抗氧化劑硫辛酸分子自組裝體系及印跡聚合物的制備

黃運安，許 龍,2，楊博文，朱秋勁,3,*

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640；3.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

α-硫辛酸（α-lipoic acid，ALA）是一種來源于原核和真核細胞的含硫輔因子[1]，其化學名稱為1,2-二硫戊環(huán)-3-戊酸，主要來源于動物肝臟組織及菠菜等植物，首次于1950年由美國Reed等[2]從豬肝中分離得到。ALA和其還原態(tài)二氫硫辛酸（dihydrolipoic acid，DHLA）獨特的抗氧化能力成為了醫(yī)藥、食品領(lǐng)域的研究熱點[3-4]。通常抗氧化物質(zhì)是在其還原態(tài)具有抗氧化特性，而ALA與其還原態(tài)DHLA均具有抗氧化性，根據(jù)Packer等[5]對抗氧化物質(zhì)的評價標準，ALA和DHLA滿足理想抗氧化物質(zhì)的所有條件，因此被稱為“萬能抗氧化劑”[6]。另外，ALA的相對分子質(zhì)量較低，其分子質(zhì)量比水溶性抗壞血酸大并遠小于脂溶性生育酚，并且由于具有羧基末端以及比抗壞血酸更多的碳原子（ALA與DHLA結(jié)構(gòu)如圖1所示），這使其兼具水溶性和脂溶性[7]。

圖1 ALA（a）和DHLA（b）的化學結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structure of ALA (a) and DHLA (b)

目前，α-硫辛酸已在醫(yī)藥方面廣泛用于治療糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥[8]，在化妝品方面用于修復肌膚、抗皺延緩衰老[9]，在保健食品方面常用于預防自由基引起的各種急慢性癥狀，并可作為VC、VE等維生素補充劑[10]，但由于化學合成硫辛酸的某些未知的安全性限制了其在食品領(lǐng)域中的應用[11]，因此研究天然硫辛酸純化、分離技術(shù)對其在食品領(lǐng)域的應用十分重要。分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）是一種可以應用于不同領(lǐng)域的具有吸附、釋放或特異性識別的高分子聚合物，具有選擇性好、穩(wěn)定性好和制備簡單等優(yōu)點[12]。MIPs在分析領(lǐng)域應用廣泛，且作為分離、純化材料被認為是生物大分子的優(yōu)越替代材料[13-15]。為了快速篩選MIPs印跡比例，提高印跡識別能力，從分子水平上探討MIPs印記識別原理，計算機模擬廣泛應用于探究MIPs體系[16-17]。本研究應用密度泛函理論（density functional theory，DFT）在B3LYP水平下利用Gaussain軟件模擬分析ALA和N-異丙基丙烯酰胺（N-isopropyl acrylamide，NIPAM）自組裝體系，并以ALA為印跡分子、NIPAM為功能單體制備了硫辛酸分子印跡聚合物（ALA-MIPs），為ALA-MIPs在天然ALA的富集和分離應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ALA（純度99%）、DHLA（純度98%）、3-苯基丁酸（3-phenylbutyric acid，PBA；純度93%）、NIPAM（純度97%）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA；純度97%） 美國Sigma-Aldrich公司；偶氮二異丁腈（azodiisobutyronitrile，AIBN；純度99%） 阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZORBAX SB-C18色譜柱 美國安捷倫科技有限公司；P230Ⅱ高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配有可變波長紫外檢測器和EC2006 V1.70色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 大連依利特分析儀器有限公司；SPECTRA Max 190酶標儀 美谷分子儀器有限公司；730.009-QG石英微孔板 德國Hellma公司；S-3400N掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司；Frontier傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）儀 美國PerkinElmer公司；LRH生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；TG16-WS高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴振蕩器 金壇市良友儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 理論計算方法

應用DFT在Gaussian View 5.08軟件中構(gòu)建分子模型，在B3LYP水平下，應用6-31G+（d）基組分別對ALA和NIPAM進行幾何構(gòu)型優(yōu)化和分子靜電勢（molecular electrostatic potential，MEP）計算，應用6-311++（d，p）基組進行復合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化計算。本研究所有計算均在貴州大學云計算平臺上完成。

1.3.2 反應位點預測

對復合物進行幾何構(gòu)型優(yōu)化，在同樣水平下對模板分子（ALA）和功能單體（NIPAM）進行頻率計算，得到?jīng)]有虛頻的幾何構(gòu)型，采用Cube＝Potential關(guān)鍵詞計算ALA與NIPAM的分子靜電勢，并預測其活性位點。

1.3.3 結(jié)合能的計算

在B3LYP水平下應用6-311++（d，p）基組，首先對ALA、NIPAM分子構(gòu)型優(yōu)化和能量進行計算，然后對復合物的構(gòu)型優(yōu)化和能量進行計算，最后復合物的結(jié)合能通過式（1）計算，基組迭加誤差采用Counterpoise方法消除。

式中：?E為Counterpoise方法校正后的結(jié)合能/（kJ/mol）；E（complex）為復合物的總能量/（kJ/mol）；E（ALA）為模板分子ALA的能量/（kJ/mol）；ΣE（NIPAM）為所有單體NIPAM的能量之和/（kJ/mol）。

1.3.4 MIPs的制備

以NIPAM為功能單體，ALA為模板分子，EGDMA為交聯(lián)劑，AIBN為引發(fā)劑，ALA與NIPAM的物質(zhì)的量之比為1∶2（下同），交聯(lián)劑與致孔劑參考Yu Cong等[18]利用酰胺基合成MIPs研究中的用量，具體步驟如下：稱取0.520 g ALA、0.570 g NIPAM、0.100 g AIBN于25 mL三角瓶中，加15 mL乙腈溶解，加10 g EGDMA混勻，超聲脫泡5 min，向三角瓶充氮氣5 min，反復超聲-浸氮2 次后加塞密封，置于4 ℃生化培養(yǎng)箱中，在365 nm紫外光照射下聚合48 h得到的較硬固體，研磨后過200 目（75 μm）篩，用甲醇-乙酸（9∶1，V/V，下同）洗脫液清洗3 次以除去未反應的單體及其余雜質(zhì)，然后放入盛有甲醇-乙酸洗脫液的索氏提取器中洗脫模板分子，直到洗脫液中ALA的吸光度小于0.005，將洗脫模板分子后的聚合物于50 ℃干燥24 h后得到ALA-MIPs。非印跡聚合物（non imprinted polymers，NIPs）的制備方法相同，只是不添加模板分子ALA。

1.3.5 SEM觀察

對ALA-MIPs和NIPs樣品用雙面膠帶法均勻固定在樣品臺上，用洗耳球輕輕吹掉沒有粘牢的樣品，然后進行噴金固定，利用S-3400N SEM對其形貌進行觀察。

1.3.6 FT-IR實驗

采用KBr壓片法：分別將ALA、NIPAM和ALA-MIPs研磨成粉末，50 ℃烘干至質(zhì)量恒定，將樣品與KBr按1∶100（m/m）混合后放在模具中，將模具放在壓片機中30 GP壓力下保持30 s取出，將制作好的KBr晶片放在紅外檢測儀上檢測。

1.3.7 HPLC條件

色譜柱ZORBAX SB-C18（250 mm×4.60 mm，5 μm，pH 1.0～8.0），檢測器為紫外-可見光檢測器，檢測波長215 nm，流動相為乙腈-水（用磷酸調(diào)pH 3.5，體積比50∶50），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL。

1.3.8 等溫吸附實驗

分別稱取20.0 mg的ALA-MIPs與NIPs置于25 mL的錐形瓶中，分別加入5 mL不同質(zhì)量濃度（20、40、60、80、100、120、140 mg/L）ALA乙腈溶液，密封后，將其置于恒溫振蕩器中25 ℃、70 r/min振蕩12 h，然后10 000 r/min離心10 min，0.22 μm有機膜過濾后用HPLC測定平衡液中ALA濃度。根據(jù)式（2）計算ALA-MIPs的單位吸附量Q，并進行Scatchard作圖分析。

式中：Q為ALA-MIPs的單位吸附量/（mg/g）；ρ0為ALA的初始質(zhì)量濃度/（g/L）；ρ為ALA吸附殘液的質(zhì)量濃度/（g/L）；V為ALA溶液的體積/mL；m為ALA-MIPs質(zhì)量/g。

1.3.9 吸附特異性實驗

分別稱取20 mg的ALA-MIPs與NIPs置于25 mL的錐形瓶中，分別加入5 mL ALA、DHLA、PBA乙腈溶液，密封后，將其置于恒溫振蕩器中25 ℃、70 r/min條件下振蕩12 h，然后10 000 r/min離心10 min，0.22 μm有機膜過濾后用HPLC法測定平衡液中ALA的質(zhì)量濃度。根據(jù)式（3）計算印跡因子α值。

式中：QALA-MIPs、QNIPs分別為ALA-MIPs和NIPs對ALA的吸附量/（mg/g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 以NIPAM為功能單體的ALA-MIPs構(gòu)建

在MIPs制備中，依據(jù)功能單體和模板分子間形成加成物的性質(zhì)，分子印跡法分為共價印跡法與非共價印跡法[19]。非共價印跡法反應條件溫和、模板分子選擇范圍廣，且操作簡單，易于實現(xiàn)，因此成為了分子印跡使用最普遍的方法[20]。由于羧基（—COOH）可以作為氫鍵供體和受體與多種模板分子形成氫鍵作用，甲基丙烯酸（2-methylacrylic acid，MAA）成為了在非共價印跡法中最常用的功能單體[21]。為了減小非特異性結(jié)合和背景離子交互作用對MIPs的影響，非共價印跡法引入不可電離的功能單體，如酰胺。

表1 MAA、AAm和NIPAM的介電常數(shù)和偶極矩比較[27]Table 1 Dielectric constants and dipole moments of MAA,AAm and NIPAM[27]

從表1可以看出，丙烯酰胺（acrylamide，AAm）和NIPAM的介電常數(shù)與偶極矩明顯大于MAA，并根據(jù)Hunter[22]計算的酰胺的氫鍵受體值（β＝8.3）大于羧酸的氫鍵受體值（β＝5.3），這說明酰胺能比羧酸與模板分子形成更強的氫鍵。自從Yu Cong等[23-24]首次使用了AAm作為非共價印跡氫鍵結(jié)合功能單體制備MIPs之后，AAm作為功能單體成功印跡了多種模板分子[25]，但是AAm不溶于多數(shù)有機溶劑，印跡需要選擇極性溶劑，而使用極性溶劑會減弱功能單體和模板分子間的氫鍵作用。

與AAm作為非共價印跡法功能單體相比，NIPAM是更好的選擇，因為親脂性的異丙基使得NIPAM溶于大多數(shù)非極性溶劑，并且二級酰胺是比一級酰胺更強的氫鍵受體，酰胺基的O或N原子均能與氫鍵供體形成氫鍵[26]，這表明以NIPAM為功能單體能提高MIPs的識別特性。Nguyen等[25]的研究表明，與AAm和MAA作為功能單體相比，以NIPAM為功能單體制備的MIPs對模板分子具有更好的選擇性能，且能減少非特異性鍵合。因此選擇NIPAM作為實驗制備ALA-MIPs的功能單體，ALA-MIPs的制備過程如圖2所示。

圖2 ALA-MIPs制備示意圖Fig. 2 Schematic representation of ALA-MIPs

2.2 模板分子與功能單體反應位點預測

圖3 NIPAM（a）和ALA（b）的分子靜電勢圖Fig. 3 Molecular electrostatic potential map of NIPAM (a) and ALA (b)

在B3LYP水平下，采用6-31G+（d）基組模擬計算NIPAM與ALA的分子靜電勢，由圖3可知，NIPAM負電荷區(qū)域主要集中在羰基的O原子上，易與親電試劑的反應失去電子；正電荷區(qū)域主要集中在與N原子相連的H原子上，易與親核試劑反應得到電子。因此NIPAM活性位點主要為羰基的O原子和與N原子相連的H原子。同理，ALA中羧基O原子可以作為質(zhì)子受體而失去電子，羥基H原子可作為質(zhì)子給體而得到電子，即ALA活性位點主要為羧基O原子和羥基H原子。

2.3 模板分子與功能單體空間結(jié)構(gòu)優(yōu)化

在MIPs合成過程中，為了形成具較高特異識別性的聚合物，印跡分子與功能單體比例通常大于1，但過量的功能單體會使MIPs的非特異性吸附增大，選擇性降低[28]。

圖4 ALA與NIPAM不同比例復合物優(yōu)化構(gòu)型圖Fig. 4 Models of ALA-NIPAM complexes at different ratios

在B3LYP水平下，采用6-311++（d，p）基組計算ALA與NIPAM在不同比例下的復合物構(gòu)型及氫鍵形成見圖4，可以看出ALA結(jié)構(gòu)中羧基O原子與羥基H原子為反應位點，ALA中羥基H原子作為電子受體與NIPAM中羧基形成氫鍵，ALA中羧基作為電子供體與NIPAM中胺基H原子形成氫鍵，這與分子靜電勢分析結(jié)果一致。氫鍵鍵長因氫鍵強度而不同，由圖4可知，ALA與NIPAM在1∶1比例下分子間鍵長分別為1.710 02 ?（O28…H26—O25）、2.294 17 ?（O24…H32—C31），在1∶2比例下分子間鍵長分別為1.683 10 ?（O28…H26—O25）、2.064 22 ?（N48—H49…O24），與Needham[29]報道的各類氫鍵鍵長相比，形成的復合物分子間鍵長均在氫鍵鍵長范圍內(nèi)，且屬于較強氫鍵。如表2所示，復合物比例1∶2時的結(jié)合能的絕對值比復合物物質(zhì)的量之比為1∶1和1∶3時要大，這是由于1∶2時形成的氫鍵數(shù)目飽和，此時結(jié)合能為-349.32 kJ/mol，這表明復合物比例1∶2時印跡分子與功能單體可望形成更穩(wěn)定的復合物，結(jié)合能的計算與復合物模型通過氫鍵預測復合物穩(wěn)定性結(jié)論一致。

表2 在B3LYP/6-311（d，p）水平下模擬計算的復合物結(jié)合能Table 2 Binding energies of complexes calculated at the B3LYP/6-311(d, p) level

表2 在B3LYP/6-311（d，p）水平下模擬計算的復合物結(jié)合能Table 2 Binding energies of complexes calculated at the B3LYP/6-311(d, p) level

注：—.無結(jié)合能項目。

校正后?E/（kJ/mol）ALA -3.308 8×106 — —NIPAM -9.591 0×105 — —ALA-NIPAM復合物（1∶1） -4.268 2×106 -240.30 -237.86 ALA-NIPAM復合物（1∶2） -5.227 4×106 -349.32 -345.86 ALA-NIPAM復合物（1∶3） -6.186 5×106 -312.12 -306.52分子 E/（kJ/mol） 校正前?E/（kJ/mol）

2.4 ALA-MIPs形貌分析

圖5 NIPs（a）和ALA-MIPs（b）的SEM照片F(xiàn)ig. 5 SEM images of NIPs (a) and ALA-MIPs (b)

MIPs的分散程度、粒徑大小及排列等表面形貌可以使用SEM觀察[30]，圖5為NIPs和ALA-MIPs的SEM照片，可以看出NIPs表面呈現(xiàn)不規(guī)則的、松散的塊狀，有較嚴重的團聚現(xiàn)象；ALA-MIPs表面則呈現(xiàn)相對規(guī)則的多孔狀，可以看出其具有較多的三維空穴，這種三維空穴有利于底物與結(jié)合位點接觸，提高其對印跡分子的結(jié)合量。

2.5 ALA-MIPs紅外光譜分析

利用紅外光譜中紅外吸收帶的波長的變化可以分析MIPs中印跡分子與功能單體結(jié)合過程中基團的變化及結(jié)合位點的位置[31]。ALA結(jié)構(gòu)中特征吸收峰主要是1 690 cm-1處的C＝O伸縮振動和3 000 cm-1左右的-OH伸縮振動，其特征峰除此之外還有在2 700 cm-1左右由伸縮振動和變形振動的倍頻及組合頻引起的吸收峰以及920 cm-1處的彎曲振動吸收峰；而NIPAM的特征峰主要是1 650 cm-1左右二級酰胺中C＝O伸縮振動峰和3 350 cm-1左右N-H的彎曲振動峰。

由圖6可以看出，ALA-MIPs中酰胺的1 650 cm-1處C＝O伸縮振動和3 350 cm-1處N-H彎曲振動明顯減弱，并且羧基中-OH的2 728 cm-1伸縮振動峰幾乎被掩蓋，1 690 cm-1處羧酸C＝O伸縮振動峰向高波數(shù)1 717 cm-1處移動，這說明ALA羧基中-OH和NIPAM中酰胺的N-H的特征吸收光譜受到屏蔽，即制備得到的固體ALA-MIPs中ALA與NIPAM結(jié)合位點形成，結(jié)果與ALA和NIPAM自組裝體系理論分析一致。

圖6 ALA、NIPAM和ALA-MIPs的FT-IR譜圖Fig. 6 FT-IR spectra of ALA, NIPAM and ALA-MIPs

2.6 ALA-MIPs吸附性研究

2.6.1 等溫吸附性能

圖7 ALA-MIPs和NIPs的等溫吸附曲線Fig. 7 Adsorption isotherms of ALA-MIPs and NIPs

通過靜態(tài)平衡吸附法得到ALA在20～160 mg/L范圍內(nèi)的等溫吸附線如圖7所示，可以看出在ALA初始質(zhì)量濃度低于120 mg/L時，ALA-MIPs的等溫吸附曲線呈直線上升趨勢，對ALA的吸附量（Q）增加較快，之后ALA-MIPs對ALA的吸附量增加緩慢，這說明ALA-MIPs中對ALA的結(jié)合位點基本達到吸附飽和。而NIPs的等溫吸附曲線在ALA初始質(zhì)量濃度低于100 mg/L時，對ALA的吸附量增加較快，之后NIPs對ALA的吸附量趨近平衡，當吸附量趨近平衡，NIPs的吸附容量比ALA-MIPs小。

在MIPs的吸附性能研究中經(jīng)常使用Scatchard模型（式（4））來評價MIPs對模板分子的結(jié)合特性[32]。

式中：Q為各濃度下的平衡吸附量/（mg/g）；Qmax為飽和吸附量/（mg/g）；ρ為ALA平衡質(zhì)量濃度/（g/L）；Kd為平衡解離常數(shù)/（mol/L）。

圖8 ALA-MIPs和NIPs對ALA的等溫吸附Scatchard分析圖Fig. 8 Scatchard plot analysis of the binding of ALA to ALA-MIPs and NIPs

Scatchard作圖法進行分析，以Q/ρ對Q作圖（圖8），可以看出NIPs的吸附結(jié)合位點呈線性關(guān)系，可以用一條直線進行較好的擬合，說明NIPs對ALA的結(jié)合只存在一類結(jié)合位點；而ALA-MIPs的吸附結(jié)合位點呈非線性關(guān)系的，可以由兩條直線進行較好的擬合，這說明ALAMIPs中存在兩類不同的結(jié)合位點，即高親和力位點和低親和力位點，這是因為ALA-MIPs中模板分子與功能單體的自組裝過程中存在兩類不同的結(jié)合方式，因此形成兩類不同親和力的結(jié)合位點[33]，這與理論計算得到模板分子與功能單體自組裝可以形成兩種不同比例的復合物的結(jié)論一致。分別從圖8中兩段線性部分擬合方程的斜率和截距可以得出，ALA-MIPs的高親和力位點平衡解離常數(shù)和最大吸附量分別為6.969 7×10-5mol/L、12.145 mg/g；低親和力位點平衡解離常數(shù)和最大吸附量分別為1.558 5×10-5mol/L、104.06 mg/g。

2.6.2 吸附特異性分析

圖9 ALA-MIPs和NIPs對ALA及其類似物的飽和吸附量Fig. 9 Adsorption of ALA-MIPs and NIPs for ALA and analogues

如圖9所示，ALA-MIPs對模板ALA吸附量較高，而對DHLA、PBA的吸附量明顯較ALA的吸附量低，比NIPs的吸附量大，這主要是因為盡管ALA、DHLA和PBA分子均含有能與功能單體酰胺基團的氧原子或氫原子形成氫鍵的羧基，但由于MIPs印跡孔穴的空間位阻的存在，使得ALA結(jié)構(gòu)類似物不能像ALA一樣，與印跡孔穴中特定的空間結(jié)合位點形成較強的作用力，這表明ALA-MIPs對ALA的吸附具有特異選擇性。

MIPs的特異選擇性一般用印跡因子α表示[34]，α值越大說明特異性越強，印跡效果越好，根據(jù)式（2）計算得ALA、DHLA和PBA的α值分別為2.017、1.207和1.119。從α值也可以看出，實驗制備的ALA-MIPs具有較好選擇性，在一定范圍內(nèi)可以對ALA選擇性吸附。

3 結(jié) 論

利用密度泛函理論在B3LYP水平下模擬計算了模板分子ALA與功能單體NIPAM形成復合物的構(gòu)型和成鍵情況，優(yōu)化了功能單體NIPAM與模板分子ALA間的印跡比例，以理論計算優(yōu)化的印跡比例制備了ALA-MIPs，并對ALA-MIPs進行了微觀形貌、結(jié)構(gòu)和吸附性研究，結(jié)果有望為分子印跡技術(shù)在天然抗氧化劑硫辛酸的富集和分離方法中的應用提供理論依據(jù)。

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