳腺X線檢查無任何患乳腺癌或可疑乳腺癌前損傷或患其他腫瘤跡象。本研究共納入病例191例，健康對照225例，經(jīng)研究對象知情同意，并獲得汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會通過。

1.2 調(diào)查方法

乳腺癌病例的調(diào)查采用病歷回顧的方式獲得人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征信息(包括年齡、住址、職業(yè)、民族、受教育程度、醫(yī)保類型)，女性生理生育指標(biāo)(初潮年齡、絕經(jīng)與否、絕經(jīng)年齡、月經(jīng)周期、生育狀況、哺乳情況等)，生活方式(吸煙、飲酒狀況)，人體測量指標(biāo)(身高、體質(zhì)量、血壓、心率、心電圖)，生化指標(biāo)(總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖)，臨床病理 指 標(biāo)[腫瘤病理類型、腫瘤體積、臨床TNM分期、雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕酮受體(progesteronereceptor，PR)、人表皮生長因子受體2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER-2)、細(xì)胞增殖核抗原Ki-67(nuclcar-associated antigen Ki-67，Ki-67)狀態(tài)、分子分型和組織學(xué)分級]及疾病史(糖尿病史、高血壓病史、血脂代謝紊亂病史、乳腺癌家族史、癌癥家族史、良性乳腺疾病史)。

健康對照的調(diào)查采用現(xiàn)場問卷調(diào)查、體格檢查、生化檢查的方式，對自愿接受調(diào)查者簽署知情同意書，強(qiáng)調(diào)隱私保護(hù)。調(diào)查問卷的內(nèi)容涵蓋上述人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征、女性生理生育指標(biāo)、疾病史?，F(xiàn)場獲得人體測量參數(shù)并采集非抗凝血樣2 m L，其中1 m L通過生化檢測儀獲得對照生化指標(biāo)，另1 m L用于后續(xù)基因分型。

1.3 DNA提取

采用DNA提取試劑盒提取病例及對照樣本全基因組 DNA (QIAamp DNA BloodMini Kit， 貨 號 51106)，DNA的濃度、純度經(jīng)NanoDrop2000微量紫外分光光度計(jì)測定。提得的DNA樣本置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因分型

將DNA樣本統(tǒng)一配制為40ng/μL的濃度，通過鼓風(fēng)干燥箱對樣本進(jìn)行烤干。采用國際主流SNP分型TaqMan熒光雙標(biāo)記探針法對入選位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，實(shí)驗(yàn)中所需PCR引物和TaqMan探針由ABI公司設(shè)計(jì)合成。PCR反應(yīng)體系為(總體積5μL)：TaqManTMUniversalMasterMix2.5μL，40×探針0.125μL，超純水2.375 μL。應(yīng)用ABI QS12K高通量熒光定量PCR系統(tǒng)對樣本進(jìn)行基因分型，擴(kuò)增條件如下：50℃預(yù)變性2min→95 ℃變性15s→60 ℃ 退火1min→60℃延伸90s，50個(gè)循環(huán)。通過隨機(jī)抽取5%的樣本進(jìn)行二次分型，以對分型結(jié)果進(jìn)行重復(fù)性檢驗(yàn)，兩次結(jié)果一致率控制在95%以上。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以-x±s表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及百分比表示。對于服從方差齊性、正態(tài)性的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，不服從正態(tài)性的計(jì)量資料或等級資料采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。率或構(gòu)成比的比較采用 χ2檢驗(yàn)，病例與對照的基因型頻率分布比較采用 χ2檢驗(yàn)或精確檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用二分類非條件Logistic回歸分析不同基因型與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對照組的一般特征比較

病例組與對照組在年齡、身高、體質(zhì)量上的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在職業(yè)與受教育程度上的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。生化指標(biāo)方面，病例組的平均心率、收縮壓、舒張壓、空腹血糖值均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；病例組的總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白均值均低于對照組，兩組在高密度脂蛋白指標(biāo)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 乳腺癌患者與健康對照一般特征比較(-)x±s

2.2 病例組與對照組女性相關(guān)危險(xiǎn)因素比較

乳腺癌患者與健康對照在初次生育年齡、哺乳方式、絕經(jīng)狀態(tài)上的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組在初潮年齡、孕數(shù)、生育胎數(shù)、最長哺乳時(shí)間及流產(chǎn)胎數(shù)方面差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。相關(guān)疾病史方面，病例組中14例有乳腺癌家族史(7.4%)，35例有癌癥家族史(18.4%)；對照組中均無乳腺癌家族史，3例有癌癥家族史(1.3%)，二組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。在子宮切除術(shù)史和子宮卵巢疾病史上，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 乳腺癌患者與健康對照女性相關(guān)危險(xiǎn)因素比較(-)x±s

2.3 rs1801368基因型頻率分布及與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

MAD1L1基因多態(tài)性位點(diǎn)rs1801368在病例組中的基因型分布頻率分別為CC39例(20.63%)，CT81例(42.86%)，TT69例(36.51%)；在對照組中的基因型分布頻率分別為CC63例(30.14%)，CT86例(41.15%)，TT60例(28.71%)，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.066)。但經(jīng)調(diào)整年齡、初潮年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、受教育程度、職業(yè)類型等混雜因素后的多因素分析結(jié)果表明，以野生純合子基因型CC為參照，攜帶突變型TT基因型的女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)是野生型的3.40倍(O R=3.40，95%C I：1.29~8.97，P =0.013)，見表3。

2.4 rs1801368基因型分布與乳腺癌患者病理特征間的關(guān)系

結(jié)果顯示M AD1L1多態(tài)性位點(diǎn)rs1801368不同基因型在乳腺癌患者腫瘤病理類型、腫瘤最大直徑、區(qū)域淋巴結(jié)臨床分類、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、腫瘤臨床分期、ER、PR、Herb-2、Ki-67受體情況、腫瘤分子分型、腫瘤組織學(xué)分級及危險(xiǎn)度評價(jià)等臨床病理參數(shù)上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，結(jié)果見表4。

表3 MAD1L1多態(tài)性位點(diǎn)rs1801368基因型頻率分布及與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

表4 MAD1L1多態(tài)性位點(diǎn)rs1801368基因型與乳腺癌患者臨床病理特征分析

3 討論

紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)作為染色體正確分離的監(jiān)督機(jī)制，在染色體沒有完成正確排列之前，能夠通過抑制有絲分裂后期的開始進(jìn)而確保遺傳物質(zhì)的正確分配[11]。MAD1L1作為紡錘體檢查點(diǎn)功能復(fù)合物的重要組成成員，通過與MAD2L1結(jié)合共同在啟動檢驗(yàn)點(diǎn)信號中發(fā)揮作用并對其行使轉(zhuǎn)運(yùn)和激活功能，MAD1L1結(jié)構(gòu)上的異常均可導(dǎo)致紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)功能失活，進(jìn)而導(dǎo)致染色體出現(xiàn)非整倍性或癌變[8-11]。此前，Yuan等[12]通過分析包括M AD1L1在內(nèi)的8個(gè)SAC基因在12種乳腺癌細(xì)胞株中的RNA和蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)大多數(shù)乳腺癌細(xì)胞存在染色體不穩(wěn)定和紡錘體檢查點(diǎn)功能缺陷現(xiàn)象；Qian等[13]的研究則發(fā)現(xiàn)相比正常乳腺細(xì)胞，MAD1L1蛋白表達(dá)水平在癌細(xì)胞核中顯著上調(diào)，并與Herb-2狀態(tài)、腫瘤類型及P53表達(dá)有關(guān)；Pujana等[14]進(jìn)行的一項(xiàng)有關(guān)乳腺癌易感性與中心體功能障礙的網(wǎng)絡(luò)建模研究發(fā)現(xiàn)MAD1L1存在于以BRCA為中心的網(wǎng)絡(luò)模型中，并識別到MAD1L1-BRCA1的內(nèi)源性蛋白復(fù)合物。上述研究結(jié)果均為本研究的假設(shè)即M AD1L1基因上某些位點(diǎn)的突變與女性乳腺癌易感性相關(guān)奠定了基礎(chǔ)。

本研究通過研究潮汕地區(qū)女性乳腺癌患者及對照人群中M AD1L1rs1801368位點(diǎn)的基因變異情況，結(jié)合生理指標(biāo)、臨床參數(shù)、疾病史、生活方式等指標(biāo)，最終結(jié)果表明，M AD1L1多態(tài)性位點(diǎn)rs1801368堿基的突變與女性患乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，攜帶突變型基因型的女性是攜帶野生型基因型女性患病風(fēng)險(xiǎn)的3.40倍，提示MAD1L1上rs1801368堿基的突變可能可以作為女性乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)篩查的分子標(biāo)志物。本研究結(jié)果與此前該位點(diǎn)在肺癌及結(jié)直腸癌的中國漢族湖北武漢人群中的研究結(jié)果一致，此前Guo等[10]通過對中國漢族湖北武漢地區(qū)的肺癌及健康對照M AD1L1多態(tài)性位點(diǎn)rs1801368進(jìn)行基因分型，最終發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)攜帶突變型基因型的人群患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶野生型基因型的1.40倍，相似的結(jié)論亦在同一地域的由結(jié)直腸癌患者和健康對照組成的病例對照研究中得到驗(yàn)證[6，10]。

通過收集病例對照的人口學(xué)特征、疾病史、人體測量指標(biāo)及生化指標(biāo)等信息進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者相比于健康對照在空腹血糖、收縮壓、舒張壓、心率4項(xiàng)指標(biāo)上數(shù)值均較高；而總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白均較低，提示乳腺癌的發(fā)病還與人體代謝疾病相關(guān)，是一種多因素相互作用的復(fù)雜疾病。流行病學(xué)資料以及臨床研究已證實(shí)代謝綜合征與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，其影響機(jī)制可能涉及胰島素、胰島素抵抗、內(nèi)源性激素、瘦素、脂聯(lián)素、炎癥因子等多種因子[15-18]。

本研究挑選的位點(diǎn)位于外顯子區(qū)域，據(jù)報(bào)道其堿基的突變會引起編碼的氨基酸的改變進(jìn)而影響紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)的功能，但尚未見有關(guān)該位點(diǎn)在乳腺癌人群中的報(bào)道，本次研究首次揭示了M AD1L1rs1801368基因變異與中國漢族潮汕地區(qū)女性乳腺癌易感性之間的關(guān)系。同時(shí)，相比于其他研究，本研究除收集病例對照常規(guī)的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征、生理生育指標(biāo)外，還收集了疾病史、臨床病理指標(biāo)、生化指標(biāo)等相關(guān)信息，資料較為全面，能更好地反映環(huán)境、遺傳變異與乳腺癌易感性之間的關(guān)聯(lián)。但另一方面，本研究亦存在一些局限性，例如前期收集得到的健康對照與乳腺癌病例在職業(yè)類型、受教育程度上存在差異導(dǎo)致與這兩個(gè)因素相關(guān)的變量之間亦存在差異，但在分析過程中通過校正排除了這些混雜因素的影響，結(jié)果仍能真實(shí)反映rs1801368基因型與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。另外，由于本研究目前樣本量偏少，加之腫瘤臨床病理特征分組較多，導(dǎo)致如腫瘤最大直徑大于5cm組及腫瘤分子分型為三陰性等部分組別樣本例數(shù)較少，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)效率較低，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量，提高檢驗(yàn)效率。

綜上所述，紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)基因M AD1L1多態(tài)性位點(diǎn)rs1801368堿基突變與女性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，攜帶突變型純合子基因型的女性是乳腺癌的易感人群。通過對社區(qū)人群進(jìn)行該風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)的篩檢進(jìn)而尋找易感人群，有針對性的加強(qiáng)女性對乳腺相關(guān)疾病知識的了解，同時(shí)女性在平時(shí)生活中應(yīng)保持良好的生活習(xí)慣，定期對血糖、血壓、血脂進(jìn)行監(jiān)測，從而預(yù)防乳腺癌的發(fā)生。

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