金銀花葉黃酮體外抗氧化能力及對H2O2誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

羅 磊，張冰潔，馬麗蘋，樊金玲，朱文學(xué)，關(guān)寧寧，薛依涵

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023）

細(xì)胞在新陳代謝過程中會產(chǎn)生自由基，這些自由基影響著體內(nèi)調(diào)控系統(tǒng)，自由基過多便會氧化細(xì)胞膜、酶、DNA及蛋白質(zhì)等物質(zhì)，對機(jī)體造成損傷[1]。此外，研究表明，自由基與癌癥、衰老、炎癥，心腦血管等多種疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[2]。因此，具有清除自由基作用的食品及藥品的研究日趨受到人們的重視。近年來，中藥被認(rèn)為是“天然自由基清除劑”，并對其開展了各種清除自由基的實(shí)驗(yàn)研究[3]。

金銀花（Lonicera japonica Thunb.）為藥食同源性植物，具有清熱解毒、抗炎、抗病原微生物、免疫調(diào)節(jié)等功效[4-5]，其葉具有產(chǎn)量大，生物活性成分豐富，抗氧化、抑菌功效較好等優(yōu)點(diǎn)，但長期被作為金銀花的副產(chǎn)物而被丟棄，造成了資源浪費(fèi)[6-8]。有研究顯示，金銀花葉中黃酮含量是花中的2.78 倍，且金銀花葉的抑菌能力與花相同甚至高于花[9]。翟鳳艷等[10]研究顯示，金銀花葉提取物對植物真菌的抑菌效果較強(qiáng)。文獻(xiàn)[11-13]報(bào)道金銀花葉粗黃酮具有良好的抗氧化活性。但以上研究都是采用單一的方法對金銀花葉粗提物進(jìn)行功效方面的評價(jià)，而對金銀花葉黃酮純化物的功效作用研究較少。此外，由于不同評價(jià)方式及其適用范圍的不同使實(shí)驗(yàn)結(jié)果也存在差異。

為系統(tǒng)準(zhǔn)確地評價(jià)金銀花葉黃酮的抗氧化活性，深入了解其功效機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)以VC為對照，既采用了較為廣泛的體外抗氧化評價(jià)方法，又建立了H2O2誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞損傷模型，以評價(jià)金銀花葉黃酮的體外及細(xì)胞抗氧化抗炎能力，探索其作用機(jī)理，為金銀花葉功能性食品開發(fā)及抗氧化抗炎藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花葉黃酮由本實(shí)驗(yàn)室以金銀花葉為原料，采用超聲輔助乙醇提取，經(jīng)NKA-Ⅱ大孔吸附樹脂純化所得。

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 南京科佰生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國Hyclone公司；胎牛血清、胰酶、雙抗（青霉素-鏈霉素） 美國Gibco公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）美國Sigma公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

680全自動酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；CKX41倒置顯微鏡 日本Olympus公司；E191IR型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國金西盟公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；UV2400紫外-可見分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HL-2D型恒流泵 上海圣科儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金銀花葉黃酮的制備

1.3.1.1 金銀花葉黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取金銀花葉粉末100 g，石油醚脫脂處理1 h，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇按料液比1∶65（m/V）的比例混合均勻，于超聲功率250 W，提取溫度46 ℃的條件下超聲提取30 min，抽濾，45 ℃下減壓濃縮至無醇味，真空冷凍干燥成粉，備用。

1.3.1.2 金銀花葉黃酮的純化

預(yù)處理NKA-Ⅱ樹脂，將1.3.1.1節(jié)中所得金銀花葉黃酮配制成2.17 mg/mL的上樣液，調(diào)節(jié)其pH 2.82左右，以1.96 BV/h左右的流速上NKA-Ⅱ樹脂柱進(jìn)行純化，先用2.0 BV蒸餾水以2.0 BV/h左右的流速洗脫以除雜，再用體積分?jǐn)?shù)75.36%的乙醇溶液以1.47 BV/h左右的流速洗脫，收集乙醇洗脫液，旋蒸，凍干后置于4 ℃保存，備用。本實(shí)驗(yàn)中，金銀花葉黃酮經(jīng)純化后純度為（79.820±0.474）%。

1.3.2 金銀花葉黃酮總還原能力的測定

采用鐵氰化鉀法[14]進(jìn)行總還原力的測定。量取0.4 mL不同質(zhì)量濃度（0.015 6～8.000 0 mg/mL）的樣品溶液，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的K3Fe(CN)6溶液，混勻后在50℃水浴中暗處反應(yīng)20 min，快速置于冰水中冷卻。再加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸溶液，混勻，3 000 r/min離心10 min。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的FeCl3溶液0.5 mL，混勻后靜置10 min，于700 nm波長處測定其吸光度，吸光度越大表明還原力越大。用蒸餾水代替樣品作為空白，VC作為陽性對照，平行做3 次。

1.3.3 金銀花葉黃酮對·OH的清除作用

參考Lai Furao等[15]的方法，并稍作修改。配制不同質(zhì)量濃度（0.015 6～4.000 0 mg/mL）的金銀花葉黃酮樣品液，分別吸取2 mL上述樣品液，依次添加6 mmol/L的FeSO4溶液0.6 mL、6 mmol/L的H2O2溶液0.6 mL，混勻靜置10 min后加入0.6 mL 6 mmol/L水楊酸，搖勻靜置10 min，于510 nm波長處測定其吸光度A1；同時(shí)測定用無水乙醇代替水楊酸時(shí)的吸光度A2及用蒸餾水代替樣品液時(shí)的吸光度A0，以VC為陽性對照，平行做3 組取平均值。羥自由基（·OH）清除率根據(jù)公式（1）計(jì)算。

1.3.4 金銀花葉黃酮對·的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化法[16]進(jìn)行測定，分別取pH 8.2 Tris-HCl緩沖液4.0 mL于25 ℃水浴20 min，加入不同質(zhì)量濃度（0.015 6～8.000 0 mg/mL）的金銀花葉黃酮樣品液0.5 mL及25 ℃預(yù)熱的3 mmol/L鄰苯三酚（10 mmol/L HCl配制）1.0 mL，混勻后25 ℃水浴4 min，隨即加入0.5 mL HCl（8 mol/L）終止反應(yīng)，于320 nm波長處測定吸光度A1；同時(shí)測定用10 mmol/L HCl溶液代替鄰苯三酚時(shí)的吸光度A2及用蒸餾水代替樣品液時(shí)的吸光度A0，以VC作陽性對照，平行做3 組取平均值。超氧陰離子自由基（O2-·）清除率根據(jù)公式（1）計(jì)算。

1.3.5 金銀花葉黃酮對DPPH自由基的清除作用

參照Goupy等[17]的方法并稍作修改，分別吸取不同質(zhì)量濃度（0.015 6～8.000 0 mg/mL）金銀花葉黃酮的無水乙醇溶液2.0 mL，加入2.0 mL 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）（2×10-4mol/L）的無水乙醇溶液，搖勻，避光反應(yīng)40 min后，以無水乙醇調(diào)零，于517 nm波長處測定吸光度A1；同時(shí)，測定2.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與2.0 mL無水乙醇的混合液在517 nm波長處吸光度A2；再測2.0 mL空白樣品（蒸餾水）與2.0 mL DPPH的混合液在517 nm波長處的吸光度A0。以VC作為陽性對照，重復(fù)3 組取平均值。清除率計(jì)算見式（1）。

1.3.6 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)

將RAW264.7細(xì)胞接種于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[18]。每隔2～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.3.7 H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷模型的建立

取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔200 mL，細(xì)胞濃度為2.0×105個(gè)/mL。在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁，棄上清液，加入用RPMI-1640培養(yǎng)基配制的不同濃度的H2O2溶液，每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄上清液，用PBS洗滌2 次后，每孔分別加入200 mL的培養(yǎng)基及10 mL 5 mg/mL MTT，放入培養(yǎng)箱4 h后停止培養(yǎng)，棄上清液，每孔加入150 mL DMSO，輕微振蕩10 min使紫色結(jié)晶溶解，放入酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定吸光度，根據(jù)公式（2）計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中：A0為空白組的平均吸光度；A1為特定濃度樣品液組的平均吸光度。

1.3.8 金銀花葉黃酮劑量的篩選

細(xì)胞培養(yǎng)過程同1.3.7節(jié)，僅將1.3.7節(jié)中所加入的RPMI-1640培養(yǎng)基配制的H2O2溶液換為同種培養(yǎng)基配制的不同質(zhì)量濃度的金銀花葉黃酮溶液，并通過公式（2）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.9 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA、GSH含量、SOD、LDH活力的測定

將細(xì)胞濃度為2.0×105個(gè)/mL的RAW264.7細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔2.0 mL，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁，吸棄上清液?？瞻捉M和模型組加入2.0 mL培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)組分別加入2.0 mL不同質(zhì)量濃度的金銀花葉黃酮培養(yǎng)液；對照組加入2.0 mL 250 mg/mL VC培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄上清液，每孔加入750 mmol/L的H2O2溶液2.0 mL，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h后將細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液分離。細(xì)胞培養(yǎng)液于4 ℃、1 500 r/min離心5 min后取上清液待測；細(xì)胞用PBS清洗2 次后于4 ℃、1 000 r/min離心10 min留細(xì)胞團(tuán)塊，加入0.5 mL的PBS，冰水浴條件下超聲破碎（300 W，3～5 s/次，間隔30 s，重復(fù)3 次），待測。所需測定的MDA、GSH含量及SOD、LDH活力參照相應(yīng)試劑盒方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用DPS 7.5統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，測定結(jié)果以表示，采用單因素方差分析并用LSD法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花葉黃酮體外抗氧化活力

2.1.1 總還原力

圖1 金銀花葉黃酮的總還原力Fig. 1 Reducing power of flavonoids from honeysuckle leaves

樣品中的黃酮會使反應(yīng)體系中的Fe3+還原成Fe2+，在700 nm波長處吸光度變化反應(yīng)出還原能力的高低，吸光度越高說明還原能力越強(qiáng)[19]。由圖1可知，隨樣品質(zhì)量濃度的增加，VC和金銀花葉黃酮的還原力逐漸加強(qiáng)，并成劑量依賴關(guān)系。VC的吸光度在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值5.21，之后保持不變；金銀花葉黃酮的還原力在0.015 6～4.000 0 mg/mL范圍內(nèi)顯著小于VC（P＜0.05）。當(dāng)質(zhì)量濃度為4.000 0 mg/mL時(shí)，VC和金銀花葉黃酮吸光度均達(dá)到最大，差異不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，金銀花葉黃酮在低質(zhì)量濃度時(shí)還原能力不強(qiáng)，而質(zhì)量濃度大于4.000 0 mg/mL時(shí)，其還原能力較強(qiáng)，等同于VC。

2.1.2 ·OH清除能力

圖2 金銀花葉黃酮對·OH的清除作用Fig. 2 Scavenging effect of flavonoids from honeysuckle leaves on hydroxyl free radicals

如圖2所示，在0.015 6～4.000 0 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，VC和金銀花葉黃酮對·OH的清除率與質(zhì)量濃度存在明顯的量效關(guān)系。隨著樣品質(zhì)量濃度的增大，·OH的清除能力也隨之增大，且金銀花葉黃酮和VC對DPPH自由基的清除能力相近，差異不顯著（P＞0.05）。VC抗氧化能力的IC50值為0.116 0 mg/mL，金銀花葉黃酮的IC50值為0.203 0 mg/mL，VC的·OH清除能力是金銀花葉黃酮的1.75 倍。結(jié)果表明，金銀花葉黃酮對·OH的清除效果與VC相近，說明金銀花葉黃酮清除·OH的能力較強(qiáng)。

2.1.3·清除能力

O2-·雖然是相對較弱的自由基，但它能夠與生物大分子相互作用產(chǎn)生活性更強(qiáng)的自由基如·OH、單線態(tài)氧等進(jìn)一步引起組織氧化損傷和多種疾病[20]。因此，采用鄰苯三酚自氧化法測定金銀花葉黃酮清除O2-·的能力。由圖3可知，在0.015 6～8.000 0 mg/mL的范圍內(nèi)，VC和金銀花葉黃酮對O2-·的清除能力與樣品質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，且金銀花葉黃酮和VC對O2-·的清除能力差異不顯著（P＞0.05）。VC的IC50值為0.336 0 mg/mL，金銀花葉黃酮的IC50值為0.417 0 mg/mL，VC的O2-·清除能力是金銀花葉黃酮的1.24 倍。但當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到2.000 0 mg/mL以上時(shí)，金銀花葉黃酮和VC對O2-·的清除率均達(dá)到100%。以上結(jié)果表明，金銀花葉黃酮對O2-·的清除能力較強(qiáng)，并在實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出劑量依賴性。

圖3 金銀花葉黃酮對O－2·的清除作用Fig. 3 Scavenging effect of flavonoids from honeysuckle leaves on superoxide anion free radicals

2.1.4 DPPH自由基清除能力

圖4 金銀花葉黃酮對DPPH自由基的清除作用Fig. 4 Scavenging effect of flavonoids from honeysuckle leaves on DPPH free radicals

由圖4可知，金銀花葉黃酮對DPPH自由基的清除作用存在劑量依賴效應(yīng)，在0.015 6～8.000 0 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率相應(yīng)增大。在質(zhì)量濃度較低時(shí)，金銀花葉黃酮和VC對DPPH自由基的清除能力差異不顯著（P＞0.05），隨著質(zhì)量濃度增加，金銀花葉黃酮的DPPH自由基清除率高于同一質(zhì)量濃度的VC，DPPH自由基清除率達(dá)到100%時(shí)對應(yīng)的金銀花葉黃酮和VC的質(zhì)量濃度分別為1.000 0、4.000 0 mg/mL。由此表明，金銀花葉黃酮對DPPH自由基的清除能力比VC好。金銀花葉黃酮清除DPPH自由基的機(jī)理可能是因?yàn)辄S酮樣品中具有供氫體，可以提供質(zhì)子還原具有氧化性的自由基，終止自由基的連鎖反應(yīng)，起到抑制或清除自由基的作用[21]。

2.2 金銀花葉黃酮對H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

2.2.1 H2O2濃度篩選結(jié)果

圖5 H2O2對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Fig. 5 Dose-dependent effect of hydrogen peroxide on the viability of RAW264.7 cells

由圖5可知，不同濃度的H2O2對RAW264.7細(xì)胞的生長均有一定抑制作用，且細(xì)胞存活率隨H2O2濃度的升高而降低。與空白組相比，不同濃度的H2O2均顯著抑制RAW264.7細(xì)胞的存活（P＜0.05），當(dāng)用750 mmol/L H2O2處理時(shí)，RAW264.7細(xì)胞的存活率達(dá)到53.73%。H2O2濃度太低時(shí)對細(xì)胞造成的損傷不明顯，而H2O2濃度過高則會造成細(xì)胞死亡過量，因此建模時(shí)H2O2的濃度選取750 mmol/L。

2.2.2 金銀花葉黃酮質(zhì)量濃度篩選結(jié)果

圖6 不同質(zhì)量濃度金銀花葉黃酮對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Fig. 6 Dose-dependent effect of flavonoids from honeysuckle leaves on the viability of RAW264.7 cells

由圖6可知，與空白組相比，一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的金銀花葉黃酮對RAW264.7細(xì)胞有促進(jìn)增殖的作用，但當(dāng)金銀花葉黃酮質(zhì)量濃度大于500 mg/mL時(shí)會顯著抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05），因此，金銀花葉黃酮質(zhì)量濃度選擇125、250、500 mg/mL，將此質(zhì)量濃度作為推薦劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 RAW264.7細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量

MDA含量的高低間接反應(yīng)了細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[22]。如圖7所示，與空白組相比，模型損傷組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的MDA含量均有所上升，且有顯著差異（P＜0.05）。金銀花葉黃酮低中高劑量組顯著抑制了H2O2引起的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量的增加，并呈劑量依賴性（P＜0.05）?？瞻捉M與VC對照組無顯著差異（P＞0.05）。

圖7 RAW264.7細(xì)胞（A）及細(xì)胞培養(yǎng)液（B）中MDA含量Fig. 7 MDA contents in RAW264.7 cells (A) and culture supernatant (B)

MDA是生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)得到的氧化終產(chǎn)物[23]。機(jī)體內(nèi)的自由基極易侵害細(xì)胞脂中的不飽和脂肪酸，形成脂質(zhì)自由基，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。細(xì)胞膜中由磷脂?；満湍懝檀冀M成的區(qū)域在細(xì)胞中極性最小，溶解有高濃度的氧，更有利于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的進(jìn)行[24]。因此，細(xì)胞膜內(nèi)的MDA含量顯著高于細(xì)胞培養(yǎng)液中的MDA含量（P＜0.05）。

2.2.4 RAW264.7細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH含量

圖8 RAW264.7細(xì)胞（A）及細(xì)胞培養(yǎng)液（B）中GSH含量Fig. 8 GSH contents in RAW264.7 cells (A) and culture supernatant (B)

GSH是一種低分子清除劑，可清除O2-?、H2O2、過氧化脂質(zhì)，其含量多少是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要因素

[25]。如圖8所示，與空白組相比，模型損傷組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的GSH含量明顯降低（P＜0.05），而金銀花葉黃酮低、中、高劑量組顯著抑制了H2O2引起的細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH含量的下降（P＜0.05），并呈現(xiàn)劑量依賴性。金銀花葉黃酮高劑量組在細(xì)胞中的GSH含量接近

VC對照組，無顯著差異（P＞0.05）；金銀花葉黃酮中劑量組在細(xì)胞培養(yǎng)液中的GSH含量接近VC對照組，無顯著差異（P＞0.05）。

2.2.5 RAW264.7細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活力

圖9 RAW264.7細(xì)胞（A）及細(xì)胞培養(yǎng)液（B）中SOD活力Fig. 9 SOD activity in RAW264.7 cells (A) and culture supernatant (B)

SOD通過催化超氧陰離子歧化為H2O2和O2，從而達(dá)到清除自由基的目的，其活力對細(xì)胞的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用[26-27]。由于SOD主要存在于機(jī)體的各個(gè)組織細(xì)胞內(nèi)[28]，因此細(xì)胞中的SOD活力顯著高于其所對應(yīng)的細(xì)胞液（P＜0.05）。如圖9所示，與空白組相比，模型損傷組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的SOD活力均顯著下降（P＜0.05），而添加金銀花葉黃酮中、高劑量組能有效升高細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活力使其與正常組SOD活力無顯著差異（P＞0.05）。金銀花葉黃酮各劑量組在細(xì)胞中的SOD活力均顯著強(qiáng)于VC對照組（P＜0.05）；金銀花葉黃酮中劑量組在細(xì)胞液中的SOD活力接近VC對照組，無顯著差異（P＞0.05）。2.2.6 RAW264.7細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力

LDH存在于細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞受損時(shí)細(xì)胞膜通透性增加，會引起LDH外漏，因此LDH活力可以反映細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和受氧化損傷程度[29]。如圖10所示，與空白組相比，模型損傷組細(xì)胞中的LDH活力顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力顯著升高（P＜0.05），表明H2O2使細(xì)胞受損引起了LDH外漏。與模型損傷組相比，金銀花葉黃酮各劑量組顯著升高了細(xì)胞中LDH活力，降低了細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力（P＜0.05），并呈劑量依賴性，表明金銀花葉黃酮可以預(yù)防或減緩細(xì)胞膜受損程度，阻止細(xì)胞內(nèi)LDH外漏。金銀花葉黃酮高劑量組在細(xì)胞中的SOD活力接近VC對照組，無顯著差異（P＞0.05）。

圖10 RAW264.7細(xì)胞（A）及細(xì)胞培養(yǎng)液（B）中LDH活力Fig. 10 LDH activity in RAW264.7 cells (A) and culture supernatant (B)

3 討 論

本研究結(jié)果表明，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，金銀花葉黃酮抗氧化能力隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，并呈劑量依賴性。金銀花葉黃酮的總還原力及對·OH、O2-·和DPPH自由基的清除能力接近甚至高于VC，金銀花葉黃酮具有較好的體外抗氧化性。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過H2O2損傷后，RAW264.7細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量均顯著升高，GSH含量以及SOD活力顯著下降，這表明H2O2對RAW264.7巨噬細(xì)胞具有明顯的毒性作用；RAW264.7細(xì)胞中LDH活力顯著下降，而細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力顯著上升，這可能是由于H2O2使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到損傷，細(xì)胞膜通透性增加，從而使LDH漏到細(xì)胞外[30]。用不同劑量金銀花葉黃酮作用于損傷細(xì)胞時(shí)，上述指標(biāo)較模型損傷組均獲得了不同程度的改善。金銀花葉黃酮一方面通過提高細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH含量及SOD活力，清除機(jī)體中有毒有害物質(zhì)和自由基，從而保護(hù)細(xì)胞不受過氧化氫的損傷；另一方面通過減少機(jī)體中MDA含量，降低脂質(zhì)過氧化作用形成脂質(zhì)過氧化物含量，減緩細(xì)胞膜系統(tǒng)受氧自由基攻擊后的損傷，從而間接增強(qiáng)了機(jī)體抵抗自由基攻擊的能力[31]，保持生物膜的結(jié)構(gòu)完整和膜表面蛋白質(zhì)的功能，有效減輕了LDH向細(xì)胞外擴(kuò)散的程度。

綜上所述，金銀花葉黃酮對H2O2誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與其調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)，清除氧自由基及有害物質(zhì)，維持細(xì)胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性有關(guān)，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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