紅景天提取物對(duì)順鉑致腎細(xì)胞毒性的保護(hù)作用

韓何丹，王海，李艾琳，韓照玉，高麗萍*

（北京聯(lián)合大學(xué)健康與環(huán)境學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100191）

順鉑[cis-dichlorodiamineplatinum(II)，DDP]是以二價(jià)鉑為中心與2個(gè)氯原子和2個(gè)氨基結(jié)合而成的一類(lèi)鉑類(lèi)藥物[1]，是臨床最常用的抗腫瘤藥物之一[2]。DDP在臨床治療過(guò)程中常伴有一定毒副作用[3-4]，如腎毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、心臟毒性和致吐性等，且隨著DDP使用劑量的增加其引起的毒副作用也會(huì)越來(lái)越明顯[5]。其中腎毒性是臨床DDP使用量受限制的主要原因[6-7]。因此，在臨床治療中減輕DDP的腎毒性顯得尤為重要。

有學(xué)者提出，在使用DDP的同時(shí)加入輔助保護(hù)劑以降低DDP引起的腎毒性[2]。眾多研究表明，許多中藥單體化合物對(duì)防治DDP引起的腎毒性有很好的緩解作用。如姜黃素[8]能激活抗氧化反應(yīng)體系防止細(xì)胞凋亡，還能改善線(xiàn)粒體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、清除線(xiàn)粒體內(nèi)自由基，從而降低DDP引起的細(xì)胞氧化損傷。五味子乙素[9]能夠增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，改善線(xiàn)粒體膜的通透性以降低DDP引起的細(xì)胞損傷。低聚葡萄籽原花青素[10]和蕓香苷[11]都能降低DDP誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧族(reaction oxygen species，ROS)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究指出，紅景天提取物(Rhodiola extract，RE)具有抗癌、抗缺氧、抗病毒、抗輻射、抗疲勞、對(duì)中樞神經(jīng)的雙向調(diào)節(jié)、延緩衰老等廣泛的生理活性[12-13]。據(jù)報(bào)道，紅景天提取物可提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活性，可降低脂質(zhì)過(guò)氧化物(lipid peroxide，LPO)的含量，在微粒體模型中具有較好的抗氧化活性[14-15]。有研究表明紅景天苷類(lèi)似物對(duì)缺氧所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用[16]。然而，紅景天提取物對(duì)抗DDP誘導(dǎo)人胚腎細(xì)胞氧化損傷的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題通過(guò)研究RE對(duì)DDP所致HEK293細(xì)胞毒性的保護(hù)作用，探討RE拮抗DDP所致腎細(xì)胞氧化損傷作用的機(jī)制，以期為臨床化療過(guò)程中減輕DDP細(xì)胞毒性提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人胚腎細(xì)胞(HEK293)來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心；DDP注射用粉劑購(gòu)自齊魯制藥公司(無(wú)菌生理鹽水溶解)；紅景天提取物購(gòu)自上海諾德生物實(shí)業(yè)有限公司，含3%紅景天苷，用前需用二甲基亞砜(DMSO)適當(dāng)稀釋?zhuān)^(guò)濾除菌后避光保存；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；DMEM/H培養(yǎng)基、0.25%胰酶、雙抗(100μg/mL鏈霉素，100U/mL青霉素)均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；CCK-8毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為市售分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有15%新生胎牛血清和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱環(huán)境為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、飽和濕度。待細(xì)胞匯合度至80%~90%時(shí)，用胰酶消化，按1∶3進(jìn)行傳代，每隔1天換1次培養(yǎng)基，每2~3d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

1.3.1 DDP對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性作用將100μL(濃度為1×105/mL)的HEK293細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)到匯合狀態(tài)，加入終濃度分別為0、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128mg/L的DDP，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱孵育24h，然后每孔加入100μL含10%CCK-8的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4h，450nm處檢測(cè)吸光度D(450)值，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=D( 4 50 )實(shí)驗(yàn)組/D(450)對(duì)照組×100%

并計(jì)算DDP對(duì)HEK293細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(I C50)，由此確定DDP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞損傷模型的最佳使用濃度。

1.3.2 紅景天提取物作用后HEK293細(xì)胞的存活率處理和計(jì)算方法同上，紅景天提取物終濃度依次為：0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64mg/L。

1.3.3 聯(lián)合作用后對(duì)HEK293細(xì)胞毒性作用的影響將100μL(濃度為1×105個(gè)/mL)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)時(shí)，加藥處理。試驗(yàn)分4組：即正常對(duì)照組(正常細(xì)胞，不做其他處 理 )、 DDP組 (加 入 20mg/L DDP)、 紅 景 天 提 取 物+DDP[在加DDP前2h分別加入不同濃度(2、4、6、8、10、12、14、16mg/L)紅景天提取物孵育細(xì)胞]、陰性對(duì)照組(在加藥時(shí)加入等體積PBS)。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后按1.3.1所述檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.4 HEK293細(xì)胞蛋白濃度測(cè)定及細(xì)胞內(nèi)GSH、SOD、MDA的測(cè)定

細(xì)胞分為4組即正常對(duì)照組(正常細(xì)胞，不做其他處理)、紅景天提取物保護(hù)組(加入12mg/L紅景天提取物)、DDP模型組(加入20mg/L DDP)、紅景天提取物和DDP聯(lián)合處理組(加入12mg/L紅景天提取物和20mg/L DDP)。將2mL(濃度為1×105個(gè)/mL)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)，按照實(shí)驗(yàn)分組加藥處理。繼續(xù)培養(yǎng)24h后除去培養(yǎng)液，PBS洗1遍，每孔加入300μL PBS，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞后，將裝有細(xì)胞懸液的離心管放在冰水浴中，用細(xì)胞破碎儀破碎1min；然后12000r/min離心10min，收集上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞蛋白濃度和MDA、GSH含量以及SOD活力測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以x±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以 α=0.01為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。用Origin9.1軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 DDP對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性作用

見(jiàn)圖1。不同濃度DDP作用于HEK293細(xì)胞24h后，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用。隨著DDP濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，與對(duì)照組比較，1~128mg/L DDP處理組細(xì)胞存活率均顯著降低(P均<0.01)，且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(r=0.85， P=0.002)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得出，DDP對(duì)HEK293的IC50為19.78mg/L，其中，20mg/L是與IC50最為接近的整數(shù)濃度，為提高后續(xù)試驗(yàn)的效率，選擇將其作為后續(xù)建立DDP損傷模型的濃度。

圖1 不同濃度DDP 對(duì) H EK293 細(xì) 胞生長(zhǎng)存活率的影響(n=6)

2.2 紅景天提取物對(duì)HEK293細(xì)胞存活率的影響

見(jiàn)圖2。不同濃度的紅景天提取物作用于HEK293細(xì)胞24h后，對(duì)細(xì)胞存活率有不同程度的影響。在0.5~16mg/L范圍內(nèi)細(xì)胞存活率隨紅景天提取物濃度的增加逐漸升高，且與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。紅景天提取物濃度為16mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率最高，當(dāng)濃度大于16mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率逐漸下降，當(dāng)紅景天提取物濃度為64mg/L時(shí)，可顯著抑制HEK293細(xì)胞的生長(zhǎng)，與正常對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由此說(shuō)明，紅景天提取物對(duì)HEK293細(xì)胞的影響具有“低濃度促進(jìn)，高濃度抑制”的特點(diǎn)。

圖2 不同濃度 R E對(duì) HEK293細(xì)胞存活率的影響(n =6)

2.3 紅景天提取物對(duì)DDP所致HEK293細(xì)胞毒性的影響

見(jiàn)圖3。用終濃度為20mg/L的DDP作用HEK293細(xì)胞24h建立細(xì)胞損傷模型。和DDP組相比，6~16 mg/L紅景天提取物預(yù)處理后，細(xì)胞存活率均明顯升高(P<0.01)，當(dāng)紅景天提取物濃度為12mg/L，細(xì)胞存活率最高，當(dāng)濃度高于12mg/L，紅景天提取物的減毒作用逐漸減小，提示在一定濃度范圍內(nèi)紅景天提取物對(duì)DDP誘發(fā)的HEK293細(xì)胞毒性有顯著的保護(hù)作用。

圖3 不同濃度 R E對(duì) D DP 的 H EK293 細(xì) 胞毒性的影響(n=6)

2.4 紅景天提取物對(duì)DDP作用后的HEK293細(xì)胞內(nèi)GSH、MDA含量和SOD活力的影響

見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，DDP作用下的HEK293細(xì)胞中GSH含量和SOD活性顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)；而RE作用 細(xì) 胞后，GSH、SOD和MDA水平均無(wú)顯著變化(P均>0.05)。經(jīng)RE干預(yù)后，DDP處理24h(即RE+DDP組)，細(xì)胞GSH含量較DDP組顯著升高(P<0.01)，SOD活力也有與GSH類(lèi)似的變化。DDP造成細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯高于對(duì)照組，而RE+DDP組細(xì)胞內(nèi)MDA含量較對(duì)照組顯著升高 (P<0.01)，但較DDP組卻顯著降低(P<0.01)。結(jié)果表明，RE對(duì)DDP造成的細(xì)胞氧化損傷有一定的保護(hù)作用。

表1 RE對(duì)順鉑作用后的HEK293細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響(n=3)

3 討論

DDP作為一種廣譜抗癌藥物，是當(dāng)前臨床醫(yī)學(xué)上最常用和最有效的抗癌藥物之一[17-18]，但同時(shí)引起的嚴(yán)重不良反應(yīng)限制了其用藥劑量和化療應(yīng)用進(jìn)程。DDP進(jìn)入機(jī)體后主要經(jīng)腎臟排泄，因此其腎毒性最為明顯[4]。大量研究結(jié)果表明，DDP對(duì)體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞具有毒性作用。Lieberthal等[19]研究證實(shí)順鉑引起原代培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞死亡(包括凋亡和壞死)，死亡的形式取決于順鉑的濃度。閆長(zhǎng)會(huì)[20]通過(guò)對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)進(jìn)行體外腎毒性研究發(fā)現(xiàn) ， DDP 對(duì)HK-2細(xì)胞具有明顯的毒性作用。在本實(shí)驗(yàn)中，DDP 明顯降低了HEK293細(xì)胞存活率，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。因此，減輕DDP腎毒性改善患者生活質(zhì)量很有必要。

紅景天提取物(RE)作為一種天然活性物質(zhì)，含有多種生物活性成分，主要為黃酮類(lèi)物質(zhì)和苯烷基苷類(lèi)化合物，可消除機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化所產(chǎn)生的自由基，是一種很好的自由基清除劑[21]，具有較強(qiáng)的抗氧化作用[22]。此外，RE可增強(qiáng)中樞膽堿能系統(tǒng)的功能活動(dòng)，促進(jìn)細(xì)胞代謝，增強(qiáng)細(xì)胞活力，從而阻抑細(xì)胞退化、變性和凋亡。文鏡等[23]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn) R E可清除體內(nèi)超氧自由基(O2-.)和羥自由基(·OH)。我們前期研究顯示 R E能有效抑制DDP誘導(dǎo)小鼠睪丸支持細(xì)胞TM4的細(xì)胞損傷[24]。在本實(shí)驗(yàn)中，一定濃度范圍(0.5~16mg/L)內(nèi)RE明顯提高了HEK293細(xì)胞 的 存活率，一定終濃度RE與DDP共同孵育可提高HEK293細(xì)胞存活率，表明RE對(duì)DDP所致HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)具有保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是DDP腎毒性的主要原因。GSH是細(xì)胞防御有毒化合物或氧化應(yīng)激化學(xué)反應(yīng)最重要的分子之一。SOD是一種金屬蛋白，能夠清除機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受超氧化物自由基的損傷，與GSH有相似的功能。因此，檢測(cè)SOD和GSH含量可以反映細(xì)胞的抗氧化能力。有研究表明DDP可通過(guò)結(jié)合GSH而引起機(jī)體內(nèi)GSH含量的嚴(yán)重?fù)p失，同時(shí)還能抑制谷胱甘肽過(guò)氧化物(GSH-Px)、SOD等的活性，從而降低機(jī)體的抗氧化能力[25]。Shah等[26]將體外血漿和細(xì)胞組分中的GSH進(jìn)行不同濃度DDP處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSH濃度呈明顯下降趨勢(shì)?？赏茢啵珼DP治療很可能引起血液中GSH水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體的抗氧化能力下降。Naziroglu等[27]研究表明DDP對(duì)腎臟中SOD、GSH-Px和過(guò)氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶系統(tǒng)具有抑制作用。本研究結(jié)果表明，DDP組GSH和SOD的含量明顯低于對(duì)照組，DDP誘發(fā)產(chǎn)生的自由基明顯超出了HEK293細(xì)胞的自身清除能力，最終引起機(jī)體腎臟的氧化損傷。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的一種重要代謝產(chǎn)物，MDA的含量可以直接反映細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，從而間接反映了細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果表明，DDP組MDA的含量遠(yuǎn)高于對(duì)照組，提示細(xì)胞內(nèi)的GSH被DDP耗竭，降低了機(jī)體清除自由基的能力，從而引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。該結(jié)果與許晗等[28]的研究結(jié)果一致。經(jīng)12mg/L的RE干預(yù)后，相對(duì)于DDP模型組，HEK293細(xì)胞存活率、細(xì)胞SOD活力和GSH含量明顯提高(P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.01)，提示紅景天提取物能夠清除超氧化物陰離子等自由基，減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減輕DDP引起的氧化應(yīng)激，從而拮抗DDP腎毒性。

綜上，紅景天提取物能在一定濃度范圍內(nèi)提高細(xì)胞存活率，可拮抗順鉑導(dǎo)致的HEK293細(xì)胞氧化損傷，提示紅景天提取物對(duì)順鉑致腎細(xì)胞毒性具有明顯的保護(hù)作用。

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