兒茶素及其衍生物合成研究進(jìn)展

陸昌琪，毛世紅，童華榮*，丁陽平*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

兒茶素類化合物是茶葉中的主要功能成分，占茶葉干質(zhì)量的12%～24%。茶樹中兒茶素類化合物主要包括兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，CG）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）及表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）8 種單體[1]。為眾所知，兒茶素具有抗炎癥、抗菌、抗病毒及抗氧化等效用[2-3]，其中，EGCG抗氧化性最為突出，可通過清除活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）、NO或與ROS反應(yīng)生成穩(wěn)定化合物的方式有效平衡人體內(nèi)自由基[4]。隨著對兒茶素研究愈加深入，更多藥理功能被發(fā)現(xiàn)，兒茶素可通過調(diào)節(jié)相關(guān)酶活性或與相關(guān)酶蛋白特異性結(jié)合抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，但不同兒茶素單體間存在明顯差異[5-8]；兒茶素還可預(yù)防心腦血管疾病[9]以及保護(hù)腎臟、肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)等[10]。由于兒茶素存在脂溶性低、穩(wěn)定性差、在人體內(nèi)利用率低等缺點(diǎn)，大大限制了其開發(fā)應(yīng)用。因此，研究人員希望通過酶法、化學(xué)法、微生物法等對兒茶素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以提高其藥效及生物利用率[11-12]。

表1 兒茶素的結(jié)構(gòu)Table 1 Structures of catechins

1 兒茶素生物合成

兒茶素類化合物具有2-苯基苯并二氫吡喃結(jié)構(gòu)，屬于黃烷醇類化合物。根據(jù)夏濤[13-14]、宛曉春[15]等的總結(jié)，兒茶素在茶樹中生物合成主要由莽草酸途徑、苯丙烷途徑、非酯型兒茶素合成、酯型兒茶素合成這4 部分組成（圖1）。在莽草酸途徑中，戊糖磷酸途徑產(chǎn)生的4-磷酸赤蘚糖（erythrose 4-phosphate，E4P）和糖酵解途徑產(chǎn)生的磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）在3-脫氧-D-7-磷酸阿拉伯庚酮糖酸合成酶（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase，DAHPS）作用下合成3-脫氧-D-7-磷酸阿拉伯庚酮糖酸（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate，DHAP），接著在其他酶作用下連續(xù)反應(yīng)得到芳基氨基酸、維生素、木質(zhì)素、酚類物質(zhì)、生物堿等產(chǎn)物[16]；其中，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）作用下進(jìn)入苯丙烷途徑，合成得到對香豆酰CoA。1 分子對香豆酰CoA與3 分子丙二酰CoA在查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）作用下合成柚皮素查耳酮，并在查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）作用下環(huán)化得到柚皮素。查耳酮是兒茶素、花青素等化合物合成的重要前體物質(zhì)，是兒茶素類化合物基礎(chǔ)分子骨架，這種O1和C2連接形成吡喃環(huán)的方式為兒茶素化學(xué)合成提供了重要信息。柚皮素在類黃酮3’-羥化酶（flavonoid 3’-hydroxylase，F(xiàn)3’H）、類黃酮3’,5’-羥化酶（flavonoid 3’,5’-hydroxylase，F(xiàn)3’,5’H）作用下分別在B環(huán)引入了一個和兩個羥基得到黃烷酮，隨后被黃烷酮3-羥化酶（flavonoid 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）和二氫黃烷醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）催化還原合成無色花青素。無色花青素可被還原酶（leucoanthocyanidin reductase，LAR）直接還原得到非表型兒茶素，即兒茶素和GC[17]，也可被花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）和花青素還原酶（anthocyanidin reductase，ANR）連續(xù)催化得到表型兒茶素EC和EGC[18]；有同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EC和EGC之間也可能存在相互轉(zhuǎn)化機(jī)制。

酯型兒茶素是茶樹中主要兒茶素，有研究者推測酯型兒茶素是由非酯型兒茶素沒食子酯化得到，但并未被實(shí)驗(yàn)證實(shí)。Niemezt[19]、Gross[20]等認(rèn)為1-O-沒食子酰-β-葡萄糖是單寧合成的有效?；w和受體；Liu Yajun等[21]在此基礎(chǔ)上證實(shí)：兒茶素沒食子?；^程與水解單寧合成途徑具有相似性，即1-O-沒食子酰-β-葡萄糖是酯型兒茶素合成的?；苯庸w，EC和EGC在尿苷二磷酸葡萄糖-沒食子酰基-1-O-β-D-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（UDG-galloyl-1-O-β-D-glucose transferase，UGGT）和表兒茶素-1-O-沒食子酰基-β-D-沒食子?；D(zhuǎn)移酶（EC-1-O-galloyl-β-D-gallic acyltransferase，ECGT）作用下合成酯型兒茶素；與之對應(yīng)，酯型兒茶素也會在酯型兒茶素水解酶（galloylated catechin hydrolase，GCH）作用下轉(zhuǎn)變成非酯型兒茶素EC和EGC[22-23]。

圖1 茶樹中兒茶素類化合物主要合成路徑Fig. 1 Major synthesis pathways of catechins in Camellia sinensis (L.) O. Ktze

2 兒茶素化學(xué)合成

迄今為止，黃烷醇化學(xué)合成路徑可歸納為兩種，一種源于兒茶素生物合成，即O1-C2間直接醚化成環(huán)，但所得產(chǎn)物結(jié)構(gòu)大多為反式；另一種途徑則是C4與苯環(huán)上橋碳連接環(huán)化，該方法可同時得到順式和反式產(chǎn)物，與反應(yīng)前體構(gòu)型有很大關(guān)系[24-25]。

2.1 O1-C2環(huán)化

該方法與兒茶素生物合成途徑很相似，選用不同原料進(jìn)行反應(yīng)可得到不同取代的查耳酮衍生物，將其環(huán)化還原后即得到不同結(jié)構(gòu)兒茶素衍生物[26]（圖2）。Sundeep等[27]以槲皮素作為原料經(jīng)羥基保護(hù)/去保護(hù)、還原后得到外消旋EC和兒茶素，并申請了專利。若用戴斯-馬丁氧化劑（Dess-Martin periodinane，DMP）將C3羥基氧化成酮基，再經(jīng)還原反轉(zhuǎn)羥基位置即可得到其差向異構(gòu)體；此外，在化學(xué)合成中，沒食子酰氯和酸酐等也可與簡單兒茶素酯化得到酯型兒茶素及兒茶素衍生物（圖2）。

圖2 O1-C2的環(huán)化Fig. 2 Cyclization at O1-C2

2.2 C4-橋碳環(huán)化

與O1-C2環(huán)化相同，C4-橋碳環(huán)化首先形成二氫吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)，經(jīng)氫化還原后得到兒茶素產(chǎn)物。相對O1-C2環(huán)化來說，C4-橋碳環(huán)化所需原料更少，圖3列舉了兩種較為常見的合成途徑[24-25,28-29]。

Tanaka等[24]將芳基烯丙醇用MnO2氧化后與巰基乙醇反應(yīng)得到S,O-縮醛，在間氯過氧苯甲酸（3-chloroperbenzoic acid，m-CPBA）和N-溴代琥珀酰亞胺（1-bromo-2,5-pyrrolidinedione，NBS）相繼作用下得到溴醇；溴醇不僅可以與2-溴-3,5-芐氧基苯酚直接反應(yīng)得到順式產(chǎn)物a，在堿性條件時溴醇經(jīng)環(huán)氧反應(yīng)后產(chǎn)生立體異構(gòu)，與2-溴-3,5-芐氧基苯酚反應(yīng)后還可得到反式產(chǎn)物b。順式產(chǎn)物a和反式產(chǎn)物b分別在三氟乙酸酐（trifluoroacetic anhydride，TFAA）和三乙基硅烷（triethylsilane，Et3SiH）作用下發(fā)生親電芳基環(huán)化得到外消旋的EGCG和GCG（圖4）。

圖3 C4-Ar的環(huán)化Fig. 3 Cyclization at C4-Ar

圖4 兒茶素的化學(xué)合成Fig. 4 Chemical synthesis of catechins

3 兒茶素衍生物的合成

3.1 酶法修飾

相對于化學(xué)修飾嚴(yán)格的反應(yīng)條件和復(fù)雜多樣的產(chǎn)物來說，酶法修飾反應(yīng)條件更加溫和，具有高度選擇性，但產(chǎn)率相比較低。

3.1.1 烷基化修飾

目前，兒茶素烷基修飾主要是對羥基進(jìn)行甲基化取代。研究人員在茶樹鮮葉和動物血液、肝臟和尿液中發(fā)現(xiàn)多種甲基兒茶素，這是由于生物體本身存在兒茶素甲基轉(zhuǎn)移酶（catechin-O-methyltransferase，COMT）[30-33]。在動物體中，COMT多存在于肝臟組織和小腸中，Okushio等[34]用大鼠肝臟組織勻漿和S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）對EGC、ECG分別進(jìn)行體外甲基化實(shí)驗(yàn)，得到4’-甲基-EGC和4’’-甲基-ECG，而在（+）-C存在條件下，EGC、ECG甲基化過程被抑制。呂海鵬等[35-36]從大腸桿菌中提取得到EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（EGCG-O-methyltransferase，EOMT），用其催化EGCG反應(yīng)得到10余種甲基化產(chǎn)物。其最佳反應(yīng)條件為：溫度35 ℃、pH 7.5、2 mmol/L MgCl2和2 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、0.4 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸對甲苯磺酸鹽（S-adenosyl methionine p-toluenesulfonate，SAM-pTS）。大量研究表明，植物源COMT大多優(yōu)先甲基化C3’或C3’’，而動物源酶優(yōu)先在C4’或C4’’進(jìn)行甲基化。甲基兒茶素抗腫瘤活性雖然降低，但有研究發(fā)現(xiàn)，甲基兒茶素對肝癌細(xì)胞Bel-7402和肝癌多藥耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-FU具有細(xì)胞毒性，且隨著烷基化數(shù)目增多而增強(qiáng)[37]；另外，全甲基兒茶素還對腫瘤多藥耐藥性具有較強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)作用，其中，酯型衍生物的作用相對更強(qiáng)[38]。兒茶素強(qiáng)抗氧化性源于酚羥基，當(dāng)羥基被取代后，兒茶素衍生物抗氧化性隨之減弱，根據(jù)不同取代位置，其改變也不盡相同，其中B環(huán)羥基被取代的影響最大。另一方面，甲基兒茶素還具有突出的抗過敏活性，可有效緩解過敏性鼻炎癥狀[39-40]。

3.1.2 ?；揎?/p>

兒茶素?；揎棿蠖嘤芍久复呋瓿?。李哲[41]和Zhu Song[42-43]等將兒茶素與乙酸乙烯酯以物質(zhì)的量比1∶1在乙腈中用脂肪酶催化反應(yīng)得到多種不同乙酰化兒茶素。趙峰等[44]利用Candida antarctica Novozym 435脂肪酶在叔戊醇中催化EGCG與丁酸乙烯酯反應(yīng)，成功在EGCG分子結(jié)構(gòu)中引入四碳鏈烷基；霍清等[45]將沒食子兒茶素分別與月桂酸、硬脂肪酸按比例溶于正丁醇中，并加入Novozym 435脂肪酶催化反應(yīng)，經(jīng)色譜柱分離純化得到相應(yīng)?；a(chǎn)物。趙峰等[44]認(rèn)為酶促反應(yīng)產(chǎn)物與溶劑有很大關(guān)聯(lián)，不僅需要對酶具有很好溶解性，還要有良好疏水性。Patti[46]和Mori[47]等分別用不同來源脂肪酶催化兒茶素與不同碳鏈長度酸酐或酰氯反應(yīng)得到了多種?；a(chǎn)物。

隨著脂肪鏈的引入，兒茶素衍生物脂溶性明顯增強(qiáng)，透過生物膜的能力也隨之增強(qiáng)，其抗癌效果顯著提升；但隨著脂肪鏈長度增加，長碳鏈將會屏蔽周圍酚羥基并增大其空間位阻，此外，長碳鏈的聚集也同樣會抑制脂肪鏈的進(jìn)一步引入[48]。

3.1.3 糖苷化修飾

兒茶素雖然具有很多親水性羥基，但在水中溶解度并不高，通過引入一個或數(shù)個親水性糖苷基團(tuán)可有效提高其水溶性。在動植物體中，兒茶素和甲基兒茶素都可被糖苷化，Okushio等[49]在大鼠尿液和膽汁中檢測到（-）-EC-5-β-葡糖苷酸和（-）-3’-甲基-EC-5-β-葡糖苷酸。另外，Romanov-Michailidis通過液相和質(zhì)譜手段在服用50 mg（-）-EC的人體的血液、尿液、腸液和膽汁中檢測到兩種糖苷化產(chǎn)物、兩種硫酸酯化產(chǎn)物和5 種甲基化硫酸酯化產(chǎn)物，但具體結(jié)構(gòu)還未能被解析，其生理功能也不清楚[50]。

研究人員從腸系膜明串珠菌中提取得到蔗糖磷酸化酶（sucrose phosphorylase，SPase）和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（glucose transferase，GTFs）[51]，用其分別催化兒茶素與蔗糖反應(yīng)后得到7 種兒茶素-α-吡喃葡萄糖苷，具體為（+）-C-3’-α-D-吡喃葡萄糖苷、EGCG-7-α-D-吡喃葡萄糖苷、EGCG-4’-α-D-吡喃葡萄糖苷、EGCG-7,4’-α-D-吡喃葡萄糖苷)、EGCG-4’’-α-D-吡喃葡萄糖苷、EGCG-4’,4’’-α-D-吡喃葡萄糖苷、EGCG-7,4’’-α-D-吡喃葡萄糖苷；由于空間位阻差異，對不同兒茶素的催化效率也不相同，其由高到低排列順序依次為：（-）-EGC＝（+）-C＞（-）-EC＞（-）-ECCG＞（-）-ECG[52]。Funayama等[53]從浸麻芽孢桿菌中提取得到環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase），催化淀粉與（+）-C反應(yīng)同樣得到（+）-C-3’-α-D-吡喃葡萄糖苷。

Aramsangtienchai等[54]從類芽孢桿菌中分離得到β-環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（β-cyclodextrin glycosyltransferase，β-CGTase），用其催化（-）-EC和β-環(huán)糊精反應(yīng)，在不同反應(yīng)時間下，分別得到（-）-EC-3’-O-α-D-吡喃葡萄糖苷、（-）-EC-3’-O-α-D-二吡喃葡萄糖苷、（-）-EC-3’-O-α-D-三吡喃葡萄糖苷和（-）-EC-4’-O-α-D-吡喃葡萄糖苷這4 種糖苷化產(chǎn)物，具體結(jié)構(gòu)見圖5。

圖5 4 種糖苷產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式Fig. 5 Structures of 4 glycosylation products

Cho等[55]從中度嗜熱菌中提取蔗糖淀粉酶基因并在大腸桿菌中成功表達(dá)，得到重組的蔗糖淀粉酶（deinococcus geothermalis，DAGS），其催化蔗糖與（+）-C反應(yīng)得到（+）-C-3’-α-D-吡喃葡萄糖苷和（+）-C-3’-α-麥芽糖苷，這種轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)對DAGS濃度具有正相關(guān)依賴性。另外，通過制備型高效液相色譜和麥芽糖淀粉酶消化實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)另一種糖苷衍生物（+）-C-3’-α-麥芽低聚糖。

Moon等[52]發(fā)現(xiàn)，糖苷化兒茶素抗氧化活性與糖苷基團(tuán)取代位置有關(guān)，但由于羥基被取代，相對兒茶素本身并未增強(qiáng)甚至有所降低；隨著兒茶素衍生物水溶性增強(qiáng)，還可以與細(xì)胞中多余的自由基結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝[56]；Kitao等[51]研究發(fā)現(xiàn)，糖苷化兒茶素對細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶具有很強(qiáng)抑制性，在光照條件下可有效防止褐變。

3.2 化學(xué)修飾

一般來說，化學(xué)修飾產(chǎn)率較高，但其產(chǎn)物成分復(fù)雜，分離難度較大。

3.2.1 醚化修飾

兒茶素醚化修飾是指在酚羥基及C3醇羥基位置引入烷基鏈，兩者以醚鍵連接。其中，在酚羥基位置修飾按反應(yīng)路徑可分為直接醚化和間接醚化，直接醚化是指兒茶素與甲基供體進(jìn)行一步合成反應(yīng)，其操作簡便，但產(chǎn)物復(fù)雜，不利于分離純化；間接醚化則是先對羥基進(jìn)行保護(hù)，雖然步驟較多，但反應(yīng)副產(chǎn)物較少，純度較高[40]。

3.2.1.1 酚羥基直接醚化

呂海鵬等[57-59]以CH3I作為甲基供體與EGCG直接反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，EGCG上8 個酚羥基都可被甲基化，其中，C4’’酚羥基優(yōu)先被取代。除了CH3I外，常用甲基供體還有硫酸二甲酯和重氮甲烷；伍妍俊等[60]通過控制硫酸二甲酯和EGCG比例選擇性合成得到4’’-甲基-EGCG（圖6）；Yanase等[61]用重氮甲烷作為甲基供體在乙醚中與EGCG反應(yīng)得到3’-甲基-EGCG、4’-甲基-EGCG、3’’-甲基-EGCG、4’’-甲基-EGCG、3’’,5’’-二甲基-EGCG，通過光照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，B環(huán)甲基化產(chǎn)物穩(wěn)定性明顯強(qiáng)于D環(huán)甲基化產(chǎn)物。

圖6 硫酸二甲酯作為供體的甲基化兒茶素合成Fig. 6 Synthesis of methylated EGCG with Me2SO4 as a donor

3.2.1.2 酚羥基間接醚化

間接醚化通常由從頭合成得到羥基被保護(hù)的兒茶素，在此基礎(chǔ)上引入烷基，常用的保護(hù)基團(tuán)有芐基和硝基苯磺?；?。Zaveri[62]用3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯對芐基保護(hù)的GC進(jìn)行?；?jīng)還原后得到3’’,4’’,5’’-三甲基-GCG。另一方面，芐基化GC被DMP和三仲丁基硼氫化鋰（L-selectride）反轉(zhuǎn)C3羥基位置后得到其立體異構(gòu)產(chǎn)物，與上述相同處理后得到3’’,4’’,5’’-三甲基-EGCG（圖7）。GCG及EGCG甲基化產(chǎn)物對乳腺癌細(xì)胞系具有抑制作用，雖然EGCG甲基化產(chǎn)物抗癌活性比GCG甲基化產(chǎn)物稍強(qiáng)，但都低于EGCG本身[62]。Lai Ronghui等[63]用芐基保護(hù)的EGC與對甲基化沒食子酸發(fā)生酯化反應(yīng)，同樣得到4’’-甲基-EGCG。

圖7 甲基化兒茶素的從頭合成Fig. 7 De novo synthesis of methylated catechins

Aihara[64]和Asakawa[65]等用2-硝基苯磺?；鶎翰杷睾蜎]食子酸部分羥基進(jìn)行選擇性保護(hù)，在剩余羥基上引入甲基，兩者在1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）作用下發(fā)生酯化得到5 種甲基化EGCG衍生物，分別是3’’-甲基-EGCG、4’-甲基-EGCG、3’’-甲基-EGCG、4’’-甲基-EGCG和3’,3’’-二甲基-EGCG。

3.2.1.3 C3-醇羥基醚化

Park等[66]用芐基對（+）-C的酚羥基進(jìn)行保護(hù)，在氫氧化銫和四丁基碘化銨（tetrabutylammonium iodide，TABI）作用下與不同結(jié)構(gòu)鹵代烴反應(yīng)，經(jīng)還原得到一系列醇醚化合物（圖8）。該產(chǎn)物對革蘭氏陽性菌、陰性菌以及致病性真菌都具有較強(qiáng)抗性，其中（+）-3-癸基-C的效果最為明顯；這可能是由于長鏈烷基增強(qiáng)了兒茶素脂溶性，從而增強(qiáng)對菌體磷脂化膜的干擾能力。

圖8 芐基保護(hù)的C3醚化反應(yīng)Fig. 8 Bn-protected (+)-C acylation reaction at alcoholic hydroxyl group

3.2.2 酯化修飾

與醚化修飾相同，兒茶素酯化修飾可發(fā)生在所有酚羥基和C3醇羥基上，常以酰氯或酸酐形式作為供體；其中，乙?；诜磻?yīng)中還常用作保護(hù)基團(tuán)對活性羥基進(jìn)行選擇性保護(hù)。

在不同反應(yīng)條件下，酯化位置也會發(fā)生改變。Hong Shan等[67]以（+）-C為原料，在不同酸堿條件下與月桂酰氯反應(yīng)合成得到3-月桂?；?（+）-C、5-月桂酰基-（+）-C、7-月桂?；?（+）-C、3’-月桂?；?（+）-C、4’-月桂?；?（+）-C 5 種不同取代產(chǎn)物。在（+）-C的四氫呋喃溶液中加入吡啶和少量DMAP會促進(jìn)C環(huán)上C3?；a(chǎn)物的生成；加入Na2CO3和二甲基二氯化錫提供酸性反應(yīng)環(huán)境會促進(jìn)B環(huán)上羥基的?；?；而對B、C環(huán)上羥基進(jìn)行保護(hù)后加入對甲基苯磺酸則會促進(jìn)A環(huán)上酚羥基的?；??？寡趸瘜?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，B環(huán)?；a(chǎn)物清除自由基能力最弱，A環(huán)C7?；a(chǎn)物清除自由基能力則最強(qiáng)，說明B環(huán)酚羥基對兒茶素清除自由基能力貢獻(xiàn)最大。

Lin Shufu等[68]用叔丁基二甲基硅基（tert-butyldimethylsilyl，TBDMS）對EGCG進(jìn)行保護(hù)后，將酯鍵水解后得到受保護(hù)的EGC，在DMAP和二環(huán)己基碳二亞胺（N,N’-dicyclohexylcarbodiimide，DCC）作用下，EGC與不同長度和構(gòu)型的羧酸反應(yīng)得到一系列的C3?；a(chǎn)物；Utevona等[69]在室溫下用DMAP催化EGCG與乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐反應(yīng)同樣得到了一系列?；a(chǎn)物。陳平[70]和孫東[71]等將EGCG分別與棕櫚酰氯和肉豆蔻酰氯反應(yīng)，用高速逆流色譜純化后得到EGCG-4’-棕櫚酸酯和EGCG-4’-肉豆蔻酸酯。

除了酰氯和酸酐外，使用其他供體也可以得到相應(yīng)的?；a(chǎn)物。Osanai等[72]在常溫下用對氨基苯甲酸作為供體與芐基保護(hù)的EGC在DMAP作用下反應(yīng)20 h，得到酯型兒茶素衍生物EGC-3-對氨基苯甲酸酯和EGC-3-對氨基苯甲酸酯-6,8,3’’,4’’,5’’-五乙酸酐（圖9）。其中，EGC-3-對氨基苯甲酸酯對蛋白酶體具有較強(qiáng)抑制性，而全乙?；瘜Π被〈苌锷踔量烧T導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

圖9 EGC-3-對氨基苯甲酸酯-6,8,3’’,4’’,5’’-五乙酸酐的合成Fig. 9 Synthesis of EGC-3-p-aminobenzoic acid ester-6,8,3’,4’,5’-acetic anhydride

Lin Shufu[68]、陳平[70]等的研究證明，在一定長度脂肪鏈酯化兒茶素中，隨著飽和碳鏈碳原子數(shù)目增加，衍生物抗氧化活性和抗病毒能力隨之增強(qiáng)，其中十六碳兒茶素棕櫚酸酯效果最好。

3.2.3 碳烴化修飾

兒茶素碳烴修飾一般發(fā)生在C-4、6、8及沒食子酸非羥基部分，其修飾基團(tuán)可多種多樣。Dutta等[73]在EC的C4位置引入間苯二酚和間苯三酚以增加酚羥基數(shù)目，結(jié)果顯示，隨著酚羥基數(shù)目的增加，衍生物對核糖核酸酶A抑制活性逐漸增強(qiáng)，說明酚羥基數(shù)目對兒茶素活性有很大影響；此外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)化合物4-（2,4,6-間苯三酚）-EC和4-（2,4-間苯二酚）-EC還可以抑制由血管生長素導(dǎo)致的血管生長。

Fudouji等[74]將（+）-C和（-）-EGCG分別與烯丙醇、天然醛類（如：反式-2-乙烯醛、檸檬醛、香茅醛、香葉醇和葉綠醇等）在25～100 ℃條件下加熱反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)分離得到11 種衍生物，其中，不飽和醛類的飽和碳原子常與兒茶素A環(huán)C6或C8連接成鍵，不飽和碳則與C5或C7上羥基形成醚鍵從而環(huán)化；烯丙醇等其他醇類在A環(huán)或B環(huán)也發(fā)生同樣反應(yīng)，這些兒茶素衍生物在疏水條件下表現(xiàn)出強(qiáng)清除自由基能力。

Cruz等[75]對羥基用硅烷基保護(hù)后，通過控制叔丁基二甲基硅基氯（tertbutyldimethylsilyl chloride，TBDMSCl）用量，反應(yīng)得到兩種硅烷基化產(chǎn)物a和b(圖10)，兩者區(qū)別在于4位醇羥基氫取代與否，用溴取代C8位置氫原子后，在鈀和生物活性磷作用下與乙烯基硼酸頻哪醇酯發(fā)生鈴木交叉耦合，去保護(hù)基團(tuán)后得到8-乙烯基-（+）-C（圖10）。Bernini等[76]用硫酸二甲酯對兒茶素酚羥基進(jìn)行甲基化保護(hù)，將A環(huán)C8碘化取代后，化合物58在鈀和生物活性磷作用下與芳基化合物發(fā)生鈴木交叉耦合反應(yīng)得到C8芳基取代化合物8-苯基-5,7,3’,4’-四甲基-O-（+）-C和8-苯基-5,7,3’,4’-四甲基-O-（-）-EC（圖11）。

圖10 C8乙烯基取代Fig. 10 Vinyl substitution at C8-H

圖11 C8芳基取代反應(yīng)途徑Fig. 11 Aryl substitution at C8-H

Tanaka等[77]以EGCG為底物，與硫醇化物在80 ℃下加熱2～4 h，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠色譜柱分離純化得到6 種C6、C8取代物（表2，化合物a～f）。而將多聚原花青素降解物用辛硫醇按相同方法處理后可以得到另外2 種4-硫醇-EGCG（表2，化合物g、h）。

表2 硫醇化修飾產(chǎn)物結(jié)構(gòu)Table 2 Structure of mercaptan modification

3.2.4 糖苷化修飾

糖苷化兒茶素化學(xué)合成步驟常常比較復(fù)雜，Mull等[78]將1-（2,4,6-三羥基苯基）-1-乙酮和3,4-二羥基苯甲醛在強(qiáng)堿性條件下反應(yīng)得到查耳酮a（圖12），接著用硼氫化鈉和氯化鈰還原并用叔丁基二甲基氯硅烷（tertbutyldimethylsilyl chloride，TBSCl）對羥基進(jìn)行保護(hù)，在AD-mix α作用下發(fā)生Sharpless不對稱雙羥基化反應(yīng)得到化合物b（圖12），化合物b形成吡喃環(huán)后在DMP作用下生成酮，經(jīng)還原后發(fā)生立體異構(gòu)得到EC衍生物，最后與2,3,4-三-O-乙酰基-α-D-葡糖醛酸甲酯三氯乙酰亞氨酸酯反應(yīng)，得到4’-甲基-O-（-）-EC-7-葡萄糖苷（化合物c，表3）、4’-甲基-O-（-）-EC-5-葡萄糖苷（化合物d，表3）、4’-甲基-O-（-）-EC-3’-葡萄糖苷（化合物e，表3）、3’-甲基-O-（-）-EC-7-葡萄糖苷（化合物f，表3）和（-）-EC-7-葡萄糖苷（化合物g，表3）。

傳統(tǒng)方法得到的兒茶素糖苷化物一般由兒茶素直接衍生或直接合成，這種方法產(chǎn)率較低。Romanov-Michailidis等[50]選用新戊基氯硫酸鹽作為磺化試劑并采用反向去保護(hù)，即先氫解再用Na3N除去新戊基，得到了（-）-EC-3’-β-葡萄糖苷、（-）-EC-4’-β-葡萄糖苷、（-）-EC-3’-亞硫酸鈉酯。Zhang Xin等[79]以D-葡萄糖和EGCG為底物合成得到2,3,4,6-四氧乙?；?5-α-D-溴吡喃葡萄糖，在與EGCG反應(yīng)后得到EGCG-4’’-β-D-吡喃葡萄糖苷和EGCG-4’,4’’-β-D-吡喃葡萄糖苷。

圖12 糖苷化EC的合成路徑Fig. 12 Preparation of glycosylated epicatechin

表3 （－）-EC葡萄糖苷化合物結(jié)構(gòu)Table 3 Structures of (-)-EC glucoside compounds

3.2.5 其他修飾

圖13 雙脫氧EGCG合成路徑Fig. 13 Double deoxygenation EGCG

Furuta等[80]用3,4,5-三芐氧基苯甲醛、硝基甲烷和水楊醛在1,4-二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷（1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane;triethylenediamine，DABCO）、DMAP和乙酸銨（ammonium acetate，NH4OAc）等催化作用下合成得到一種C6、C8雙脫氧EGCG（圖13），其與Yoshida等[29]的實(shí)驗(yàn)表明6,8-雙脫氧EGCG比EGCG具有更強(qiáng)的抗流感病毒活性。Yoshida等[29]用苯基四唑-砜、苯乙醛和烷基硼酸為原料，通過Mitsunobu反應(yīng)在酸性條件下閉合吡喃環(huán)并與沒食子酸酯化合成前體化合物，然后在氨基端引入熒光基團(tuán)TG，即得到了化合物a（圖14）?；衔颽在細(xì)胞中能發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，可作為分子探針用來研究EGCG在生物體內(nèi)的動力學(xué)特征、胞內(nèi)運(yùn)輸以及代謝途徑。

圖14 Yoshida的合成路徑Fig. 14 Synthesis pathway presented by Yoshida

4 結(jié) 語

綜上所述，兒茶素被甲基化修飾后，雖然抗腫瘤和抗氧化活性明顯減弱，但抗過敏和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性表現(xiàn)更加突出，其作用強(qiáng)度與甲基化位置和數(shù)目相關(guān)[81]；在兒茶素結(jié)構(gòu)中引入糖苷基團(tuán)可顯著增加其水溶性，另外，糖苷化兒茶素還可抑制酪氨酸酶活性，進(jìn)而有效抵抗光照輻射引起的褐變；?；鶅翰杷乜鼓[瘤活性和清除自由基能力顯著提高，這可能是由于隨著脂溶性增強(qiáng)，其透過細(xì)胞膜能力也隨之增強(qiáng)，生物利用率得到明顯提高[82]。

鑒于兒茶素的不穩(wěn)定性，對兒茶素進(jìn)行修飾是拓展兒茶素化合物應(yīng)用前景的必然出路，但也還須根據(jù)不同衍生物藥理特性進(jìn)行有方向的研究。1）甲基化兒茶素抗過敏效用已被大量研究證實(shí)，尤其是3’-甲基-EGCG和4’-甲基-EGCG在人體內(nèi)穩(wěn)定性較強(qiáng)，具有潛在的應(yīng)用價值；而酶法甲基化產(chǎn)率太低，因此未來可重點(diǎn)研究通過化學(xué)合成獲得大量高純度的3’-甲基-EGCG和4’-甲基-EGCG。2）由于小分子乙酰基取代的空間屏蔽作用很小，全乙?；疎GCG更容易穿過脂質(zhì)層，其抗癌活性和生物利用率相比其他?；a(chǎn)物都要強(qiáng)很多；此外，研究證明B環(huán)上羥基對兒茶素結(jié)構(gòu)活性有很大影響[80]；因此，可在全乙?；蛉□GCG結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上對B環(huán)羥基進(jìn)行取代，得到藥理作用更強(qiáng)的衍生物。3）不同修飾帶來的藥效改變有相互拮抗也有相互增強(qiáng)，可選擇性進(jìn)行復(fù)合修飾，如結(jié)合多甲基兒茶素多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性和?；鶅翰杷貜?qiáng)抗腫瘤活性，將大大拓展兒茶素應(yīng)用空間。

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