1例遺傳性凝血因子V缺乏癥家系的基因分析

梁楓萍,程 鵬

(1.廣西壯族自治區(qū)玉林市第一人民醫(yī)院腫瘤血液科 537000; 2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科,南寧 530021)

遺傳性凝血因子V(FV)缺乏癥是一種罕見出血性疾病，由FV結(jié)構(gòu)或功能缺陷導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳性疾病。本研究通過凝血功能及FV活性的檢測，確診了1例FV缺乏癥患者，并對其家系成員的FV基因進(jìn)行測序，以尋找致病突變基因，探討其發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 先證者，男，33歲，廣西賓陽人，漢族，自幼無異常出血表現(xiàn)，2014年因不育癥就診。查體：無陽性體征。實(shí)驗(yàn)室檢查：凝血酶原時(shí)間(PT)38.7 s、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)133.3 s ；凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原(FIB)正常；FV促凝活性(FV∶C) 0.6%，其他凝血因子活性正常；血常規(guī)、肝功能正常。先證者父母，廣西賓陽人，非近親婚配；對先證者的直系家系成員包括先證者父親、母親、妹妹均進(jìn)行凝血功能及基因檢測。家系成員中無皮膚、牙齦出血或外傷后出血不止等出血及出血傾向，家系成員血常規(guī)、肝功能均正常，未曾使用抗凝劑。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并征得先證者及其家系成員知情同意。家系圖見圖1。

圖1 遺傳性凝血因子Ⅴ家系圖

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)儀器 PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(東勝龍)，3130xl測序列分析儀(美國ABI公司)，DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，DYCP-31E型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一)，YXJ-2離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，H6-1微型電泳槽(上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠)，凝膠成像系統(tǒng)(美國Gene Genius公司)，移液器(范圍100～1 000 μL，20～200 μL，0.5～10 μL)(德國Eppendorf公司)。

1.2.2主要試劑 Phusion Hot Start Ⅱ High-Fidelity DNA Polymerase(美國Thermo公司F-549S)；Marker、6×DNA Loading Dye(上海生工生物技術(shù)有限公司)；PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(上海生工生物技術(shù)有限公司SK1141)；10×TAE(400 mmol/L Tris-acetate and 10 mmol/L EDTA，pH 8.0)。

1.2.3標(biāo)本采集和處理 所有研究對象抽取外周靜脈血4 mL，EDTA抗凝，標(biāo)本分2份，分別用于凝血功能分析及DNA提取。DNA提取后進(jìn)行濃度和純度測定，將DNA分裝并凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4凝血功能分析 對先證者及家系成員進(jìn)行PT、APTT、FⅡ∶C、FV∶C、FⅦ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅩ∶C、FⅪ∶C、FⅫ∶C測定。

1.2.5引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì)了30對引物(表1)，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 PCR引物序列表

續(xù)表1 PCR引物序列表

1.2.6PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)系為20 μL，包括10 μL PCR Mix ，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，超純水7 μL。在DNA熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性30 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)35次，最后72 ℃再延伸5～8 min。取PCR產(chǎn)物5 μL上樣于1.8%瓊脂糖凝膠，1×TBE緩沖液中100 mV電壓電泳30 min后，將凝膠置于數(shù)字化凝膠成像分析儀內(nèi)拍照分析。

表2 遺傳性凝血因子V缺乏癥家系成員凝血指標(biāo)檢測結(jié)果

1.2.7PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化及測序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，嚴(yán)格按純化試劑盒說明書操作，純化產(chǎn)物進(jìn)行直接測序。以美國NCBI基因庫公布的序列AY364535為標(biāo)準(zhǔn)，采用Chroma軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析比對，尋找基因變異位點(diǎn)。變異位點(diǎn)與NCBI中的SNP數(shù)據(jù)庫比對，確定是否存在人群基因多態(tài)性。最后對異常測序結(jié)果重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增及正向、反向測序，進(jìn)一步確定基因突變。

2 結(jié) 果

2.1凝血功能檢測結(jié)果 先證者及其妹妹APTT、PT明顯延長，先證者FⅤ∶C 0.6%，妹妹FⅤ∶C 0.3%，母親FⅤ∶C 27.4%；先證者及其家系成員FⅡ∶C、FⅦ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅩ∶C、FⅪ∶C、FⅫ∶C均在正常范圍內(nèi),見表2。

2.2測序結(jié)果 先證者FⅤ基因存在1個(gè)雜合錯(cuò)義突變G16088C(Asp68His)；8個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)突變，雜合錯(cuò)義突變A38529G(Arg485Lys)，純合錯(cuò)義突變A58668G(Met1736Val)、A45888G(Lys830Arg)、A45909G(His837Arg)、A46088G(Lys897Glu)、純合同義突變C45523T(Ile708Ile)、T45550C(Asn717Asn)、A45616G (Ser739Ser)；先證者妹妹的基因型與先證者完全一致；先證者父親不存在雜合錯(cuò)義突變G16088C(Asp68His)，8個(gè)SNP位點(diǎn)均為雜合突變。先證者母親存在雜合錯(cuò)義突變G16088C(Asp68His)，8個(gè)SNP位點(diǎn)均為雜合突變。這些SNP位點(diǎn)與NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫記錄的相一致，見表3、圖2～5。

表3 先證者及其家系成員FⅤ基因突變位點(diǎn)

核苷酸位點(diǎn)參照Genbank序列，AY364535；+：純合突變；±：雜合突變；-：無突變

箭頭示存在G16088C雜合子突變

圖2先證者第3外顯子正向測序結(jié)果

箭頭示存在G16088C雜合子突變

圖3先證者妹妹第3外顯子正向測序結(jié)果

箭頭示存在G16088C雜合子突變

圖4先證者母親第3外顯子正向測序結(jié)果

箭頭示相同位點(diǎn)與野生型一致

圖5先證者父親第3外顯子正向測序結(jié)果

3 討 論

FⅤ缺乏癥是由FⅤ結(jié)構(gòu)或功能缺陷導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳性疾病?；颊叱１憩F(xiàn)為皮膚黏膜出血、月經(jīng)過多、創(chuàng)傷出血不止，但肌肉和關(guān)節(jié)出血少見，顱腦出血更是罕見[2]。凝血篩查實(shí)驗(yàn)PT、APTT延長，即刻及孵育APTT糾正實(shí)驗(yàn)可排除狼瘡抗凝物及FⅧ因子抗體，進(jìn)一步行FⅤ∶C測定具有診斷意義。基因分析一般在臨床研究中進(jìn)行，且由于傳統(tǒng)基因測序技術(shù)的局限性，5%～10%患者的基因突變無法檢測出來[3]，因此FⅤ∶C輕度下降的雜合突變患者，明確診斷仍面臨著挑戰(zhàn)。FⅤ缺乏癥分為兩型:Ⅰ型是FⅤ抗原(FⅤ∶Ag)和FⅤ∶C同步下降;Ⅱ型是FⅤ蛋白異常所致,呈FⅤ∶Ag正常而FⅤ∶C降低，或者FⅤ∶Ag和FⅤ∶C下降不平行。

成熟的FⅤ由2 196個(gè)氨基酸構(gòu)成，分為5個(gè)功能區(qū)，即A1-A2-B-A3-C1-C2。活化的FⅤ(FⅤa)是異二聚體，重鏈區(qū)包括A1、A2及NH2端，輕鏈區(qū)包括A3、C1、C2及羧基端，通過二價(jià)金屬離子(2個(gè)Ca2+和一個(gè)Cu2+)非共價(jià)聯(lián)結(jié)[4-6]。編碼人類FⅤ的基因定位于1 號染色體q24.2，含25個(gè)外顯子及24個(gè)內(nèi)含子。第1～12外顯子編碼信號肽和A1-A2區(qū),第13外顯子編碼B區(qū),14～25外顯子編碼A3、C1和C2區(qū)。

目前已發(fā)現(xiàn)了約160種與FⅤ缺乏癥有關(guān)的基因突變，包括無義突變、錯(cuò)義突變、刪除、插入、剪切位點(diǎn)突變。錯(cuò)義突變通常引起單個(gè)氨基酸置換，影響了FⅤ的折疊和構(gòu)象改變，分泌途徑的質(zhì)量控制系統(tǒng)將其滯留在細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)降解和分泌障礙[7]，這是大部分錯(cuò)義突變導(dǎo)致FⅤ∶Ag和FⅤ∶C同步降低的Ⅰ型FⅤ缺乏癥的機(jī)制。少數(shù)錯(cuò)義突變(His147Arg、Tyr91Asn、Ala221Val和His147Arg)[8-9]，影響了二價(jià)金屬離子Cu2+的結(jié)合位點(diǎn)[9]、A1-A2-A3結(jié)構(gòu)域的相互作用，導(dǎo)致了輕鏈和重鏈的相對分離，影響了FⅤa的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致FⅤ∶Ag和FⅤ∶C非同步下降的Ⅱ型FⅤ缺乏癥。雖然大部分的錯(cuò)義突變位于A2和C2結(jié)構(gòu)域，但越來越多發(fā)生在A1結(jié)構(gòu)域的錯(cuò)義突變被證實(shí)[10]。A1結(jié)構(gòu)域是FⅤa和活化的FⅩ(FⅩa)相互反應(yīng)的重要區(qū)域，此外，A1結(jié)構(gòu)域存在重鏈與二價(jià)金屬離子Ca2+相互作用的位點(diǎn)，影響著FⅤa的輕鏈和重鏈的相互聯(lián)結(jié)[11]。因此，發(fā)生在A1結(jié)構(gòu)域的突變不僅導(dǎo)致Ⅰ型FⅤ缺乏癥，也導(dǎo)致Ⅱ型FⅤ缺乏癥[12-13]。

曹麗娟等[1]通過分子建模分析發(fā)現(xiàn)，Asp68His突變發(fā)生后，維持A1區(qū)β片層結(jié)構(gòu)的氫鍵及分子表面范德華力發(fā)生偏移，降低了分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而影響FⅤ-Asp68His突變蛋白的折疊、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌。

2014年臺灣國立成功大學(xué)的學(xué)者對FⅤ-Asp68His蛋白進(jìn)行了體外表達(dá)研究證實(shí)，Asp68His突變導(dǎo)致了FⅤ分泌障礙，且FⅤ細(xì)胞內(nèi)降解增強(qiáng)，從而引起FⅤ∶Ag和FⅤ∶C同步下降[14]。

本研究中，先證者自幼無異常出血表現(xiàn)，因不育癥就診檢查發(fā)現(xiàn)PT 38.7 s、APTT 133.3 s，F(xiàn)Ⅴ∶C僅0.6%，排除了肝病等獲得性因素導(dǎo)致的FⅤ∶C減低，且先證者母親和妹妹FⅤ∶C均降低，臨床診斷FⅤ缺乏癥明確?；驕y序結(jié)果顯示先證者及其母親、妹妹均存在雜合錯(cuò)義突變G16088C(Asp68His)，家系分析表明先證者母親及妹妹均是Asp68His雜合錯(cuò)義突變(圖2、3、4)，而父親相同位點(diǎn)與野生型一致(圖5)，提示該突變遺傳自母親，因此，基因水平診斷FⅤ缺乏癥明確。Asp68His突變是本研究中先證者及其妹妹、母親FⅤ∶C下降的主要原因。

先證者及其母親、妹妹基因突變類型均為雜合錯(cuò)義突變，但三者的FⅤ∶C差異較大。對目前文獻(xiàn)報(bào)道的Asp68His突變FⅤ缺乏癥家系數(shù)據(jù)分析也發(fā)現(xiàn)FⅤ∶C水平的差異[1，15]，4個(gè)Asp68His雜合子的FⅤ∶C波動在45%～63%，1個(gè)Asp68His純合子突變的FⅤ∶C 5%，提示純合子突變患者的FⅤ∶C較雜合子突變下降明顯。本研究的先證者和其母親、妹妹都是Asp68His突變雜合子，但FⅤ∶C下降明顯，與文獻(xiàn)報(bào)道不一致，提示有其他的因素影響著FⅤ∶C。2010年黃丹丹等[16]報(bào)道的FⅤ缺乏癥患者證實(shí)是Asp68His雜合錯(cuò)義突變，其FⅤ∶C 5%，其基因分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)了位于同一條染色體上的4個(gè)SNP，分別導(dǎo)致了Met413Thr、His1327Arg、Metl764Val和Asp2222Gly突變，其研究結(jié)果認(rèn)為，Asp68His雜合錯(cuò)義突變和4個(gè)SNP共同導(dǎo)致了FⅤ∶C水平下降。YAMAZAKI等[17]的體外表達(dá)研究證實(shí)這4個(gè)多態(tài)性(Met413Thr、His1327Arg、Metl764Val和Asp2222Gly)同時(shí)存在時(shí)，F(xiàn)Ⅴ的表達(dá)水平比野生型顯著降低，約為野生型的20%，其原因是蛋白質(zhì)合成率明顯降低并伴分泌障礙，其中Asp2222Gly是造成分泌障礙的關(guān)鍵因素。本研究的基因分析結(jié)果顯示，先證者及其妹妹存在4個(gè)純合錯(cuò)義突變多態(tài)性(Met1736Val、Lys830Arg、His837Arg、Lys897Glu)和1個(gè)雜合錯(cuò)義突變多態(tài)性(Arg485Lys)，先證者母親存在這5個(gè)SNP的雜合形式，據(jù)此推斷，這5個(gè)SNP的存在影響了FⅤ∶C水平。此外，先證者及其母親、妹妹均存在同義突變C45523T(Ile708Ile)、T45550C (Asn717Asn)、A45616G (Ser739Ser)，突變并未引起編碼氨基酸改變，對FⅤ∶C無影響。

總之，Asp68His突變是導(dǎo)致先證者及其母親、妹妹FⅤ∶C下降的主要原因，Arg485Lys 、Met1736Val、Lys830Arg、His837Arg、Lys897Glu 5種SNP的存在可能影響著FⅤ∶C。這5種SNP下調(diào)FⅤ∶C水平的具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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