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    欽州灣7種經(jīng)濟(jì)貝類中麻痹性貝類毒素分析與安全評(píng)價(jià)

    2018-06-19 02:24:38戴梓茹郭偉張晨曉王培黃鎂李晨曦
    食品研究與開(kāi)發(fā) 2018年12期
    關(guān)鍵詞:毛蚶欽州貝類

    戴梓茹,郭偉,張晨曉,王培,黃鎂,李晨曦

    (1.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西欽州535011;2.欽州學(xué)院食品工程學(xué)院,廣西欽州535011;3.欽州市食品藥品檢驗(yàn)所,廣西欽州535011)

    近年來(lái),沿海城市工業(yè)廢水和生活污水大量排放到海水中,以及近岸海域的海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)本身的污染問(wèn)題,導(dǎo)致海水污染和海水富營(yíng)養(yǎng)化日趨嚴(yán)重。近年來(lái)由于有害赤潮迅速增殖泛濫,赤潮災(zāi)害屢屢發(fā)生,自90年代以后,每年達(dá)到40次~50次[1]。2013年,全國(guó)發(fā)生赤潮46次,其中南海發(fā)生6次[2]。我國(guó)近岸海域普遍發(fā)生的赤潮嚴(yán)重破壞了海洋生態(tài)環(huán)境,給海洋漁業(yè)資源和水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。其中部分有害赤潮能夠產(chǎn)生藻毒素,雙殼貝類是我國(guó)近海重要的養(yǎng)殖動(dòng)物,海洋微藻是貝類的主要食物來(lái)源,能夠產(chǎn)生藻毒素的有毒藻種亦可為貝類濾食,導(dǎo)致貝類染毒,甚至危及消費(fèi)者健康和生命安全[3]。

    最初根據(jù)藻毒素傳遞的中間媒介生物和致毒癥狀,可將主要藻毒素分為神經(jīng)性貝類毒素(neurotoxic shellfish toxins,NSTs)、麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish toxins,PSTs)、記憶缺失性貝類毒素(amnesic shellfish toxins,ASTs)、腹瀉性貝類毒素(diarrhetic shellfish toxins,DSTs) 和西加魚毒素 (ciguatera fish toxins,CFTs)等[4]。當(dāng)人們誤食染毒的貝類后就會(huì)造成中毒,甚至死亡,且無(wú)特效解救藥物。1976年,日本報(bào)道了首例腹瀉型貝毒中毒事件,1981年西班牙有5 000人中麻痹性貝毒,1993年菲律賓有300人中麻痹性貝毒[5]。近年來(lái),我國(guó)沿海部分海區(qū)的貝類普遍受到貝類毒素的污染。2011年,在福建寧德和浙江寧波兩地發(fā)生了因食用被腹瀉性貝毒沾染的紫貽貝引起的中毒事件,中毒人數(shù)多達(dá)200人[6]。2017年6月,由于受到赤潮影響,福建漳州36人因食用受麻痹性貝毒污染的貝類出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀。廣西北海也發(fā)生過(guò)因食用染毒貝類而引起的多人中毒或死亡事件[7]。

    麻痹性貝類毒素(Paralytic Shellfish toxins,PSTs)是一類以石房蛤毒素(saxitoxin,STX)為骨架的四氫嘌呤類衍生物,主要來(lái)源于海洋的甲藻類、細(xì)菌等,具有分布最廣、危害最大的特點(diǎn)[8-11]。目前已知結(jié)構(gòu)的麻痹性貝類毒素約有57種[12],包括氨基甲酸酯類毒素(carbamate toxins);脫氨甲?;惗舅兀╠ecarbamoly toxins);N-磺酰氨甲?;惗舅兀∟-sulfo-carbamoyl toxins);脫氧脫氨甲?;惗舅兀╠eoxydecarbamoyl toxins);N-羥基衍生物等。其致毒機(jī)理與河豚毒素(tetro dotoxin,TTX)相似,是一種神經(jīng)肌肉麻痹劑,麻痹性貝類毒素致毒作用機(jī)制是作用于肌肉、神經(jīng)細(xì)胞鈉離子通道,阻斷電壓門控鈉離子內(nèi)流,無(wú)法形成正常動(dòng)作電位造成神經(jīng)系統(tǒng)傳輸障礙,從而對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生麻痹作用。人們誤食了含有此類毒素的貝類而產(chǎn)生的嘴唇麻木感、頭疼、惡心、嘔吐,隨之出現(xiàn)四肢麻木、呼吸困難等癥狀,有時(shí)出現(xiàn)短暫失明,過(guò)量攝入者則會(huì)身體癱瘓,因窒息而亡[13]。歐盟規(guī)定它的食品安全標(biāo)準(zhǔn)為每 100 g貝類鮮肉 80 μg石房蛤毒素(或等價(jià))(80 μg/100 g STXeq)[14-15]。

    目前,我國(guó)對(duì)貝類麻痹性貝類毒素的研究報(bào)道多集中在北黃海、渤海和東海海域,對(duì)廣西海域,特別是欽州灣海域貝類中麻痹性貝類毒素的研究報(bào)道較少。本文通過(guò)小鼠生物法和液相色譜-熒光檢測(cè)法,分析了從廣西欽州灣近岸海域采集的具有代表性的經(jīng)濟(jì)貝類中麻痹性貝類毒素組成成分和含量,同時(shí)根據(jù)我國(guó)漁政漁港監(jiān)督管理局制訂的貝類安全食用標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)其食用安全性,以期為欽州灣海域貝類食品的安全性評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),也為該海域貝類中毒素問(wèn)題監(jiān)管提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 貝類采集

    2015年9月于欽州灣采集7種經(jīng)濟(jì)貝類(表1)。樣本采集后迅速送到北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分析實(shí)驗(yàn)室,洗凈貝殼,切斷閉殼肌開(kāi)殼,淋洗貝類內(nèi)部去除泥沙等雜質(zhì),取出貝肉后瀝干水分,保存在-20℃低溫冰箱中,備用。

    表1 采于廣西欽州灣的7種貝類Table 1 Basic information of shellfish samples

    1.2 分析方法

    1.2.1 小鼠生物法

    按照GB 5009.213-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)貝類中麻痹性貝類毒素的測(cè)定》[16]檢測(cè)樣品中麻痹性貝類毒素的含量。

    原理:根據(jù)小鼠注射貝類提取液后的死亡時(shí)間,查出鼠單位,并按小鼠體重,校正鼠單位,計(jì)算確定每100 g貝肉內(nèi)麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish poison,PSP)微克數(shù)。其中,鼠單位:對(duì)體重為20 g的ICR雄性小鼠腹腔注射1 mL麻痹性貝類毒素提取液,使其在15 min內(nèi)死亡所需的最小毒素量。

    1.2.2 液相色譜-熒光檢測(cè)法

    按照GB 5009.213-2016的方法檢測(cè)7種經(jīng)濟(jì)貝類樣品中的麻痹性貝類毒素含量(液相色譜-熒光檢測(cè)法)。貝類組織中毒素提取方法和檢測(cè)方法參照[17-18]。

    毒素提取流程:將冷凍的貝類組織在室溫下進(jìn)行解凍后,進(jìn)行組織的粗勻漿、細(xì)勻漿。取約5 g細(xì)勻漿均勻貝組織,置于50 mL聚丙烯離心管中,加入5 mL 0.1 mol/L HCl溶液,使用旋轉(zhuǎn)震蕩器進(jìn)行震蕩混合,使貝組織和稀鹽酸溶液充分混勻,后用pH試紙(0~14)檢測(cè)混合液的pH值,使其保持在2.0~4.0之間,若不在此范圍內(nèi),用5 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)。將調(diào)好pH值的樣品置于水浴鍋中煮沸約5分鐘后,取出待降至室溫后,再次使用5 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調(diào)pH值在2.0~4.0之間。將離心管置于高速離心機(jī)中,8 000 r/min離心10 min后,取上清液1 000 μL加入到1.5 mL離心管中,加入50 μL 30%三氯乙酸,充分震蕩混勻后,再加入70 μL 1.0 mol/L NaOH溶液,調(diào)整pH值到2.0~4.0之間,再次充分震蕩混勻后,置于離心機(jī)中12 000 r/min離心10 min,取上清液經(jīng)孔徑0.22 μm水性針式濾膜過(guò)濾。

    毒素檢測(cè)方法:GTX-STX類毒素的分析采用反相色譜柱(Aglient,Zorbax Bonus RP,3.5 μm,150 mm×4.6 mm)進(jìn)行毒素分離,使用兩相洗脫液洗脫。流動(dòng)相A為5.5 mmol/L磷酸緩沖液,含8.0 mmol/L庚基磺酸鈉,pH 7.10;流動(dòng)相B為16.5 mmol/L磷酸緩沖液,含8.0 mmol/L庚基磺酸鈉和11.5%乙腈,pH 7.10;C類毒素采用反相色譜柱(Phenomenex,Synergi Hydro-RP,4 μm,150×4.6 mm)進(jìn)行分離,使用兩相洗脫液洗脫。洗脫液A為1%氨水溶液,含3 mmol/L磷酸四丁基氨,pH 5.8;洗脫液B為1%氨水溶液,含3 mmol/L磷酸四丁基氨和4%乙腈,pH 5.8。柱后衍生系統(tǒng)采用氧化劑(5 mmol/L 高碘酸,100 mmol/L H3PO4,pH 7.8)和酸化劑(0.75 mol/L HNO3溶液),柱后衍生反應(yīng)溫度設(shè)為85℃,氧化劑和酸化劑流速均為0.4 mL/min。毒素衍生產(chǎn)物檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為330 nm和390 nm。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 小鼠生物法

    對(duì)試驗(yàn)小鼠進(jìn)行腹腔注射1 mL的麻痹性貝類毒素的提取液或空白對(duì)照液,結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組中所有小鼠在觀察15 min內(nèi)均不死亡,可以確定欽州灣7種經(jīng)濟(jì)貝類樣品的鼠單位小于400 MU/100 g。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 采用小鼠生物法分析7種貝類中麻痹性貝類毒素Table 2 PSTs in 7 species of economic shellfish by biological method

    采集于欽州灣的7種經(jīng)濟(jì)貝類中麻痹性貝類毒素含量均小于400 MU/100 g,根據(jù)我國(guó)漁政漁港監(jiān)督管理局制定的貝類安全食用標(biāo)準(zhǔn)(80 μg/100 g STXeq或400 MU/100 g)和聯(lián)合國(guó)衛(wèi)生組織規(guī)定可食貝類的麻痹性貝類毒素限量80 μg/100 g STXeq[19]的相關(guān)規(guī)定表明,用小鼠生物法檢測(cè)出的7種經(jīng)濟(jì)性貝類中麻痹性貝類毒素的含量沒(méi)有超過(guò)安全食用的標(biāo)準(zhǔn),可以放心食用。

    2.2 高效液相色譜-熒光檢測(cè)法

    采用高效液相色譜-熒光法檢測(cè)7種經(jīng)濟(jì)貝類的麻痹性貝類毒素含量見(jiàn)表3。

    如表3所示,采用液相色譜-熒光檢測(cè)法檢測(cè)了7種貝類中 12種麻痹性貝類毒素(C1、C2、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、dcSTX、NEO、STX)。其中 7 種貝類中檢出了 GTX1、GTX4、NEO、STX這4種毒素,含量分別是0.02 nmol/g~0.27 nmol/g、0.02 nmol/g~0.27 nmol/g、0.12 nmol/g、0.05 nmol/g,其余6種毒素沒(méi)有檢出。GTX4的檢出率最高,為86%,其次是GTX1,43%。NEO、STX的檢出率均為14%(檢出率計(jì)算方法為:每種毒素類型檢出毒素的個(gè)數(shù)/7種經(jīng)濟(jì)貝類數(shù)量)。

    表3 采用高效液相色譜-熒光法檢測(cè)7種經(jīng)濟(jì)貝類的麻痹性貝類毒素含量Table 3 Content of paralytic shellfish poison(PSP)in 7 species of economic shellfish by HPLC-FD

    檢出的4種貝類毒素單位由nmol/g轉(zhuǎn)換為μg/100 g,如表4所示。

    表4 7種經(jīng)濟(jì)貝類的麻痹性貝類毒素含量Table 4 Content of PSTs in 7 species of economic shellfish

    經(jīng)過(guò)單位轉(zhuǎn)化后的毒素含量分別為0.8μg/100 g~11.1 μg/100 g、0.8μg/100 g~11.1 μg/100 g、3.8 μg/100 g、1.5 μg/100 g。就NEO和STX毒素而言,7種經(jīng)濟(jì)貝類中就只有異毛蚶檢測(cè)出STX、NEO,這說(shuō)明異毛蚶攝食的藻類和有機(jī)碎屑具有一定的污染。就GTX1毒素而言,雙線紫蛤是7種貝類中檢出毒素含量最高的,其次是櫛江瑤和牡蠣,含量均為0.8 μg/100 g;就GTX4毒素而言,異毛蚶是檢測(cè)7種貝類樣品中毒素含量最高的,含量為 11.1 μg/100 g。

    根據(jù)GB 5009.213-2016中4種毒素的毒性因子,計(jì)算出各貝類的總毒素,如表5。就總毒性而言,異毛蚶的總毒性是7種經(jīng)濟(jì)貝類中最高的,含量為13.1 μg/100 g,其次是雙線紫蛤(12.8 μg/100 g),縊蟶總毒素為0,累積在體內(nèi)的麻痹性貝類毒素的含量較低,食用安全性系數(shù)高。

    根據(jù)聯(lián)合國(guó)衛(wèi)生組織規(guī)定,可食貝類的麻痹性貝類毒素限量 80 μg/100 g STXeq(80 μg/100 g),如表 5所示。

    表5 7種經(jīng)濟(jì)貝類的麻痹性貝類毒素總毒性含量Table 5 Content of total toxicity PSTs in 7 species of economic shellfish

    對(duì)比本次檢測(cè)結(jié)果可以看出異毛蚶的總毒素含量均為13.1 μg/100 g,是所檢樣本中毒素含量最高的,但其含量仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于可食用的貝類麻痹性貝類毒素安全限量80 μg/100 g,因此判定從欽州灣采集的這7種經(jīng)濟(jì)貝類所含有的PSTs含量在我國(guó)安全食用的限量范圍內(nèi),這說(shuō)明欽州灣近岸海域的貝類等生物在一定程度上受有毒藻種威脅,應(yīng)加強(qiáng)重點(diǎn)經(jīng)濟(jì)型貝類中藻毒素的監(jiān)測(cè)。

    3 討論

    欽州灣位于廣西壯族自治區(qū)北部灣最北部,分為內(nèi)灣、灣頸和外灣3部分。環(huán)欽州灣沿海水體較淺,灘涂面積廣闊,是重要的貝類養(yǎng)殖區(qū),特別是以牡蠣等貝類養(yǎng)殖為龍頭的海洋產(chǎn)業(yè)現(xiàn)已形成了連片養(yǎng)殖格局[20]。近年來(lái),隨著廣西北部灣經(jīng)濟(jì)區(qū)的加速建設(shè),沿岸生態(tài)環(huán)境受人類活動(dòng)影響日益加劇,大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被附近有多條江河攜帶直接匯入該海域,導(dǎo)致該海域富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題不斷加劇[21],存在有害赤潮發(fā)生的潛在可能,這給欽州灣海域貝類養(yǎng)殖業(yè)及海產(chǎn)品的食品安全造成了較大風(fēng)險(xiǎn)。麻痹性貝毒毒素來(lái)源于有毒甲藻已是共識(shí)[22],欽州灣海域存在塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)和鏈狀裸甲藻(Gymnodinium catenatum)等產(chǎn)麻痹性貝毒毒素的有毒藻類[23],這給該海域的貝類帶來(lái)了沾染麻痹性貝類毒素的風(fēng)險(xiǎn)。

    采用生物法和化學(xué)分析法分別對(duì)欽州灣具有代表性貝類進(jìn)行麻痹性貝類毒素的檢測(cè),結(jié)果表明化學(xué)分析法能夠準(zhǔn)確定性、定量的貝組織中毒素組成和含量,而小鼠生物法由于較高的檢出限,不能準(zhǔn)確反映貝類沾染藻毒素狀況。應(yīng)用高效液相色譜方法,對(duì)在欽州灣沿岸海域采集多種經(jīng)濟(jì)型貝類樣品進(jìn)行了分析,蚶類異毛蚶、蛤類雙線紫蛤是該海域最容易累積麻痹性貝類毒素的貝類,毒素含量最高,而華貴類櫛孔扇貝、櫛江瑤、麗文蛤和牡蠣含量相對(duì)較低,縊蟶沒(méi)有檢測(cè)到毒素。研究發(fā)現(xiàn)蚶類比其它種類的貝類更容易累積型毒素,在以往調(diào)查中,毛蚶中也常常檢出麻痹性貝毒毒素[17],毛蚶作為一種底棲型貝類,其體內(nèi)的毒素是源于水體中的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞還是沉積物中的甲藻孢囊,特別令人關(guān)注。前人研究結(jié)果表明,有毒甲藻孢囊廣泛分布于南海海域[24],在廣西沿岸海域(防城港和北海港)存在塔瑪亞歷山大藻、微小亞歷山大藻和鏈狀裸甲藻的孢囊[25],這有可能成為毛蚶等底棲貝類中麻痹性貝毒毒素的來(lái)源。研究發(fā)現(xiàn),欽州灣采集的貝類中麻痹性貝類毒素成分以高毒性的氨基甲酸酯類毒素GTX4、GTX1、NEO和STX為主。而分布于中國(guó)近海海域的塔瑪亞歷山大藻復(fù)合種的毒素成分C1、C2、GTX2、GTX3、GTX5、NEO 和 STX,其中 C1、C2 是最主要的毒素類型[22,26],這說(shuō)明麻痹性貝類毒素在貝類組織中可能發(fā)生了轉(zhuǎn)化[17,26]。

    通過(guò)采用小鼠生物法和液相色譜-熒光檢測(cè)法檢測(cè)分析欽州灣7種經(jīng)濟(jì)貝類中的麻痹性貝類毒素,研究結(jié)果表明:1)小鼠生物法不能很好的反映貝類沾染藻毒素的情況,高效液相色譜-熒光法能夠很好定性、定量貝類中麻痹性貝類毒素的成分和含量;2)7種貝類中異毛蚶中有最大毒素含量/毒性值,分別為0.27 nmol/g或13μg/100g STXeq,說(shuō)明蚶類較其他所調(diào)查的貝類更容易累積麻痹性貝類毒素;3)欽州灣貝類中麻痹性貝類毒素組成以高毒性的GTX1、GTX4、NEO和STX為主。盡管本研究所檢測(cè)的7種貝類中毒素含量遠(yuǎn)低于我國(guó)漁政漁港監(jiān)督管理局制定的貝類安全食用標(biāo)準(zhǔn)和聯(lián)合國(guó)衛(wèi)生組織規(guī)定的80 μg/100 g STXeq,但毒素檢出率高達(dá)86%,因此需加強(qiáng)該海域貝類中藻毒素檢測(cè),這對(duì)保證海洋食品的安全具有重要的意義。

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