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    QHF復(fù)方對(duì)人肝癌Huh7細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲及腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)的影響

    2018-06-21 01:13:12劉丹焦良波張文王心怡陳濤胡衛(wèi)
    癌變·畸變·突變 2018年3期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞周期復(fù)方溶劑

    劉丹,焦良波,張文,王心怡,陳濤,胡衛(wèi),*

    (1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理/腫瘤科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,湖北宜昌443002;2.三峽大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院,湖北宜昌443002;3.宜昌市第二人民醫(yī)院,湖北宜昌443002)

    原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,雖然近年來(lái)各種療法層出不窮,但由于肝癌的高轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率,其5年生存率極低[1]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)學(xué)說(shuō)認(rèn)為 , CSCs是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥性的關(guān)鍵所在[2-3]。因此,針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的治療有望成為根除肝癌的有效治療方法之一。近年來(lái)中醫(yī)藥以其獨(dú)特的辨證論治理論和“治未病”的防治特點(diǎn),在控制腫瘤轉(zhuǎn)移方面已凸顯其優(yōu)勢(shì)[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)中藥QHF復(fù)方能抑制肝癌細(xì)胞的增殖,并能明顯抑制肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[5],但對(duì)于QHF復(fù)方抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制尚不清楚,故本實(shí)驗(yàn)將在細(xì)胞水平上探討QHF復(fù)方對(duì)Huh7細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、侵襲及肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物的影響,以期為探討QHF復(fù)方防治肝癌提供新的思路與方法。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料

    人肝癌Huh7細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。華蟾素注射液購(gòu)自安徽金蟾生化股份有限公司;人參皂苷Rg3標(biāo)準(zhǔn)品和胰蛋白酶均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;香菇多糖購(gòu)自南京澤朗植提技術(shù)有限公司;注射用血塞通(凍干)購(gòu)自昆明制藥集團(tuán)股份有限公司;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 QHF復(fù)方配制參考文獻(xiàn)[5],將華蟾素、人參皂苷Rg3、三七總皂苷、香菇多糖按一定的比例進(jìn)行配制。

    1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分為溶劑對(duì)照組(細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)加入不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基)、陽(yáng)性對(duì)照組[加入2.5μg/mL順鉑(DDP,用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配制)]和QHF復(fù)方處理的實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入不同濃度(20、40、80、160、320μg/mL,用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配制)的QHF復(fù)方懸液100μL,培養(yǎng)24、48、72h,藥物作用終止前4h,于每孔中各加入5 mg/mLMTT20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基,每孔加入150μL DMSO,搖床上振蕩10min,使紫色結(jié)晶充分溶解。于酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔 光 密度D(570)值。按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率。

    細(xì)胞增殖抑制率=[溶劑對(duì)照組 D (570)值-實(shí)驗(yàn)組 D (570)值]/[溶劑對(duì)照組 D(570)值-空白組 D(570)值]×100%

    1.2.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)溶劑對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組給藥方法同前,實(shí)驗(yàn)組選用QHF 復(fù)方的80μg/mL用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取饑餓4h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用含0.2%胎牛血清蛋白(BSA)的無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,取100 μL(7×104/mL)細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室中,各組加藥100μL。下室中加入600μL含10%B S A的DMEM高糖培養(yǎng)基,24h后,吸棄小室內(nèi)的培養(yǎng)基,用棉簽輕輕擦去膜內(nèi)表面的細(xì)胞,4%多聚甲醛固定1h,結(jié)晶紫染色30min,清水沖洗,揭下濾膜,放在載玻片上于200倍光鏡下觀察濾膜外的細(xì)胞,隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算平均值。

    1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分組及給藥劑量同1.2.3。取生長(zhǎng)相近并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,各組細(xì)胞給藥培養(yǎng)48h后,胰酶消化制成單細(xì)胞懸液,離心棄上清,PBS洗滌并用冰乙醇固定后用預(yù)冷的PBS漂洗離心,使用10μL RNA酶(10g/L)處理后,加入熒光染料溴化丙錠溶液490μL,避光染色30min,300目尼龍膜過(guò)濾后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

    1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)細(xì)胞分組及前期處理同1.2.4,各組細(xì)胞給藥培養(yǎng)48h后,用不含EDTA的胰酶消化制成單細(xì)胞懸液,離心棄上清,加入100μL結(jié)合緩沖液和FITC標(biāo)記的Annexin-V(20μg/mL)10μL,室溫避光30 min,再加入PI(50μg/mL)5μL,避光反應(yīng)5min后,加入400μL結(jié)合緩沖液,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

    1.2.6 細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133和CD44的檢測(cè)細(xì)胞分組及前期處理同1.2.4,各組細(xì)胞給藥培養(yǎng)48h后,胰酶消化制成單細(xì)胞懸液,離心后棄上清,80μL PBS懸浮,加入藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗體10μL,室溫暗處孵育30min。加FcR阻斷劑20μL,緩沖液80μL,充分混合后避光,4℃放置10min,PBS洗滌,重懸,離心去上清,加500μL PBS重懸細(xì)胞,上機(jī)分析細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133和CD44的表達(dá)情況。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次, 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析。以α =0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

    2 結(jié)果

    2.1 QHF復(fù)方對(duì)Huh7細(xì)胞增殖的影響

    與DDP組比較,不同濃度(20、40、80、160和320 μg/mL)QHF復(fù)方在各時(shí)間點(diǎn)均能抑制Huh7細(xì)胞增殖,且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng),但抑制作用均低于DDP組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。根據(jù)QHF復(fù)方對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性,且在QHF為 8 0μg/mL時(shí),作用效率更強(qiáng),故選用QHF復(fù)方的80 μg/mL用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    表1 QHF 復(fù) 方對(duì)人肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞增殖抑制率的影響(%,-x±s)

    2.2 QHF復(fù)方對(duì)Huh7細(xì)胞侵襲的影響

    80μg/mL QHF組和DDP組(陽(yáng)性對(duì)照組)穿透濾膜進(jìn)入下室的Huh7細(xì)胞數(shù)目均低于溶劑對(duì)照組,且QHF組細(xì)胞數(shù)目低于DDP組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖1。

    圖1 QHF 復(fù) 方對(duì)人肝癌 H uh7細(xì)胞侵襲能力的影響

    2.3 QHF復(fù)方對(duì)Huh7細(xì)胞周期的影響

    與溶劑對(duì)照組比較,陽(yáng)性對(duì)照DDP組和80μg/mL QHF組G0/G1期的細(xì)胞比例均減少,S期的比例均增加,DDP組G2/M期的細(xì)胞比例明顯增多而QHF組G2/M期的比例減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn) 圖 2 和表2。

    圖2 QHF復(fù)方對(duì)人肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞周期的影響

    表2 QHF復(fù)方對(duì)人肝癌細(xì)胞系 H uh7細(xì)胞周期的影響(%,-x±s)

    2.4 QHF復(fù)方對(duì)Huh7細(xì)胞凋亡的影響

    與溶劑對(duì)照組比較,QHF組和DDP組凋亡細(xì)胞比例明顯增高,且QHF組細(xì)胞凋亡比例明顯高于DDP組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖3和表3。

    2.5 QHF復(fù)方對(duì)Huh7細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133和CD44表達(dá)的影響

    流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表 3,QHF組表達(dá)CD133+和CD44+細(xì)胞比例較溶劑對(duì)照組明顯降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);陽(yáng)性對(duì)照DDP組表達(dá)CD133+和CD44+細(xì)胞比例與溶劑對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    圖3 QHF復(fù)方對(duì)人肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞凋亡的影響

    表3 QH-F 復(fù) 方對(duì)人肝癌細(xì)胞系 H uh7 細(xì) 胞凋亡率和 C D133、 C D44表達(dá)的影響(x± s)

    3 討論

    CSCs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和放化療抗性中發(fā)揮著十分重要的作用。Reya等[6]提出的“腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)”認(rèn)為:在腫瘤組織中存在一種數(shù)量較少的干細(xì)胞樣癌細(xì)胞亞群,具有癌細(xì)胞和干細(xì)胞的特性,是腫瘤形成的起始細(xì)胞,在腫瘤形成、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起決定作用,這種細(xì)胞稱(chēng)為腫瘤干細(xì)胞。隨后的研究表明肝癌中也存在肝癌干細(xì)胞(liver cancer stem cells,LCSCs),而且肝癌的高復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移性與LCSCs有關(guān)[7-8]。目前發(fā)現(xiàn)CSCs表面標(biāo)記物有CD133、CD24、CD44、CD166和EpCAM等,其中CD133、CD44是最常見(jiàn)的標(biāo)記物[9-10]。CD133是一種跨膜糖蛋白,是經(jīng)典的CSCs標(biāo)志分子,表達(dá)CD133+的肝細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特征:即高克隆性、成瘤性及對(duì)放化療的抗性[11]。另有研究顯示,肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)、預(yù)后不良與CD133+細(xì)胞表達(dá)密切相關(guān)[12]。Song等[13]實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)CD133在肝癌治療中發(fā)揮核心作用。CD44是一種細(xì)胞表面蛋白,最先被認(rèn)為是淋巴細(xì)胞受體[14],也是透明質(zhì)酸的主要表面受體[15],不少研究結(jié)果顯示CD44能調(diào)節(jié)或加強(qiáng)抗凋亡蛋白作用而在CSCs中具有重要意義[16]。

    課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)QHF復(fù)方能顯著提高肝癌H22荷瘤小鼠的生存期[17],可抑制肝癌HepG2細(xì)胞遷移、侵襲能力及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達(dá)[18],但對(duì)于該復(fù)方是否是通過(guò)下調(diào)肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗肝癌作用的尚不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)選用高表達(dá)CD133的人肝癌Huh7細(xì)胞[13,19]為研究對(duì)象,初步探討QHF復(fù)方對(duì)肝癌干細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示,QHF復(fù)方能抑制人肝癌Huh7細(xì)胞的增殖、侵襲,使細(xì)胞周期阻滯在S期,并促進(jìn)Huh7細(xì)胞的凋亡,顯著下調(diào)肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133和CD44的表達(dá),使CD133+和CD44+細(xì)胞比例明顯降低。這些結(jié)果提示QHF復(fù)方能夠影響人肝癌Huh7細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲,這種抑制作用可能是由于QHF復(fù)方對(duì)腫瘤干細(xì)胞具有抑制作用,但是也不排除腫瘤干細(xì)胞分化成了其他細(xì)胞,或者只是抑制了CD133和CD44的表達(dá)。因此,下一步擬分離出CD133+和CD44+肝癌干細(xì)胞,進(jìn)一步研究該復(fù)方對(duì)干細(xì)胞活性(如增殖、耐藥、體內(nèi)成瘤等方面)的影響,探究QHF復(fù)方可能的抗肝癌干細(xì)胞的作用機(jī)制。

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